CC BY
33
УДК 577.153:612.017.33:612.112.94
С.Г. Кадричева, л.А. Савченко
ВЗАИМОСВЯЗЬ АКТИВНОСТИ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭСТЕРАЗЫ ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН С ГОРМОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ И ФЕНОТИПИЧЕСКИМ СОСТАВОМ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ
НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск)
С помощью метода компьютерной морфоденситометрии исследована активность неспецифической эстеразы. (НЭ) в лимфоцитах крови, у здоровых женщин. Метод позволил количественно охарактеризовать активность фермента в двух популяциях клеток: с локальной и диффузной цитохимической окраской на a-нафтилбутират. Установлено, что в лимфоцитах с диффузным, распределением. по сравнению с популяцией, клеток с локальным, распределением, активности НЭ, ниже синтез фермента и. его активность. С помощью корреляционного анализа исследованы взаимосвязи между параметрами активности НЭ в лимфоцитах с локальным, диффузным, характером окраски, и. показателями клеточного иммунитета. Анализ полученных результатов продемонстрировал связь принадлежности. клетки к той или. иной популяции, субпопуляции с активностью НЭ, но не с типом реакции (локальная, диффузная или. отрицательная). В тоже время корреляционный, анализ выявил взаимосвязанность уровней кортизола и. тироксина как с активностью НЭ, так и. типом, цитохимической. реакции в лимфоцитах.
Ключевые слова: неспецифическая эстераза, лимфоциты, популяционный и субпопуляционный состав, гормональная регуляция
INTERRELATION OF ACTIVITY OF LYMPHOCYTES NON-SPECIFIC ESTERASE AND HORMONAL STATUS AND PHENOTYPIC CONTENTS OF BLOOD LYMPHOCYTES IN HEALTHY WOMEN
S.G. Kadricheva, A.A. Savchenko
Scientific Institute of Northern Problems SB RAMS, Krasnoyarsk
By the computer morphodensitometry technique we studied, the activity of non-specific esterase (NE) in blood lymphocytes in healthy females. The method, allows to characterize in the terms of quantity the activity of enzyme in two populations of cells: one with, local and another with, diffuse cytochemical coloring for a-naphtyl butirate. We found lower synthesis of enzyme and. its activity in lymphocytes with, diffuse distribution, as compared, to the population, of cells with, local distribution, of NE activity. By correlation analysis we studied, interconnections between the parameters of NE activity in lymphocytes with, local, diffuse character of coloring and. indices of cell immunity. The analysis of the results shows the connection between the belonging of a cell to this or that population or subpopulation and NE activity, but not with the type of reaction (local, diffuse or negative). At the same time correlation analysis revealed, interconnection, between the levels of cortisol and. thyroxin with NE activity and. the type of cytochemical reaction in lymphocytes.
Key words: non-specific esterase, lymphocytes, population or subpopulation composition, endocrine control
Биохимия эстераз очень сложна, но в цитохимии термином «неспецифическая эстераза» обычно обозначают ферменты, способные гидролизовать простые эфиры ^свободных спиртов и органических кислот. Неспецифические эстеразы (НЭ) являются лизосомальными ферментами. Эстеразы могут осуществлять различные функции в разных типах лейкоцитарных клеток. В гранулоцитах НЭ обеспечивают протеолитическую и переваривающую функцию нейтрофилов. Эстеразная активность моноцитов может отражать физиологическую или иммунологическую стимуляцию, ведущую к их созреванию и превращению в макрофаги. Эс-
теразная активность Т-лимфоцитов имеет отношение к киллерной функции Т-клеток [10].
До сих пор обсуждается возможность использования ферментативной реакции a-нафтилбути-ратэстеразной реакции для дифференциации морфологических вариантов лимфоцитов [7, 12, 13]. Предполагается, что лимфоциты с локальным распределением активности НЭ (рис. 1А) относятся к субпопуляции Т-хелперов, лимфоциты с отрицательной реакцией на НЭ являются В-лимфоцита-ми, все остальные популяции и субпопуляции лимфоцитов прокрашиваются с диффузным распределением активности НЭ по клетке (рис. 1Б).
НЭ участвуют в катаболизме липидов, ускоряя гидролитическое расщепление простых эфиров до органических кислоты и спиртов [5, 10]. Скорость расщепления липидов регулируется симпатическим, парасимпатическим отделами центральной нервной системы и эндокринной системой. В независимости от характера влияния различных эндо-, экзогенных факторов и механизмов их действия, эффекторным звеном выражения их действия являются ферменты, участвующие в липидном обмене [1]. Так уровни активностей ферментов липидного обмена, в том числе и НЭ, определяются не только типом клетки, но медиаторным и гормональным состоянием.
Целью исследования явилось выявление особенностей взаимосвязей морфоденситометричес-ких параметров активности НЭ лимфоцитов у здоровых женщин с гормональным статусом и фенотипическим составом иммунокомпетентных клеток.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обследовано 55 относительно здоровых женщин в возрасте 20 — 45 лет.
Для определения активности НЭ в лимфоцитах крови человека применялся модифицированный метод Higgy, Burns, Hayhoe (1977) [10].
Для оценки активности НЭ применяется метод компьютерной морфоденситометрии с применением установки «ДиаМорф» (Москва) [3, 4, 6, 8, 11]. Программа «Cito» измеряет следующие параметры: суммарная площадь всех гранул в 1 клетке (S, мкм2), суммарный периметр всех гранул в 1 клетке (P, мкм), фактор формы (FF, о.е.), средняя оптическая плотность гранул (OD, е.о.п.), усредненные (на 1 клетку) расстояния между гранулами по осям Х и Y (Rx и Ry, мкм), интегральная оптическая плотность (IOD, пиксель2 х е.о.п.).
Популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов крови оценивали с помощью метода непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии с использованием моноклональных антител к CD3, CD4, CD8, CD16, CD72, HLA-DR клеткам (ТОО
«Сорбент», Москва). Содержание общего и свободного тироксина (Т4 и сТ4, соответственно), кортизола в крови определялось радиоиммунологически-ми методами с использованием тест-наборов производства «1шшипо1есЬ» (Чешская Республика).
Для всех полученных данных определяли среднее арифметическое значение (X) и ошибку средней арифметической (т). Проверку гипотезы о статистически достоверном различии двух выборок проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни с помощью пакета прикладных программ 8Р88 8.0. Для исследования силы взаимосвязей показателей вычислялся коэффициент корреляции по Пирсону.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Обнаружено, что 12,0 ± 1,3 % лимфоцитов крови здоровых женщин содержат локализованную окраску на НЭ, то есть 1—2 крупные, близко расположенные гранулы (рис. 1А), в то время как 36,2 ± 1,9 % — диффузную (рис. 1Б) и 50,7 ± 2,6 % иммунокомпетен-тных клеток реагируют отрицательно.
Морфоденситометрически активность НЭ характеризуется геометрическими параметрами (площадь, периметр, фактор формы гранул и усредненные расстояния между гранулами по осям X и У), денситометрическим показателем (оптическая плотность) и их интегральным выражением — интегральная оптическая плотность гранул, образованных в ходе ферментативной реакции.
Морфоденситометрические параметры цитохимических гранул, образованных в ходе ферментативной реакции НЭ, в лимфоцитах крови здоровых женщин с локальным и диффузным распределением активности представлены в табл. 1. Обнаружено, что в лимфоцитах здоровых женщин с диффузным распределением активности НЭ по сравнению с клетками с локальным распределением активности фермента ниже площадь, периметр, оптическая плотность, и как следствие, — интегральная оптическая плотность цитохимических гранул. Кроме того, в иммунокомпетентных клетках здоровых женщин с диффузным распределением активности НЭ, от-
Рис. 1. Видеоархивы лимфоцитов с локальным (А) и диффузным (Б) распределением активности НЭ (Компьютерное изображение. Увеличение микроскопа об. х 100, оп. х 2,5. Программное увеличение в 6 раз).
носительно лимфоцитов с локальным распределением активности выше фактор формы цитохимических гранул, а расстояние по оси У — ниже.
Площадь и периметр гранул продукта реакции количественно характеризуют фермент, по оптической плотности можно судить об уровне активности. Следовательно, интегральная оптическая плотность наиболее полно характеризует общую активность НЭ в клетке. Так как НЭ является ли-зосомальным ферментом, то усредненные расстояния между гранулами позволяют характеризовать как внутриклеточное расположение данных органелл, так и их количество. Отражением одиночного расположения гранул продукта реакции в клетке является значение фактора формы близкое или равное 1 (1 соответствует форме круга). Образование конгломератов гранул, имеющих, как правило, неправильную форму, характеризуется снижением значения фактора формы.
Меньшая интегральная оптическая плотность гранул продукта реакции в лимфоцитах с диффузным распределением активности НЭ, по сравнению с иммунокомпетентными клетками с локальным распределением, определяется достоверно меньшими геометрическими характеристиками (площадь и периметр гранул) и денситометричес-кого параметра (средняя оптическая плотность). В то же время, меньшее усредненное расстояние между гранулами по оси У, а также более высокий фактор формы отражает сниженную конгломерацию гранул продукта реакции и более плотное их распределение в иммунокомпетентных клетках здоровых женщин с диффузным распределением активности, относительно лимфоцитов с локальным. Таким образом, обнаруженные отличия мор-фоденситометрических параметров активности НЭ указывают на то, что в лимфоцитах здоровых женщин с диффузным распределением по сравнению с популяцией клеток с локальным распределением, ниже синтез фермента, сопровождающийся меньшей его активностью.
Полученные значения показателей клеточного и гуморального иммунитета здоровых женщин укладываются в показатели нормы [9].
С помощью корреляционного анализа обнаружены следующие взаимосвязи между морфоденси-
тометрическими параметрами активности НЭ в лимфоцитах с локальным характером окраски и показателями клеточного иммунитета: периметр и фактор формы с относительным содержанием С03 + -лимфоцитов (г = 0,32, Р < 0,05 и г = —0,36, Р < 0,05, соответственно); усредненное расстояние по оси Х с абсолютным количеством СЭ72 + -клеток (г = —0,32, Р < 0,05), относительным и абсолютным содержанием ИЬА-ЭК+-лимфоцитов (г = —0,36, Р < 0,05 и г = —0,38, Р < 0,05, соответственно); усредненное расстояние по оси У с относительным числом СЭ3 + -клеток (г = 0,39, Р < 0,01), абсолютным количеством СЭ72 + -лимфоцитов (г = —0,40, Р < 0,01), относительным и абсолютным содержанием ИЬА-ОЯ + -клеток (г = —0,40, Р <0,01 и г = —0,52, Р < 0,001, соответственно).
Также обнаружены взаимосвязи морфоденсито-метрических параметров активности НЭ в лимфоцитах с диффузной окраской и показателями иммунного статуса здоровых женщин: площадь цитохимических гранул с относительным и абсолютным содержанием ИЬА-ОЯ + -клеток (г = —0,28, Р <0,05 и г = —0,32, Р < 0,05, соответственно); периметр гранул с относительным и абсолютным количеством ИЬА-ОЯ+-клеток (г = —0,28, Р < 0,05 и г = —0,34, Р< 0,05, соответственно); усредненное расстояние по оси Х между гранулами с абсолютным содержанием ИЬА-ОЯ+-клеток (г = — 0,30, Р < 0,05); усредненное расстояние по оси У между гранулами с относительной концентрацией СШ6 + -клеток (г = —0,28, Р < 0,05); интегральная оптическая плотность гранул продукта реакции НЭ с относительным и абсолютным содержанием С03+-клеток (г = 0,33, Р < 0,05 и г = 0,33, Р < 0,05, соответственно). Между тем, не выявлено статистически достоверных корреляционных связей между показателями иммунного статуса и количеством лимфоцитов с локальной, диффузной и отрицательной окраской на НЭ. К тому же подавляющее количество выявленных взаимосвязей отражают связь параметров активности НЭ с относительным и абсолютным количеством ИЬА-ОЯ-позитивных лимфоцитов. В то же время известно, что ИЬА-ОЯ — рецептор поздней активации и, следовательно, активность НЭ связана с активацией клетки.
Значения концентраций Т4, сТ4 и кортизола укладываются в пределы нормы [2].
Таблица 1
Морфоденситометрические параметры активности НЭ в лимфоцитах крови здоровых лиц (X ± m)
Параметр Лимфоциты с локальным распределением активности N = 49 Лимфоциты с диффузным распределением активности N = 55 Р
в, (мкм2) 0,78 ± 0,07 0,43 ± 0,03 Р < 0,001
Р, (мкм) 4,77 ± 0,37 2,57 ± 0,14 Р < 0,001
РР, (о.е.) 0,85 ± 0,02 0,94 ± 0,01 Р < 0,001
ОЭ, (е.о.п.) 15,93 ± 0,28 12,1 ± 0,32 Р < 0,001
Кж, (мкм) 0,60 ± 0,08 0,50 ± 0,07
Ку, (мкм) 0,69 ± 0,09 0,49 ± 0,07 0,1 > Р > 0,05
1ОЭ, (пиксель2 х е.о.п.) 1402,18 ± 115,83 744,57 ± 48,05 Р < 0,001
По результатам корреляционного анализа выявлены взаимосвязи между концентрацией кортизола и параметрами активности НЭ в лимфоцитах с локальной окраской: площадью, периметром и интегральной оптической плотностью (г = 0,81, Р < 0,001; г = 0,80, Р < 0,001 и г = 0,77, Р < 0,001, соответственно); фактором формы, усредненным расстоянием между гранулами по осям Х и У (г = —0,81, Р < 0,001; г = 0,56, Р < 0,05 и г = 0,79, Р < 0,001, соответственно).
Также обнаружены корреляционные связи уровня кортизола и параметрами активности НЭ в лимфоцитах диффузной реакцией НЭ: оптической плотностью и интегральной оптической плотностью (г = 0,54, Р < 0,05, г = 0,66, Р < 0,01, соответственно).
К тому же выявлены взаимосвязи концентрации Т4 с относительным количеством лимфоцитов с диффузной активностью НЭ (г = 0,50, Р < 0,05), с интегральной оптической плотностью гранул продукта реакции в этих клетках (г = —0,44, Р < 0,05). Также обнаружены корреляционные связи уровня сТ4 с относительным количеством лимфоцитов с диффузной и отрицательной реакцией НЭ (г = —0,47, Р < 0,05; г = 0,49, Р < 0,05, соответственно). Следовательно гормон стресса — кортизол определяет активность НЭ в лимфоцитах с различным характером окраски на фермент, а катаболический гормон — тироксин участвует как в регуляции активности НЭ, так и определяет содержание лимфоцитов с различной реакцией НЭ.
Таким образом, в лимфоцитах здоровых женщин с диффузной реакцией НЭ по сравнению с популяцией клеток с локальной, ниже синтез фермента, сопровождающийся меньшей его активностью. Проведенный анализ, выявленных корреляционных взаимосвязей между морфоденситомет-рическими параметрами активности НЭ в лимфоцитах с локальной, диффузной окраской и фенотипическим составом иммунокомпетентных клеток, показал связь активности фермента с активацией клеток. К тому же, корреляционный анализ обнаружил, что параметры активности НЭ, а также содержание лимфоцитов с различным характером реакции связаны с гормональным статусом.
Результаты корреляционного анализа показали, что активность НЭ в лимфоцитах связана с фенотипическим составом лимфоцитов периферической крови, но типа реакции не достаточно для определения принадлежности клетки к конкретной популяции или субпопуляции. В то же время активность НЭ и характер реакции в лимфоцитах связан с уровнем гормонов, что подтверждает предположение о зависимости активности фермента от гормонального фона.
Работа выполнена при поддержке грантов ККФН 10F20m, 11F162M.
ЛИТЕРАТУРА
1. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. — М.: Медицина, 1998. —704 с.
2. Бышевский А.Ш. Биохимия для врача / А.Ш. Бышевский, О.А. Терсенов. — Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. — 384 с.
3. Жукоцкий А.В., Якубова Н.И., Пикулина Л.А. и др. // Биофизика. - 1993. - Т. 38, № 2. - С. 284-286.
4. Кузнецов С.Л., Смирнов И.Е., Чиликин А.Г. и др. // Клин. лаб. диагн. - 2000. - № 3. - С. 43-46.
5. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков. -М.: Медицина, 1987.
6. Нарциссов Р.П. // Педиатрия. - 1998. -№4. - С. 101-105.
7. Робинсон М.В., Труфакин В.А. // Бюлл. СО АМН. - 1987. - № 2. - С. 29-31.
8. Славинский А.А., Никитина Г.В. // Клин. лаб. диагн. - 2000. - № 5. - С. 34-37.
9. Тотолян А.А., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н. и др. // Клин. лаб. диагн. - 2002. - № 1. - С. 44-50.
10. Хейхоу Ф.Г.Дж. Гематологическая цитохимия / Ф.Г.Дж. Хейхоу, Д. Кваглино. - М.: Медицина, 1983. - 320 с.
11. Шищенко В.М., Петричук С.В., Духова З.Н. и др. // Педиатрия. - 1998. - № 4. - С. 96-101.
12. Cook F., Eales L.J. // J. Immunol. Methods. - 1994. - Vol. 168, N 2. - P. 203-208.
13. Knapp D.W., Turek J.J., DeNicola D.B. et al. / / Anat. Rec. - 1995. - Vol. 243, N 4. - P. 509-515.
