CC BY
32
УДК 599.745.3:591.111
Ключевые слова: дельфин афалина, лимфоциты, цитохимия, адаптация к неволе
Keywords: bottle-nosed dolphin, lymphocytes, cytochemistry, adaptation to captivity
Кавцевич Н. Н.
ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ
дельфинов афалин при содержании в неволе
cytochemical features of blood lymphocytes of bottle-nosed dolphins a t the maintenance in captivity
Учреждение Российской академии наук Мурманский морской биологический институт Кольского научного центра РАН, Мурманск Адрес: 183010, г. Мурманск, ул. Владимирская, д. 17. Тел. (8152) 23-96-55
Murmansk Marine Biological Institute KSC RAS, Murmansk Address: 183010, Russia, Murmansk, vladimirskaya street, 17. Tel. +7 8152 23-96-55
Кавцевич Николай Николаевич, к. б. н., зав. лабораторией морских млекопитающих
Kavtsevich Nikolay N., Fh.D. in Biology Science, Head of Marine Mammal Laboratory
Аннотация. Представлены результаты цитохимического исследования лимфоцитов здоровых и больных дельфинов афалин, содержавшихся в неволе различное время. Выявлены существенные различия по параметрам активности неспецифической эстеразы, сукцинатдегидрогеназы, содержанию гликогена и корреляциям между ними в зависимости от состояния животных. Полученные данные могут быть использованы при оценке и коррекции хода адаптации дельфинов к неволе.
Summary. Results of cytochemical research of lymphocytes of healthy and sick bottle-nosed dolphins, maintained in captivity for various time are presented. Essential differences on parameters of nonspecific esterase and succinic dehydrogenase activity, glycogen content and correlations between them depending on animals state are revealed. obtained data can be used at evaluation and correction of a course of dolphins adaptation to captivity.
Введение
Естественная среда обитания морских млекопитающих постоянно ухудшается в результате загрязнения океана. Заболевания и гибель животных в океанариумах являются важнейшими факторами, препятствующими разведению водных млекопитающих. Проблема оценки эффективности механизмов резистентности к воздействию неблагоприятных факторов актуальна не только для содержащихся в неволе и редких, но и для промысловых видов морских млекопитающих из-за распространяющихся в последние годы интоксикаций и эпизоотий.
Давно поставленный вопрос о существовании у китообразных и ластоногих особенностей лимфоидной системы, обусловленных эволюцией в чистой и не содержавшей патогенных микроорганизмов суши океанической среде и обеспечивающих в современных условиях недостаточную иммунологическую резистентность [14], до настоящего времени не выяснен. В то же время свойства и функции лимфоцитов морских млекопита-
ющих изучены слабо. Цитохимические исследования в комплексе с исследованиями иммунологическими и биохимическими методами могли бы позволить рассмотреть этот вопрос с новой точки зрения, а также дополнить представления о метаболических основах иммунитета.
Материалы и методы
Исследовали кровь от 55 дельфинов афалин, представляющих 3 группы: здоровые адаптированные, здоровые неадаптированные и больные. В первую группу вошли особи, период пребывания которых в неволе до момента взятия крови составлял не менее года. К неадаптированным относили животных, содержавшихся в океанариуме 1-5 месяцев. Такая классификация обосновывается тем, что смертность дельфинов максимальна в первое полугодие неволи, а по истечении года она резко снижается. Кроме того, в результате исследования иммунологическими и биохимическими методами установлено, что для адаптации к условиям
жизни в неволе афалинам требуется не менее года [10]. К больным относили дельфинов с характерными признаками респираторных и кожных инфекционных заболеваний: слизистые выделения и гнилостный запах из дыхала, папулы, язвы на туловище и хвосте. Некоторые особи в различные периоды жизни в неволе были включены в разные группы.
Кровь брали из вены хвостового плавника в пробирку с гепарином, мазки изготавливали общепринятым способом. Окрашивали по Романовскому-Гимза, выявляли неспецифическую эстеразу [15, в модификации], сукци-натдегидрогеназу [5], гликоген при помощи реакции «реактив Шиффа - иодная кислота» (ШИК). Препараты исследовали с масляной иммерсией.
При математической обработке данных вычисляли: среднюю (М); среднеквадратичное отклонение коэффициент вариации (V); показатели асимметрии (Аs) и эксцесса (Ех); информационную энтропию (Н); информационную избыточность (Д) - разницу в процентах между максимальной для гистограммы распределения лимфоцитов с данным числом классов и реальной энтропией и коэффициенты линейной корреляции между этими параметрами.
Результаты и обсуждение
Лейкограмма афалин, как большинства китообразных и ряда наземных млекопитающих, имеет гранулоцитарный профиль. Количество эозинофилов высоко, часто превышает относительное число лимфоцитов. Базофилы не обнаружены. Между исследованными группами афалин выявлены раз-
личия по числу некоторых типов лейкоцитов (табл. 1). Более значительны они по цитохимическим параметрам лимфоцитов.
Оценку активности неспецифической эстеразы (НЭ) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ) проводили, подсчитывая число гранул окрашенных продуктов реакций. Определяли также процент лимфоцитов с «парануклеар-ной» и «гранулярной» эстеразной реакцией и ШИК-положительных (гликогенсодержа-щих) лимфоцитов. При парануклеарном типе реакции (ПН), характерном для «нулевых» лимфоцитов, Т-клеток-супрессоров и «киллеров», наиболее крупное скопление окрашенного продукта реакции напротив выемки в ядре клетки имеет вид «шапочки». Гранулярная реакция в виде округлых гранул одинакового размера (ГР) выявляется в Т-клетках-«хелперах» и части В-лимфоцитов [9].
Р. П. Нарциссов [5] разработал метод количественной оценки активности окислительных ферментов (включая СДГ), основой которого является то, что гранулы продукта реакции имеют одинаковые размеры и их число пропорционально активности фермента. Эстеразоположительные гранулы, наблюдающиеся в световой микроскоп в лимфоцитах, образуются в результате развития реакции в группах лизосом. Их число является показателем, зависящим от количества и локализации этих органелл, изменяющихся при стимуляции клеток [4].
По статистическим характеристикам распределения лимфоцитов между группами афалин (табл. 2) имеются значимые различия (р < 0,01). Больные животные отличаются наибольшим процентом лимфоцитов
Таблица 1.
Лейкоцитарная формула крови афалин (M±m, пределы колебания)
Группы афалин Типы лейкоцитов, %
НС С Э Б М Л
Здоровые адаптированные 1,4±0,5 0-5,0 49,2±4,5 24,0-71,0 22,2±2,6 9,0-38,0 0 2,4±0,3 0-4,0 24,7±3,5 11,0-48,0
Здоровые неадаптированные 3,3±2,2 0-18,0 51,4±7,8 29,0-86,0 17,8±5,0 0-40,0 0 2,1±0,6 0-4,5 25,5±3,9 8,0-42,0
Больные неадаптированные 3,1±1,1 1-9,0 60,6±5,7 45,0-85,0 20,6±4,5 0,5-36,0 0 1,4±0,5 0-3,5 14,4±2,1 8,5-22,0
Примечание: НС и С - нейтрофилы с несегментированным и сегментированным ядром, соответственно, Э - эозинофилы, Б - базофилы, М - моноциты, Л - лимфоциты.
с парануклеарным типом эстеразной реакции и наименьшим средним числом гранул продукта реакции на СДГ, наиболее высокими коэффициентами вариации, асимметрии и эксцесса по последнему показателю. У здоровых адаптированных афалин наиболее высоко среднее число эстеразоположитель-ных гранул, выше, чем у неадаптированных и больных, коэффициент вариации по этому показателю и число ШИК-положительных лимфоцитов. Здоровые неадаптированные животные имеют наименьшее среднее число гранул продукта реакции на неспецифическую эстеразу.
По данным М. Г. Шубича и Н. Н. Дробо-та [12], число лимфоцитов, содержащих три и более эстеразоположительных гранул, у здоровых людей и выздоравливающих выше, чем у больных в активной фазе туберкулеза легких. Направление изменения активности СДГ зависит от этиологии инфекционного заболевания: при бактериальных инфекциях активность фермента, как правило, снижена, при вирусных - остается на уровне нормы либо повышена [6]. При туберкулезной интоксикации активность сукцинатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и альфа-глицерофосфатдегидрогеназы падает, а кислой фосфатазы, наоборот, увеличивается [8].
Согласно результатам настоящей работы, отличия здоровых адаптированных афалин от здоровых неадаптированных и больных по активности НЭ и СДГ лимфоцитов сходны с наблюдающимися у людей при бактериальных инфекциях. Число ШИК-положительных (содержащих гликоген) лимфоцитов у здоровых людей не превышает 30 %. При инфекционных заболеваниях значение этого показателя возрастает, оставаясь высоким длительное время (до двух месяцев) после клинического выздоровления [3]. У здоровых адаптированных дельфинов уровень этого показателя выше, чем в двух других группах животных. В то же время вариабельность числа ШИК-положительных лимфоцитов высока: 4-63 % у здоровых и 5-76 % у больных афалин.
Накопление и утилизация гликогена у морских млекопитающих имеет особен-
ности. Так, в соматической мускулатуре, сердце, печени, почках, головном мозге у них содержится повышенное, по сравнению с наземными млекопитающими, количество гликогена, что является приспособлением к интенсивному гликолизу во время ныряния [13]. Поэтому высокий уровень гликогена в лимфоцитах здоровых адаптированных афалин может быть более близок, чем у остальных, к нормальному его уровню у здоровых диких животных либо, наоборот, является результатом длительного воздействия неблагоприятных факторов неволи. В доступных литературных источниках данные о количестве гликогена в клетках лимфатической системы морских млекопитающих отсутствуют. Это не позволяет достаточно определенно и обоснованно объяснить наблюдающиеся у афалин различия в числе лимфоцитов, содержащих гликоген.
Гистограммы суммарных распределений лимфоцитов достоверно различаются (Р = 0,99). По активности НЭ наиболее велика разница (значение критерия хи-квадрат) между здоровыми адаптированными и здоровыми неадаптированными афалинами, а наименее значительно отличие последних от больных. По активности СДГ различие распределений между здоровыми адаптированными и здоровыми неадаптированными наименьшее (табл. 2). У здоровых адаптированных афалин выше, чем у больных и здоровых неадаптированных, число лимфоцитов с 4-11 эстеразоположительными гранулами. Здоровые неадаптированные дельфины имеют, по сравнению с больными, больше лимфоцитов с 1-2 эстеразоположительными гранулами, но меньшее их число в остальных классах (рис. 1).
У здоровых адаптированных животных выше, чем у больных, численность лимфоцитов в классах с активностью СДГ выше средней (20-60 гранул). Распределение здоровых неадаптированных афалин имеет такое же отличие от больных, но в меньшем интервале (20-32 гранул).
Найденные различия позволили предположить, что сила корреляционных связей между цитохимическими характеристиками в группах афалин также неодинакова.
Таблица 2.
Параметры суммарных распределений лимфоцитов афалин различных групп
по цитохимическим признакам (M±m)
№ Группы дельфинов НЭ СДГ ШИК+
ПН, % Число гранул Число гранул
М V А8 Ех М V А8 Ех
1 Здоровые адаптированные 31,1 ±1,0 2,72 ±0,05 76,1 ±1,8 1,69 ±0,06 2,52 ±0,11 21,46 ±0,33 45,3 ±1,2 0,88 ±0,08 0,96 ±0,16 26,7 ±1,0
2 Здоровые неадаптированные 30,9 ±1,3 1,85 ±0,03 60,2 ±1,6 1,65 ±0,07 2,43 ±0,14 21,25 ±0,36 42,1 ±1,4 0,75 ±0,10 0,42 ±0,20 19,9 ±1,3
3 Больные неадаптированные ± 3 1 1л 2,04 ±0,03 63,1 ±1,3 1,44 ±0,05 2,13 ±0,11 18,60 ±0,32 54,1 ±1,4 1,31 ±0,07 2,00 ±0,15 22,6 ±1,0
Примечание: ПН - лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М - средняя, V - коэффициент вариации (%), As и Ех - показатели асимметрии и эксцесса, соответственно, ШИК+ - содержащие гликоген лимфоциты (%).
Результаты корреляционного анализа представлены на рисунке 2 (показаны корреляции, достоверные при Р > 0,95). Наиболее высок уровень скоррелированности характеристик распределения лимфоцитов у здоровых неадаптированных животных. Причем корреляции (за исключением связи энтропии распределения по активности НЭ и показателя эксцесса по активности СДГ) свидетельствуют об однонаправленности изменений субпопуляционного состава лимфоцитов по активности обоих ферментов. Увеличение среднего числа эстеразоположительных гранул и разнообразия лимфоцитов по этому параметру сопряжено с возрастанием гетерогенности лимфоцитов по активности СДГ
(снижается Ех). Сближение субпопуляций с различной активностью ферментов (возрастает Ех), упрощение распределения по активности СДГ (увеличивается R) связано с повышением числа ШИК-положительных лимфоцитов.
Направленность корреляций соответствует ходу процессов, происходящих при стимуляции лимфоцитов: сначала возрастает активность ферментов лизосом и митохондрий, затем снижается количество гликогена [11].
Корреляции гликоген-СДГ здоровых, здоровых адаптированных и неадаптированных афалин также свидетельствует о зависимости числа гликогенсодержащих лимфоцитов от уровня их разнообразия по активности
50
45
40
35
30
25 ■
20 -
% лимфоцитов
10
5 о
Здоровые адаптированные
□ ГР ■ ПН
□ ГР+ПН
Шк
50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
% лимфоцитов
Здоровые неадаптированные
ИГР
■пн
□ ГР+ПН
Р-Ц-Ц-
50 45 40 35 30 25 20 15
\
% лимфоцитов
Больные
неадаптированные
игр ■ пн
ОГР+ПН
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Число гранул
1 23456789 10 Число гранул
1 2 3 4 5 6 7 Число гранул
Рис. 1. Суммарные распределения лимфоцитов афалин по активности неспецифической эстеразы. ГР - «гранулярная» реакция, ПН - «парануклеарная» реакция.
СДГ: чем он выше (снижаются As, Ех, R), тем ниже содержание ШИК-положительных лимфоцитов.
У больных животных существенных корреляций числа ШИК-положительных лимфоцитов и параметров распределения лимфоцитов по активности СДГ не выявлено. Это может быть связано с пониженной эффективностью утилизации гликогена в их клетках, учитывая что средний уровень активности СДГ у больных афалин снижен. Значение корреляции НЭ-СДГ у больных и у здоровых неадаптированных животных иное, чем у здоровых адаптированных. Если у первых она свидетельствует об однонаправленности сдвигов в составе популяции лимфоцитов по обоим признакам, то у последних увеличение вариабельности лимфоцитов по активности НЭ сопряжено с возрастанием эксцесса, т. е. сжатием распределения, сближением субпопуляций лимфоцитов по активности СДГ.
Корреляции для всей группы животных слабые (г = 0.3-0,4), несмотря на статистическую их достоверность (р < 0,05). Исключение составляет связь числа лимфоцитов с парануклеарной эстеразной реакцией (ПН) и ШИК-положительных лимфоцитов (г = 0,57). Она значительна также у здоровых адаптированных и больных дельфинов. Это, а также сниженная активность СДГ и повы-
шенный процент ПН лимфоцитов у больных животных может свидетельствовать о низкой метаболической активности ПН лимфоцитов афалин.
Таким образом, адаптированные и неадаптированные к неволе и больные афалины имеют неодинаковый состав лимфоцитов по активности неспецифической эстеразы и сук-цинатдегидрогеназы и содержанию гликогена, различаются по корреляциям между этими цитохимическими признаками. Согласно данным В. В. Соколова и соавторов [8], степень изменения силы и направленность корреляций показателей активности другого лизосомного фермента, кислой фосфатазы, а также сукцинатдегидрогеназы, лактатдеги-дрогеназы и альфа-глицерофосфатдегидро-геназы зависят от стадии патологического процесса. У здоровых людей уровень корреляций ниже, чем у больных силикозом, при силикотуберкулезе возрастают и число, и прочность корреляций, а при силикотубер-кулезе с интоксикацией скоррелированность цитохимических параметров лимфоцитов наиболее высока. По средней активности ферментов здоровые и больные существенно не различались. В. М. Робинсон и соавт. [7], исследуя изменения активности неспецифической эстеразы и дегидрогеназ при развитии аутоиммунного процесса у мышей, наш-
Здоровые адаптированные НЭ СДГ
Здоровые неадаптированные
нэ
Ех
0.68
^066
0,74
0.64
^78
Гликоген Ь-^073
СДГ
Ех
Рис. 2. Корреляции между параметрами распределений лимфоцитов афалин: ПН - лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М - средняя; S - среднеквадратичное отклонение; V - коэффициент вариации; АБ и Ех - показатели асимметрии и эксцесса, соответственно; Н - энтропия; Я - информационная избыточность.
ли, что значения коэффициентов корреляции, наоборот, снижаются. В то же время установлено, что животные, отличающиеся высоким уровнем корреляций энзиматических характеристик лимфоцитов, выживают после введения стафилококкового токсина [2].
У дельфинов-афалин в первые месяцы неволи вследствие резкого увеличения об-семененности микроорганизмами развивается состояние, рассматривающееся как предболезнь [1]. Согласно результатам настоящей работы, оно характеризуется значительными сдвигами в системе иммунитета, проявляющимися в усилении сопряженности процессов активации ферментов лизо-сом и митохондрий и утилизации гликогена в лимфоцитах. Однако в среде с высоким содержанием микроорганизмов при неблагоприятном влиянии других факторов (стресс, гиподинамия, корм, отличающийся от природного) процессы иммуногенеза часто оказываются недостаточно эффективными.
Заключение
Согласно полученным нами результатам, особенности структуры популяции лимфоцитов периферической крови по активности неспецифической эстеразы и сукцинат-дегидрогеназы, аналогичные описанным в литературных источниках, посвященных исследованиям человека и лабораторных животных, отличают больных афалин от здоровых.
Выявленные различия в составе лимфоцитов и корреляционных связях могут быть использованы для контроля хода процесса адаптации дельфинов к условиям неволи и его коррекции препаратами, влияющими на метаболизм и функции лимфоидных клеток. При этом показателем уровня адаптации может быть степень приближения значений цитохимических параметров и корреляций между ними у адаптирующихся животных к таковым здоровых адаптированных дельфинов.
Список дитературы
1. Биркун, А. А. Микробиологический аспект адаптации дельфинов к условиям неволи / А. А. Бир-
кун // IX Всесоюз. совещ. по изучению, охране и рациональному использованию морских млекопитающих, 9-14 сентября 1986 г., г. Архангельск: Тез. докл. - Архангельск, 1986. - С. 41-43.
2. Катосова, Л. К. Преморбидный прогноз исхода и диагностика токсикоинфекций по энзиматическому статусу лимфоцитов и нейтрофилов крови / Л. К. Ка-тосова, Р. К. Катосова, Л. А.Левина, Р. П. Нарциссов // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1975. -№ 1. - С. 75-78.
3. Кисляк, Н. С. Клетки крови у детей в норме и патологии / Н. С. Кисляк, Р. В. Ленская. - М. : Медицина, 1978. - 176 с.
4. Линг, Н. Р. Стимуляция лимфоцитов / Н. Р. Линг -М. : Медицина, 1971. - 288 с.
5. Нарциссов, Р. П. Применение п-нитротетразолия фиолетового для количественной цитохимии дегидро-геназ лимфоцитов человека / Р. П. Нарциссов // Архив анат., гистол. и эмбриол. - 1969. - № 5. - С. 85-91.
6. Нарциссов, Р. П. Прогностические возможности клинической цитохимии / Р. П. Нарциссов // Сов. педиатрия. Вып.2. - М. : Медицина, 1984. -С. 267-275.
7. Робинсон, М. В. Метаболизм и морфология лимфоцитов / М. В. Робинсон, Л. Б. Топоркова, В. А. Тру-факин. - Новосибирск : Наука, 1986. - 128 с.
8. Соколов, В. В. Цитохимия ферментов в профпа-тологии / В. В. Соколов, Р. П. Нарциссов, Л. А. Иванова. - М. : Медицина, 1975. - 120 с.
9. Соколов, В. В. Цитохимическая маркировка и морфологическая характеристика субпопуляций лимфоцитов в норме и патологии / В. В. Соколов, Л. А. Иванова // Лаб. дело. - 1982. - № 10. - С. 11-14.
10. Соколова, О. В. Некоторые иммунологические и биохимические показатели у афалины (Tursiops truncatus) при адаптации к условиям жизни в неволе / О. В. Соколова // Доклады АН. - 2004. - Т. 395, № 4. - С. 569-573.
11. Хейхоу, Ф. Гематологическая цитохимия / Ф. Хейхоу, Д. Кваглино. - М. : Наука, 1983. - 319 с.
12. Шубич, М. Г. Кислая неспецифическая эсте-раза лимфоцитов периферической крови в диагностике активности туберкулеза легких / М. Г. Шубич, Н. Н. Дробот // Новые методы лечения в эксперименте и клинике туберкулеза: Сб. науч. тр. Моск. НИИ туберкулеза. - 1987. - Т.2. - С. 125-131.
13. Castellini, M. A. Metabolic depression in tissues and organs of marine mammals diving: living longer with less oxigen / M. A. Castellini // Mol. Physiol. - 1985. -Vol. 8, N. 3. - P. 427-437.
14. Cavagnolo, R. The immunology of marine mammals / R. Cavagnolo // Develop. Comp. Immunol. -1979. - Vol. 3, N 2. P. - 245-257.
15. Müller, J. Nonspecific acid esterase activity: a criterion for differentiation of T and B lymphocytes in mouse lymph nodes / J. Müller, G. Brun del Re, H. Buerki, H. U. Keller, M. W. Hess, H. Cottier // Eur. J. Immunol. - 1975. - Vol. 5, N 4. - P. 270-275.
