CC BY
115
К. Баллестрем, Н. Шифермайер, Ю. Зонис, М. Штутман, А. Бершадский
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МЕЖДУ АКГИНОВЫМ ЦИТОСКЕЛЕТОМ, ФОКАЛЬНЫМИ КОНТАКТАМИ И МИКРОТРУБОЧКАМИ
Институт им. Вейцмана, Реховот, Израиль
Фокальные контакты — это динамические комплексы молекул, ассоциированные с трансмембранными рецепторами из семейства интегринов и соединяющие актиновый цитоскелет с внеклеточным матриксом. Сборка этих комплексов индуцируется натяжением, которое обычно возникает в результате клеточного сокращения, генерируемого миозином II, но может создаваться и в результате действия внешней силы. Таким образом, фокальные контакты работают как механосенсоры, «информируя» клетку о физических характеристиках ее микроокружения. G-белок Rho является главным молекулярным триггером, вызывающим образование фокальных контактов. Он активирует две основные мишени: Rho-ассоциированную киназу (ROCK) и белок mDial, принадлежащий к семейству форминов. Активация Rho-ассоциированной киназы нужна для последующей активации миозин-Н-зависимой сократимости, поэтому в условиях, когда рост контакта вызывается приложением внешнего напряжения, необходимость в этой киназе отпадает. Однако, mDial необходим для сборки фокальных контактов и в этих условиях. Активированный mDial нуклеирует сборку актиновых филаментов, но влияет также и на динамику плюс- и минус-концов микротрубочек. Изменение динамики микротрубочек, индуцируемое mDial, приводит к концентрации плюс-концов микротрубочек вблизи растущих фокальных контактов. Поскольку микротрубочки подавляют миозин-И-зависимую сократимость, их аккумуляция вблизи контактов останавливает рост последних и может даже вызвать их разборку. Таким образом, создается система с отрицательной обратной связью, регулирующая рост фокальных контактов.
Ключевые слова: фокальные контакты, механосенсоры, белок mDial, актиновые филаменты.
Focal contacts are dynamical molecule complexes associated with transmembrane receptors from the integrin family to connect actin skeleton with extracellular matrix. Assembly of these complexes is induced by tension resulting from myosin II-generated cell contraction or an external mechanical force. Therefore the focal contacts work as sensors to inform the cell about physical features of its environment.
G-protein Rho is the principal molecular trigger of focal contact formation. It activates two main targets, i.e. Rho-associated kinase (ROCK) and protein mDial from the formin family. The ROCK activation is needed to further induce myosin-II-dependent cell contractility, therefore there is no need in this kinase if the contact growth is caused by an external force. In contrast, the mDial is still needed to assembly the focal contacts under these conditions too. The active mDial nucleates assembly of actin filaments but also influences dynamics of microtubule plus- and minus-ends. Under the effect of mDial the plus-ends concentrate near growing focal contacts. Since microtubules inhibit myosin H-depending contractility their accumulation near a contact arrests its growth or even induces its disruption. There is therefore a system with a negative feedback to regulate focal contact growth.
Key words: focal contacts, mechanosensors, protein mDial, actin filaments.
© Баллестрем К., Шифермайер H., Зонис Ю., Штутман М., Бершадский А., 2003 УДК 576.3/.7
В этом обзоре мы обсуждаем некоторые механизмы, координирующие активность двух основных цитоскелетных систем — актиновых филаментов и микротрубочек при движении клеток. Изучение вопросов, затронутых в этом обзоре, берет свое начало в классической работе Ю. М. Васильева и соавт. [114], где было впервые показано, что микротрубочки определяют поляризацию двигательной активности у мигрирующих фибробластов. Вопрос о том, каким образом это происходит, занимает с тех пор многих исследователей (включая самого Юрия Марковича и его учеников в Москве и в других городах и странах) и, несомненно, является ключевым для понимания организации цитоскелета, его связи с клеточной адгезией и механизмов направленного движения клеток.
Нам чрезвычайно приятно опубликовать наши соображения, относящиеся к этой проблеме, в сборнике, посвященном дню рождения Юрия Марковича. Обсуждение с Юрием Марковичем новых идей и экспериментов было для одного из нас (А. Бершадский) источником радости и главным стимулом для работы на протяжении многих лет счастливого ученичества и сотрудничества.
Движение клеток является следствием согласованных изменений цитоскелета и адгезионных структур [72]. Клеточные системы, осуществляющие этот процесс, очень сложны и включают не только структурные компоненты и исполнительные механизмы (такие, как цитоскелетные фибриллы, молекулярные моторы и адгезионные рецепторы), но и разнообразные регуляторные и сигнальные элементы, контролирующие динамику и взаимодействия этих структурных единиц. Регуляция движения клетки в целом включает в себя множество цепей обратной связи, необходимых как для координации работы элементарных двигательных механизмов, так и для надлежащей реакции на разнообразные и быстро меняющиеся внешние стимулы. Основным типом внешних сигналов, влияющих на клеточную подвижность, являются, кроме растворенных в среде «мотогенных» лигандов и хемо-таксических факторов, адгезионные контакты клеток друг с другом и с внеклеточным матриксом. В частности, интегрин-зависимая адгезия к внеклеточному матриксу необходима не только для физической связи между клеткой и субстратом, по которому она движется, но и как источник сигналов, определяющих характер движения, его скорость, направленность и так далее [17; 51].
Несмотря на многообразие внешних стимулов и типов двигательных реакций, общая схема регуляции подвижности клеток, как это следует из работ последних 10 лет, на удивление единообразна (рис. 1). Внешние сигналы, включая сигналы от адгезионных рецепторов, не влияют непосредственно на эффекторные (двигательные и адгезионные) элементы, а передаются сначала в некую интегрирующую систему, основными элементами которой являются G-белки семейства Rho [66; 93; 100] и, возможно, некоторые другие малые G-белки, например ARF [18; 111]. Каждый внешний сигнал, таким образом, преобразуется в специфическую комбинацию активностей/локализаций этих G-белков. G-белки, в свою очередь, модулируют активность и локализацию своих эффекторов, порождая каскад сигналов, приводящих к реорганизации цитоскелета и в конечном счете изменениям адгезии и двигательного поведения [14; 33; 93].
Лиганды
Рисунок 1. Общая схема регуляции клеточной подвижности.
Внешние «мотогенные» факторы стимулируют рецепторные ти-розинкиназы либо рецепторы, ассоциированные с G-белками, либо еще какие-нибудь сигнальные пути, приводящие к изменениям активности некоего подмножества малых ГТФаз семейства Rho. Это в свою очередь меняет активность белков, являющихся мишенями этих малых ГТФаз, что в дальнейшем приводит к реорганизации цитоскелетных структур. Изменение цитоскелета сопряжено с формированием или, наоборот, разборкой адгезионных структур, и координированное изменение цитоскелета и адгезионных контактов служит механизмом клеточных перемещений. Сигналы, генерируемые в контактах, в свою очередь влияют на активность Rho ГТФаз, замыкая тем самым цепь обратной связи. Белок из семейства форминов mDial, один из непосредственных эффекторов RhoA ГТФазы, обсуждается в этом обзоре более подробно, чем остальные. Он влияет как на актин, так и на микротрубочки, вызывая глубокие изменения как цитоскелета, так и адгезии клеток к внеклеточному матриксу.
Две главные эффекторные системы, контролируемые G-белками семейства Rho, — это акшновые микрофиламен-ты и микротрубочки. Организация и функционирование этих двух цитоскелетных систем имеют на удивление много общих черт [79]. Как актиновые филаменты, так и микротрубочки обнаруживают структурную полярность и асимметрию в способности к поляризации на двух противоположных концах: быстро растущие плюс-концы склонны к полимеризации, в то время как на минус-концах обычно происходит деполимеризация. Оба типа фибрилл ассоциированы с молекулярными моторами (микротрубочки с кинезином и динеином, актиновые филаменты с разными миозинами), которые направленно двигаются вдоль этих фибрилл [25]. Домены миозинов и кинезинов, ответственные за механохимическую активность, обнаруживают много общего в своей структуре [ИЗ]. Как для микротрубочек, так и для актиновых филаментов динамика процессов полимеризации-деполимеризации на концах фибрилл сложна и богата и допускает разные типы равновесия, включая «тредмиллинг» и «динамическую нестабильность» (см. для актина [75; 83; 88] и для микротрубочек [49; 52; 119]). Сборка и разборка фибрилл регулируется множеством специфических белков, но принципы такой регуляции имеют много общего для актиновых филаментов и микротрубочек (см. для актина [88] и для микротрубочек [49]).
Существование некого механизма регуляции для актиновых филаментов обычно указывает на наличие подобного же механизма для регуляции микротрубочек, и наоборот. Например, как молекулярные комплексы, нуклеирующие сборку микротрубочек, так и комплексы, нуклеирующие полимеризацию актиновых филаментов, включают в себя в качестве основного компонента слегка измененные субъединицы соответствующих фибрилл. Так, главным компонентом комплекса, нуклеи-рующего микротрубочки, является у-тубулин — белок, гомологичный а- и ß-тубулинам [80], в то время как комплекс Aip2/3, нуклеирующий актиновые филаменты, включает в себя два гомологичных актину белка Aip2 и АгрЗ [87].
Несмотря на очевидное сходство в организации и принципах регуляции двух основных цитоскелетных систем, клетка, как правило, использует их для выполнения разных, хотя и связанных между собой функций. Замечательным примером кооперации между актиновым цитосклетом и микротрубочками является процесс сборки, созревания и разборки адгезионных контактов клеток с внеклеточным матриксом, молекулярных комплексов, осуществляющих связь между белками матрикса и актиновым цитоскелетом посредством трансмембранных рецепторов из семейства интегринов [45; 103]. Взаимодействие между актиновым цитоскелетом, микротрубочками и интегринсодержащими адгезионными комплексами является главной темой настоящего обзора.
Координация работы актиновой системы и микротрубочек осуществляется на нескольких уровнях. Имеется, например, несколько типов кросс-линкерных белков, которые непосредственно соединяют микротрубочки с актиновыми фила-ментами (см. обзоры [37; 97]). Однако для временной и пространственной координации динамики фибрилл нужна более сложная и гибкая система регуляции, чем просто механическое их соединение. G-белки (малые ГТФазы) семейства Rho контролируют динамику и организацию не только акгиново-го цитоскелета, но и микротрубочек [23; 29; 38; 54; 81; 82]. Один из механизмов, лежащих в основе такой параллельной регуляции, возможно, связан с особыми свойствами непосредственного эффектора Rho белка mDial, принадлежащего к семейству форминов, родственных белку Diaphonous дрозофилы [5; 116]. В конце обзора мы обсудим свойства этого белка и его возможную роль в согласовании функций актинового цитоскелета и микротрубочек в процессах сборки и разборки адгезионных контактов клеток с внеклеточным матриксом.
Актиновый цитоскелет, микротрубочки и адгезия клеток к субстрату в процессе клеточной локомоции
Локомоторная активность клеток, прикрепленных к субстрату, складывается из периодически повторяющихся последовательностей, состоящих из трех элементарных актов: 1) образования псевдоподиальных выростов, 2) их прикрепления к субстрату и 3) транслокации тела клетки в направлении новообразованных адгезионных контактов [72]. Все эти события в принципе требуют только функционирования актинового цитоскелета и не нуждаются в микротрубочках для своего осуществления. В частности, образование филоподи-альных и ламеллоподиальных выростов происходит исключительно за счет регулируемой полимеризации актиновых филаментов и формирования филаментных сетей и пучков
[88; 104; 106]. Более того, клеточные фрагменты, полученные из эпидермальных кератоцитов рыб и лишенные ядер, центросом и микротрубочек, сохраняют тем не менее способность к образованию и прикреплению ламеллоподий и, соответственно, быстрому направленному движению [34; 115]. Вместе с тем многолетние исследования, начало которым было положено пионерской работой Ю. М. Васильева [114], убедительно показали, что большинству типов клеток для направленной локомоции наряду с актиновой системой требуются микротрубочки.
Для того чтобы выявить роль микротрубочек в миграции клеток, во многих работах использовали специфические химические ингибиторы, такие, как колхицин или нокодазол [85], обработка которыми приводит к быстрой и полной разборке микротрубочек. Сравнение клеточных типов, миграционная способность которых чувствительна к разрушению микротрубочек, с типами, сохраняющими способность к миграции несмотря на отсутствие микротрубочек, выявило одно отчетливое различие между ними: эти клетки отличались по виду контактов, которые они формировали с внеклеточным матриксом. Чтобы охарактеризовать это различие более точно, необходимо рассмотреть подробнее типы интегрин-зависимых адгезионных контактов. Даже в весьма упрощенных, по сравнению с ситуацией в организме, условиях моно-слойных культур можно наблюдать по крайней мере четыре типа интегрин-содержащих структур, связывающих матрикс с актиновым цитоскелетом [45]. Два из них — «классические» фокальные контакты (или фокальные адгезии) и фокальные комплексы — встречаются во всех типах клеток, два других — фибриллярные адгезии и подосомы — более специализированы и типичны только для некоторых клеточных типов [45]. Клетки, растущие внутри трехмерного внеклеточного матрикса, демонстрируют другие, отличные от вышеперечисленных, варианты интегрин-зависимых контактов [26]. Помимо морфологических отличий разные классы интег-ринсодержащих контактов различаются по динамике, белковому составу и степени адгезивности (см. обзоры [2; 45; 121]). Фокальные комплексы — это инициальные точечные контакты (диаметром менее 1 мкм), образующиеся на краях ламеллоподий или на концах филоподий. Это короткоживу-щие структуры, которые либо быстро исчезают, либо преобразуются в классические фокальные контакты (рис. 2) — удлиненные овальные бляшки длиной в несколько микрометров, ассоциированные с пучками актиновых филаментов («стресс-фибриллами»). Фибриллярные адгезии, в свою очередь, возникают из классических фокальных контактов и принимают участие в сборке сети внеклеточных фибронек-тиновых волокон. Наконец, подосомы — небольшие (диаметром около 0,5 мкм) кольцеобразные адгезионные структуры, которые преобладают в таких клетках, как макрофаги и остеокласты [45].
Зависимость локомоторной активности того или иного типа клеток от микротрубочек четко коррелирует с их способностью образовывать классические фокальные контакты. Клетки, которые образуют фокальные комплексы, но не преобразуют их в фокальные контакты, могут успешно мигрировать и при полностью разрушенной системе микротрубочек. К числу клеток, миграционная способность которых не зависит или почти не
ируемая миозином II
Актиновый
цитоскелет
я ••\ Ч. '*•
э1И I
ГТФазы семейства Rho,
Ч* v.
m 18
¡ГI i I I г # * * # * *
Внеклеточный Интегрины матРикс
Интегрин-I зависимые сигналы
Внешняя
fc&v
Рисунок 2. Фокальные контакты как механосенсоры.
Фокальные контакты — это молекулярные комплексы, соединяющие внеклеточный матрикс с актиновым цитоскелетом. Гетероди-мерные трансмембранные рецепторы из семейства интегринов присоединяются к белкам матрикса своими внеклеточными доменами, в то время как их цитоплазматические домены ассоциированы с субмембранной бляшкой, состоящей более чем из 50 типов белковых молекул, объединенных в плотно упакованный комплекс (заключен в овал). Среди этих белков имеются как структурные элементы, так и сигнальные белки, например киназы FAK, ILK и др. Бляшка в свою очередь соединена с концом пучка актиновых фила-ментов. Такие пучки (называемые еще стресс-фибриллами) содержат много белков, ассоциированных с актином, в том числе миозин 11, и способны к сокращению. Образование и поддержание структуры фокального контакта требует приложения к нему механической силы (натяжения). Такая сила может генерироваться благодаря миозин-Н-зависимому изометрическому сокращению актинового пучка или возникать за счет внешних влияний: растяжения субстрата, движения потока жидкой среды и т. д. Вызванная этой силой сборка адгезионных структур индуцирует активацию целого ряда сигнальных каскадов, которые регулируют размножение, дифференцировку и выживание клеток (например, MAP-киназный и Р13-киназный каскады) и влияют на организацию цитоскелета (например, каскад, связанный с активацией/инактивацией малых ГТФаз семейства Rho). В частности, собственно Rho (RhoA) является главным регулятором образования фокальных контактов; его действие опосредовано эффектами на полимеризацию актина и на сократимость, зависящую от миозина II. Схема заимствована из обзора [44] с разрешения издателя.
зависит от микротрубочек, можно отнести упоминавшиеся выше эпидермальные кератоциты рыб [34], «профессиональные» мигранты, такие, как нейтрофилы, способные в некоторых случаях двигаться даже быстрее после разрушения микротрубочек [62], и, возможно, некоторые плохо прикрепляющиеся к субстрату опухолевые клетки [56; 105]. Исследование адгезии кератоцитов, например, выявляет в основном точечные контакты (фокальные комплексы) площадью менее чем 1 мкм2 [73]; очень немногие из таких комплексов трансформируются в классические фокальные контакты [6]. Наоборот, клетки, нуждающиеся в микротрубочках для локомоции, — это, как правило, хорошо прикрепленные к субстрату клетки, которые в дополнение к фокальным комплексам демонстрируют типичные фокальные контакты.
Зависимость миграционной способности от микротрубочек наблюдается у фибробластов и фибробластоподобных
клеток [40; 46; 114], которые двигаются относительно медленно, но также и у быстро мигрирующих клеток, таких, как меланобласты Melb-a или клетки меланомы В16 [9]. Разрушение микротрубочек во всех таких клетках приводит к увеличению размеров, а иногда и количества фокальных контактов [13; 65; 86], что препятствует клеточной миграции, усиливая адгезию клеток к субстрату до уровня, несовместимого с передвижением по нему [9; 103]. Итак, необходимость микротрубочек для миграции определяется характером взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом и проявляется в наибольшей степени у клеток, образующих классические фокальные контакты с субстратом.
Второй важный факт, проливающий свет на функцию системы микротрубочек в клеточной локомоции, — это их очевидное участие в регуляции миозин-П-зависимой сократимости. Начиная с работы В. A. Danowski [28] становится все более ясно, что системы микротрубочек, как правило, противодействуют клеточной сократимости. Напротив, разрушение микротрубочек активирует сократимость многих типов клеток (см. обзоры [32; 103]). Хотя сам факт подавления сократимости микротрубочками не вызывает сомнения, механизм такого подавления пока неясен. Предполагается, что он связан с доставкой или удалением с помощью микротрубочек неких сигнальных молекул, соответственно подавляющих или активирующих миозин II. Кроме того, нельзя исключить, что по крайней мере в некоторых случаях микротрубочки вместе с ассоциированными моторами и кросс-линкерными белками могут механически противостоять актин-миозиновому сокращению. Более детальное обсуждение этих вопросов можно найти в недавно опубликованных обзорах [32; 53; 97; 103; 122]. Таким образом, чтобы понять роль микротрубочек в регуляции клеточной миграции, необходимо сначала объяснить, как образование фокальных контактов связано с сократимостью клеток.
Механосенсорная функция фокальных контактов и ее модуляция микротрубочками
Клетки прилагают к субстрату, к которому они прикрепляются (внеклеточному матриксу), механические силы, генерируемые за счет сократительной активности актинового цитоскелета [8; 31; 41; 48; 107] (см. обзор [12]). Эти силы производятся миозином II и передаются через фокальные контакты. Средняя величина силы, прилагаемой к единице площади фокального контакта, составляет 5 нН/мкм2 [8]. В ходе исследований было обнаружено неожиданное свойство фокальных контактов. Эти структуры, как оказалось, могут возникать, расти и поддерживать свое существование только в условиях, когда на них действует сила такого же порядка. Любое воздействие, которое ингибирует миозин-П-за-висимую сократимость, — будь то обработка химическими ингибиторами киназы легкой цепи миозина II (ML-7, КТ5926) или миозиновой АТФазы (BDM) либо трансфекция плазмидой, кодирующей белок кальдесмон, который также подавляет активность актин-зависимой АТФазы миозина II, — предотвращает образование новых фокальных контактов и, более того, ведет к быстрой разборке существующих контактов такого типа [22; 50]. Когда клетка прикрепляется не к твердому субстрату, а к тонкой эластичной пленке, которую
она в состоянии деформировать, силы натяжения, приложенные к контактным структурам, оказываются существенно слабее. Соответственно, средний размер фокальных контактов, которые клетка образует, прикрепляясь к деформируемому субстрату, существенно меньше, чем размер контактов, возникающих на твердом субстрате [84]. Наконец, образование фокальных контактов можно индуцировать внешним натяжением как с помощью микропипетки, прикрепленной к верхней поверхности клетки, так и путем локального растяжения эластичного субстрата, к которому прикреплена клетка [60; 95]. Внешнее усилие, приложенное к фокальному контакту, может полностью заменить натяжение, генерируемое > клеткой, так что натяжение, возникающее при движении ми-
кропипетки, вызывает рост фокальных контактов даже в клетках, обработанных ВБМ или гиперэкспрессирующих кальдесмон [95].
[ Таким образом, индивидуальные фокальные контакты функционируют как миниатюрные механосенсоры: они увеличиваются в размерах пропорционально приложенному напряжению [8] и подвергаются разборке, когда это напряжение снижается (рис. 2). Механизм такого необычного поведения фокальных контактов пока неясен, и его выяснение требует более детальной информации об организации и ! динамике этих структур, чем та, которой мы располагаем в настоящее время. Возможно, напряжение, приложенное к фокальному контакту, индуцирует изменения конформации некоторых из его компонент и/или их взаимного расположения [43; 44]. Эти изменения должны, в свою очередь, увеличивать вероятность встраивания новых компонент таким образом, что фокальный контакт будет увеличиваться в размерах, сохраняя структурное самоподобие. Наблюдения, свидетельствующие о том, что релаксация натяжения с помощью разных ингибиторов миозина II приводит не просто к задержке роста, а к быстрой разборке фокальных контактов, указывают, что эти структуры пребывают в состоянии динамического равновесия: они непрерывно теряют старые субъединицы и инкорпорируют новые при условии, что к ним приложена сила натяжения.
Действительно, недавние измерения динамики р3-интег-рина в фокальных контактах, в которых оценивалось восстановление флюоресценции вРР-интегрина после фотобли-чинга (так называемый РЯАР-метод) указывают на быстрый круговорот интегрина [10] и на зависимость этого круговорота от активности миозина II [110]. Интересно, что в отличие от фокальных контактов другие типы интегрин-зависимых адгезионных структур (как, например, фокальные комплексы или фибриллярные адгезии) не подвергаются разборке при ингибировании миозин-Н-зависимой сократимости [95; 125]. Тот факт, что сборка фокального контакта зависит от приложенной к нему силы натяжения, делает процесс такой сборки аутокаталитическим, если клетка прикреплена к твердому (недеформируемому) субстрату. Действительно, поскольку в состав фокального контакта входит целый ряд белков, которые могут присоединять или даже нуклеировать актиновые филаменты [45], увеличение размера фокального контакта должно приводить к росту числа ассоциированных с ним ак-тиновых филаментов. Возрастание числа актиновых фила-ментов приведет за счет их взаимодействия с миозиновыми
моторами к увеличению силы натяжения, приложенной к этому фокальному контакту. Увеличение силы, в свою очередь, приведет к дальнейшей активации механосенсорного устройства, ассоциированного с фокальным контактом, и, соответственно, к дальнейшему росту этого контакта. Затем будут рекрутированы новые актиновые филаменты, и так далее. Таким образом, в отсутствие дополнительной регуляции рост фокального контакта на твердом субстрате должен был бы продолжаться вплоть до полного истощения ресурсов (или отрыва от субстрата, если сила натяжения превысит некое пороговое значение).
Очевидно, должен существовать механизм, который мог бы в случае необходимости прервать эту петлю обратной связи и прекратить рост фокального контакта или даже вызвать его разборку. Такой механизм в особенности необходим мигрирующим клеткам для того, чтобы они имели возможность ликвидировать старые контакты по мере передвижения по субстрату. Взаимодействие фокальных контактов с микротрубочками обеспечивает эффективную локальную регуляцию, предотвращающую неограниченный рост фокальных контактов. Микротрубочки противостоят клеточной сократимости; их разрушение вызывает сокращение клеток, сопровождающееся фосфорилированием легкой цепи миозина II [67]. В соответствии со сказанным выше о влиянии миозин-П-за-висимого сокращения на рост фокальных контактов разрушение микротрубочек вызывает увеличение размеров и числа фокальных контактов, причем ингибиторы миозина II подавляют этот эффект [13; 50; 86]. Более того, локальная аппликация ингибиторов миозина II с помощью микропипетки восстанавливает способность к миграции у клеток с разрушенными микротрубочками, нормализуя размеры и распределение фокальных контактов у этих клеток [59].
Наблюдения за динамикой микротрубочек в живых клетках показывают, что натяжение, развивающееся в окрестности мест прикрепления клетки к субстрату, направляет рост микротрубочек в эти части клетки [60]. Были зарегистрированы даже непосредственные «прикосновения» концов микротрубочек к фокальным контактам [57; 71]. Эти взаимодействия сопровождались задержкой роста контактов и часто их полной разборкой [58]. В совокупности эти наблюдения свидетельствуют о том, что микротрубочки избирательно направляются в районы, где происходит рост фокальных контактов, и локально подавляют миозин-И-зависимую сократимость, прерывая петлю положительной обратной связи, вызывающую рост этих структур (более детальное обсуждение этого вопроса см. в обзоре [103]).
Каким же образом клетка координирует процессы зависящего от натяжения роста фокальных контактов и аккумуляции в этом районе концов микротрубочек, вызывающих релаксацию натяжения? Напомним, что образование фокальных контактов зависит от активности малого G-белка Rho [94; 98]. Основными эффекторами Rho в этом процессе являются две мишени Rho: Rho-ассоциированная киназа (ROCK) и белок из семейства форминов mDial [108; 118]. ROCK является необходимым триггером в сигнальном пути, ведущем к активации миозина II [39; 64]. В наших экспериментах было показано, что киназа ответственна за развитие натяжения, необходимого для сборки фокальных контактов,
и необходимость в ней отпадает при натяжении, созданном извне с помощью микропипетки [95]. Функции второй мишени Rho — mDial, по-видимому, более сложны и многообразны. В отличие от ROCK активность mDial необходима и в ситуации, когда натяжение создается внешними факторами, что свидетельствует о возможной роли этого белка в самом процессе сборки контакта [95]. Кроме того, наши результаты, которые будут изложены в следующем разделе, свидетельствуют о том, что mDial оказывает значительное влияние на динамику микротрубочек и поэтому может быть одним из факторов, координирующих отрицательную регуляцию фокальных контактов, зависящую от микротрубочек, с положительной регуляцией, зависящей от актинового цитоскелета.
Возможная роль mDial в координации актинового цитоскелета и микротрубочек в процессе сборки и разборки фокальных контактов
Белки семейства форминов, гомологичные белку Diaphanous дрозофилы, широко распространены и обнаружены также у мыши, человека, нематоды Caenorhabditis elegans [101], гриба Aspergillus [102] и дрожжей (см. обзоры [5; 116]). Мутация Diaphanous у дрозофилы препятствует цитокинезу [3; 19]. Представители белков этого семейства (обозначаемого DRF от Diaphanous Related Formins) имеют сходную структуру и содержат ряд доменов, включая RBD-домен, связывающий Rho-белки, несколько доменов, характерных для всех форминов (FH1, FH2 и иногда FH3), и аутоингибиторный дамш (DAD) [4; 5; 116]. В конформации, когда DAD-домен на С-конце молекулы связан с ее N-концом, молекула неакшвна. Связывание RBD-домена, располагающегося на N-конце, с
бождает DAD-и иержадшшшюкулув «нзткрмяую» фор»угу-которой домены FHrl и FH2 станавятеядостушшши для взаимодействия с другими молекулами (рже. 3). Укороченные делеционные мутанты, пребывающие все время в открытой конформации, являются конститутивно активными [108; 118].
Хорошо документированной функцией DRF и ряда других форминов является их способность вызывать полимеризацию актиновых филаментов [35]. В отличие от известного нуклеатора сборки актина — комплекса Агр2/3, который соединяет актиновые филаменты между собой, порождая ветвящиеся структуры [87; 88], формины вызывают линейный рост актиновых филаментов, связываясь с их плюс-концами. Конститутивно-активные мутанты дрожжевых форминов, содержащие FH1- и РН2-домены, стимулируют полимеризацию актиновых филаментов in vitro [69; 90; 99]. В последнее время показано, что аналогичной (и даже более выраженной) нуклеирующей активностью обладает конститутивно активный фрагмент mDial [74]. Предполагается, что ответственным за собственно нуклеацию является РШ-домен, в то время как богатый пролином FH1-домен нужен для связывания профилина [117] — белка, действующего в комплексе с фор-минами и усиливающего полимеризацию актина [69; 99].
Экспрессия конститутивно активного мутанта mDial также сильно увеличивает'степень полимеризации актина в клетках млекопитающих in vivo [24; 117; 118]. Более того, клетки, экспрессирующие такой мутант, образуют многочисленные пучки актиновых филаментов, ориентированные в
mDial (AN3) I FH1 |—| FH2
Рисунок 3. Структура белка mDial и его активация мономерным G-белком RhoA.
Мышиный белок mDiai принадлежит к семейству DRF — группе белков, родственных белку Diaphanous дрозофилы, которое входит в мультигенное семейство форминов. В неактивном состоянии mDial, как и другие DRF-белки, пребывает в «закрытой» конформации, когда его аутоингибиторный домен (DAD), расположенный-на С-канце, присоединен к N-концу молекулы. В результате присоединения активного (связанного с ГТФ) RhoA к Rho-связывагсщему-демвну (RED) на N-конце mDiat последний освобождается от DAD, и молек^кшйредадихв.«открытую» конформацию, в которой форминоеыа-домшы-рш-и FH2 становятся доступными для их лигандов[-5]-КонститутавН0-активная форма mDial (mDia1AN3) лишена N-конца и части DAD и содержит FH1 и FH2 в открытой конформации;
одном.направлении, и приобретают характерную биполярную морфологию (рис. 4). Этот фенотип резко отличается от фенотипа, возникающего при активацжи-Агр2/3-комплекса с помощью гиперэкспресии Агр2Д-активатора белка Scar или его С-терминального домена VCA. Усиление акгановой полимеризации через активацию Агр2/3 приводит не к образованию, а к разрушению всех нормальных актиновых структур и полной утрате поляризации [77].
Таким образом, создается впечатление, что активный mDial вызывает не просто усиление полимеризации актина, но и целый ряд эффектов, приводящих в совокупности к характерному гиперполяризованному фенотипу. Действительно, накапливаются данные, свидетельствующие, что формины влияют не только на актин, но и на микротрубочки. Например, как нокаут, так и гиперэкспрессия дрожжевого формина For3 ведут к значительным изменениям морфологии комплекса цитоплазматических микротрубочек [81]. Возможно, в клетках млекопитающих формины тоже могут каким-то образом влиять на динамику микротрубочек. Так, показано, что активация формина mDia2 (называемого также DRF3) приводит к увеличению фракции микротрубочек, в которых а-тубулин подвергся специфической посттранс-ляционной модификации — отщеплению С-концевого тирозина [82]. Поскольку такая модификация обычно коррелирует с повышенным сроком жизни микротрубочек [63; 120], эти данные косвенно свидетельствуют о том, что mDia2 может стабилизировать микротрубочки. Мы детально исследовали динамику микротрубочек в клетках, экспрессирующих активную форму mDial, и убедились, что поведение как плюс- , так и минус-концов микротрубочек в таких клетках подвергается существенным изменениям [11].
Рисунок 4. Изменения цитоскелетных структур, вызываемые активной формой тР1а1.
А. — Как видно при окрашивании СуЗ-фаплоидином, клетки, экспрессирующие активный пгЮ1а1, содержат значительно больше полимеризированного актина, чем контрольные. Пучки актино-вых филаментов (А), как и микротрубочки (Б, Г) ориентированы вдоль оси биполярной клетки. При окрашивании трансфицированных клеток антителами к у-тубулину видно, что активная форма тО'1а1, слитая с вРР (ОРР-тРЫДЫЗ), локализуется диффузно, но концентрируется на центросоме (В). Масштаб 10 мкм.
В течение своего жизненного цикла микротрубочка проходит через несколько стадий. После нуклеации на центросоме она растет с постоянной скоростью вплоть до приближения к краю клетки, где фазы роста сменяются фазами укорочения и длина микротрубочек осциллирует (так называемый режим «динамической нестабильности») [68]. Тем временем конец микротрубочки, связанный с центросомой (минус-конец), может отделиться от нее [1; 61], что обычно приводит к быстрой разборке микротрубочки [68]. Моделью, с помощью которой можно изучать такую разборку, являются клеточные фрагменты (цитопласты), из которых удалена центросома [20; 96]. В таких цитопластах масса полимеризированного ту-булина существенно ниже, чем в интактных клетках или в цитопластах, содержащих центросомы [96] (рис. 5).
Исследуя эффект пЮ1а1 на динамику микротрубочек, мы обнаружили, что в клетках, экспрессирующих активную форму тО\а1, как полимеризация, так и деполимеризация происходят более медленно, чем в контрольных клетках. При этом частота переходов из состояния роста в состояние разборки и наоборот не изменяется, в результате чего амплитуда осцилляций плюс-концов микротрубочек снижается и, соответственно, возрастает вероятность их встречи с фокальными контактами, находящимися на периферии клетки. Не менее драматичен эффект тТ)\&\ на минус-концы микротрубочек. В цитопластах, полученных из клеток, экспрессирующих активную форму тБ1а1, количество полимеризированного тубулина (общая длина микротрубочек) остается большим даже в отсутствие центросомы. Таким образом, тО\я1 предохраняет минус-концы микротрубочек, не защищенные связью с центросомой, от быстрой деполимеризации. Эта способность к стабилизации минус-концов согласуется с тем фактом, что в интактных клетках шВ1а1 локализуется на центросомах (рис. 4).
Рисунок 5. Белок т01а1 стабилизирует микротрубочки, не связанные с центросомой.
А. — В цитопластах, содержащих центросомы, микротрубочки образуют радиальную систему и их минус-концы ассоциированы с центросомой. Б. — Цитопласты, утратившие центросомы, содержат намного меньше микротрубочек, количество полимери-зованного тубулина в них намного ниже, чем в центросомапьных цитопластах. В. — Бесцентросомные цитопласты, экспрессирующие активную форму тР1а1, сохраняют биполярную морфологию и многочисленные микротрубочки, ориентированные вдоль длинной оси. Количество полимеризованного тубулина (общая длина микротрубочек) в этих цитопластах того же порядка, что и в цитопластах с центросомами. Окраска антителами к тубулину. Рис. 5А воспроизведен с разрешения издателя из работы [20].
микротрубочек, и какую роль он может играть в координации функций микротрубочек и актинового цитоскелета при управлении фокальными контактами? Эффект пЮш1 на микротрубочки может быть либо следствием его влияния на актин, либо результатом его еще не выявленных взаимодействий с молекулярными комплексами, непосредственно регулирующими динамику микротрубочек, либо, наконец, происходить благодаря активации неких сигнальных путей, влияющих (в числе прочих мишеней) и на микротрубочки.
Актин-зависимый механизм базируется на существовании целой группы разнообразных белков, которые могут обеспечивать динамическое соединение микротрубочек с акгиновыми филаментами [37; 98]. Связывание таких белков с микротрубочками может, вообще говоря, влиять на динамику последних и таким образом преобразовывать изменения в организации актина под действием тБ1а1 в изменения динамики и организации системы микротрубочек. Механизмы такого рода могли бы, наверное, объяснить изменение скоростей полимериза-ции-деполимеризации на плюс-концах микротрубочек, которое наблюдается в клетках, экспрессирующих активную форму тШа1. Менее понятно, почему усиление полимеризации актина, вызванное шВ1а1, должно стабилизировать минус-кон-цы микротрубочек. Этот факт вместе с обнаруженной нами локализацией п^а! на центросоме позволяет предположить,
что mDial может непосредственно взаимодействовать с некими центросомальными белками, принимающими участие в нуклеации микротрубочек и/или кэппировании их минус-концов.
Интересно, что другой эффектор Rho ROCK тоже локализуется на центросоме [21]. Более того, мы показали, что ингибитор ROCK Y-27632 предотвращает стабилизацию микротрубочек в бесцентросомных цитопластах по действием mDial. Между тем этот ингибитор не отменяет стимулирующего эффекта mDial на полимеризацию актина. Таким образом, можно предположить, что эффект mDial на минус-концы микротрубочек обусловлен не самим по себе усилением полимеризации актина, а его кооперацией с ROCK и, возможно, взаимодействием с другими центросомальными белками.
Недавно обнаружена группа белков, которые локализуются на растущих концах микротрубочек и, по всей видимости, играют важную роль в регуляции динамики микротрубочек и взаимодействии концов микротрубочек с клеточным кортексом. В эту группу входят белок ЕВ1 и его партнер APC, CLIP-170 и взаимодействующие с ним белки семейства CLASP динеин и его рецептор динактин (в частности, основной компонент ди-нактинового комплекса белок pl50Glued), и наконец Lisi — белок, взаимодействующий как с динеином, так и с CLIP-170 (см. обзоры [16; 47]). Замечательно, что многие, если не все, представители этой группы белков обнаруживаются также на центросоме, где они, возможно, влияют на динамику и заяко-ривание минус-концов микротрубочек [7; 36; 91]. Возможно, что mDial взаимодействует с одним или несколькими белками этой группы и как-то модулирует их влияние как на минус-, так и на плюс-концы микротрубочек. Такое предположение могло бы объяснить большинство эффектов mDial и заслуживает экспериментальной проверки.
Наконец, как уже отмечалось, нельзя пока исключить, что mDial модулирует динамику микротрубочек не напрямую, а через некий достаточно сложный сигнальный каскад. В частности, некоторые данные свидетельствуют о том, что mDial может вызвать активацию Rae [109]. Активный Rae в свою очередь может влиять на динамику микротрубочек [123] посредством нескольких сигнальных путей, в том числе через Pakl и Ор18/статмин [29] и путь, зависящий от Rac-эффек-тора IQGAP [38].
Ключевым для понимания механизма функционирования mDial как координатора актинового цитоскелета, фокальных контактов и микротрубочек является вопрос о пространственно-временной регуляции его активности в клетке. Поскольку единственным известным активатором mDial является Rho, распределение активного mDial должно совпадать с распределением активного Rho. В последнее время появились работы, в которых распределение активных форм Rae, Cdc42 и Rho выявляется с помощью разных вариантов техники FRET (fluorescence resonance energy transfer) [42; 55; 70; 124].
Активацию Rae может вызывать сигнал от интегрина [89], и кажется весьма вероятным, что образование новых контактов клеток с матриксом на ведущем крае определяет пространственный градиент активности Rae [30; 112]. Интег-рин-зависимый сигнал может также активировать Rho, хотя механизм такой активации не вполне ясен; эта активация
Стабилизация Медленная
осцилляция
Низкая Градиент Высокая
активности mDial
Рисунок 6. Схема, иллюстрирующая возможную роль mDial в организации системы микротрубочек.
В областях клетки с высокой активностью mDial динамика плюс-концов микротрубочек замедляется, а минус-концы оказываются защищенными от деполимеризации даже в случае, если они не связаны с центросомой. Это приводит к накоплению микротрубочек в районах с повышенной активностью mDial, т. е. в областях, близких к источникам интегрин-зависи-мых сигналов, каковыми, вероятно, являются фокальные контакты (см. текст для более подробного обсуждения).
зависит от типа интегрина [27; 78] и имеет сложную временную динамику (так, ей часто предшествует уменьшение активности Rho [92]). Тем не менее можно предположить, что в конечном счете Rho активируется интегрин-зависимым сигналом, генерируемым в фокальных контактах, и градиент активности Rho зависит от пространственного распределения фокальных контактов в клетке.
Мы предполагаем, что градиент активности mDial (возникающий за счет градиента активности Rho) модулирует динамику микротрубочек в клетке (рис. 6). Стабилизация минус-концов избирательно предохраняет от разборки микротрубочки, отделившиеся от центросомы и обращенные в сторону повышенной активности mDial. Изменение динамики на плюс-концах приведет к увеличению среднего времени, которое эти концы проводят вблизи фокальных контактов. Таким образом, mDial будет способствовать увеличению концентрации концов микротрубочек вблизи источника интегринового сигнала (рис. 6). Это в свою очередь приведет к усилению зависимого от микротрубочек транспорта в этом направлении (и обратно), повышению вероятности непосредственной встречи периферических микротрубочек с фокальными контактами и, возможно, локальному подавлению миозин-П-зависимой сократимости в этом районе клетки. Эти эффекты дают клетке возможность поляризоваться и мигрировать в направлении, определяемом интегрин-зависимым сигналом от внеклеточного матрикса, будь то градиент концентрации матриксных молекул [15] или градиент степени деформируемости (ригидности) субстрата [76]. Аккумуляция концов микротрубочек вблизи фокальных контактов, приводящая к локальному подавлению сократимости, должна прервать петлю положительной обратной связи, из-за которой происходит неограниченный рост контактов, как было рассмотрено в предыдущем разделе (рис. 7). Это дает клетке возможность
Стабилизация
минус-концов
микротрубочек
Замедление динамики плюс-концов микротрубочек. Усиление таргетинга фокальных контактов
Интегрин"
Рисунок 7. Модель, представляющая роли актиновой системы и микротрубочек в развитии фокальных контактов.
А.— Сборка, зависящая от натяжения. Rho индуцирует образование фокальных контактов, активируя ROCK и mDial. Функция ROCK заключается в активации миозин-П-зависимого сокращения посредством подавления активности фосфатазы легких цепей миозина (обозначены полумесяцами). Сила натяжения, приложенная к механочувствительной адгезионной бляшке («черный ящик»), вызывает ее рост за счет встраивания новых компонент. Активный mDial нуклеирует полимеризацию актиновых филаментов, образующих пучок, ассоциированный с фокальным контактом. Когда сила натяжения приложена извне, mDial остается единственным эффектором Rho, необходимым для роста фокальных контактов. Б. — Остановка роста и разборка, зависящие от микротрубочек. Высокий уровень активности mDial ведет к изменению динамики микротрубочек как на плюс-, так и на минус-концах. В стабилизации минус-концов принимает участие также ROCK. Изменение динамики трубочек приводит к увеличению вероятности попадания их плюс-концов в окрестность растущих фокальных контактов (см. текст и схему на рис. 6). Аккумуляция концов микротрубочек вблизи фокальных контактов ведет к локальному подавлению миозин-П-зависимой сократимости в этих районах и, соответственно, к уменьшению силы натяжения, приложенной к контактам. Это, в силу зависимости данных структур от натяжения, приведет к остановке их роста или полной разборке. Рис. 7А приведен в работе [951 и воспроизводится из обзора [43] с разрешения издателя.
избежать как нежелательного роста контактов, так и их внезапного отрыва (из-за чрезмерного роста силы натяжения). Вместо этого старые контакты, привлекшие много микротрубочек и поэтому оказавшиеся в зоне пониженной сократимости, будут подвергаться разборке, давая клетке возможность передвинуться на новый участок субстрата. Таким образом, микротрубочки оказываются необходимыми для миграции клеток, которые образуют фокальные контакты при прикреплении к субстрату. Быстро мигрирующие клетки, образующие в основном фокальные комплексы, зависят от микротрубочек в значительно меньшей степени.
Заключение
В этом обзоре мы старались осветить обнаруженные недавно связи между процессами образования и роста фокальных контактов, сократительной активностью клеток и динамикой микротрубочек. Фокальные контакты функционируют как механосенсоры, отвечающие на приложение силы (внешней или генерируемой самой клеткой) активацией сборки, происходящей в направлении приложенной силы. Силы, генерируемые клеткой, зависят от активности миозина II, которая в свою очередь регулируется малым G-белком Rho посредством Rho-ассоциированной киназы ROCK. Другой эффектор Rho — белок mDial, принадлежащий к семейству форминов, нуклеирует полимеризацию актиновых филаментов и влияет на динамику как плюс-, так и минус-концов микротрубочек таким образом, что вероятность попадания концов микротрубочек в окрестность фокального контакта возрастает. Поскольку
микротрубочки противодействуют миозин-Н-зависимой сократимости, эти изменения их динамики обеспечивают необходимую отрицательную регуляцию, приводящую к остановке роста или даже разборке фокального контакта.
Очевидно, что модель, охарактеризованная выше, будет в дальнейшем развиваться и уточняться. Молекулярные механизмы, посредством которых приложение силы вызывает рост фокального контакта, пока неясен. Мы не знаем также, каким образом микротрубочки противодействуют миозин-Н-зависимой сократимости. Хотя тотальная деполимеризация микротрубочек, очевидно, вызывает сокращение клетки, до сих пор не показано, что концы индивидуальных микротрубочек могут локально блокировать сократимость в их окрестности; возможные механизмы такой локальной релаксации также пока неясны. Наконец, требует выяснения молекулярный механизм, лежащий в основе эффектов mDial на динамику микротрубочек. Все эти вопросы являются привлекательными темами для будущих исследований.
ЛИТЕРА ТУРА
X.AbalМ., PielМ., Bouckson-Castaing V., Mogensen М., Sibarita J. В., Bornens М. Microtubule release from the centrosome in migrating cells // J. Cell Biol. - 2002. - Vol. 159. - P. 731-737.
2. Adams J. Cell-matrix contact structures I I Cell Mol. Life Sci. — 2001. — Vol. 58.-P. 371-392.
3. Afshar K., Stuart B., Wasserman S. A. Functional analysis of the Drosophila diaphanous FH protein in early embryonic development I I Development. - 2000. - Vol. 127. - P. 1887-1897.
4. Alberts A. S. Identification of a carboxyl-terminal diaphanous-related formin homology protein autoregulatory domain // J. Biol. Chem. —
2001. - Vol. 276. - P. 2824-2830.
5. Alberts A. S. Diaphanous-related formin homology proteins // Curr. Biol. - 2002. - Vol. 12. - P. R796.
6. Anderson K. I., Cross R. Contact dynamics during keratocyte motility // Curr. Biol. - 2000. - Vol. 10. - P. 253-260.
7. Askham J. M., Vaughan K. T., Goodson H. V., Morrison E. E. Evidence that an interaction between EB1 and pl50Glued is required for the formation and maintenance of a radial microtubule array anchored at the centrosome // Mol. Biol. Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 3627-3645.
8. Balaban N. Q., Schwarz U. S., Riveline D., Goichberg P., Tzur G., Sabanay I., Mahalu D., Safran S., Bershadsky A., Addadi L., Geiger B. Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates // Nat. Cell Biol. — 2001. — Vol. 3. — P. 466-472.
9. Ballestrem C., Wehrle-HallerB., HinzB., ImhofB. A. Actin-dependent lamellipodia formation and microtubule-dependent tail retraction control-directed cell migration // Mol. Biol. Cell. — 2000. — \bl. 11.—
P. 2999-3012.
10. Ballestrem C., ffinz B., ImhofB. A., Wehrle-Haller B. Marching at the front and dragging behind: differential alpha5beta3-integrin turnover regulates focal adhesion behavior//J. Cell Biol. — 2001. — Vol. 155. — P. 1319-1332.
11. Ballestrem C., Magid N., Zonis J., Shtutman M., Ishlzaki T., Narumiya S., Bershadsky A. Regulation of microtubule dynamics by the formin homology protein, mDial I I Mol. Biol. Cell. — 2002. —
Vol. 13. - P. 422a.
12. Beningo K. A., Wang Y L. Flexible substrata for the detection of cellular traction forces // Trends Cell Biol. — 2002. — Vol. 12. —
P. 79-84.
13. Bershadsky A., Chausovsky A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvement of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction // Curr. Biol. — 1996. — Vol. 6. — P. 1279—1289.
14. Bishop A. L., Hall A. Rho GTPases and their effector proteins // Biochem. J. - 2000. - Vol. 348 (Pt. 2). - P. 241-255.
15. Brandley B. K., SchnaarR. L. Tumor cell haptotaxis on covalently immobilized linear and exponential gradients of a cell adhesion peptide//Dev. Biol. - 1989. - Vol. 135. - P. 74-86.
16. Carvalho P., TirnauerJ. S., Pellman D. Surfing on microtubule ends // Trends Cell Biol. - 2003. — Vol. 13. - P. 229-237.
17. Cary L. A., Han D. C., Guan J. L. Integrin-mediated signal.transduction pathways //Histol. Histopathol. — 1999. — Vol. 14. —
P. 1001-1009.
18. Casanova J. E. ARFs // Curr. Biol. — 2003. — "Vfol. 13. — P. R123.
19. Castrillon D. H., Wasserman S. A. Diaphanous is required for cytokinesis in Drosophila and shares domains of similarity with the products of the limb deformity gene // Development. — 1994. —
Vol. 120. - P. 3367-3377.
20. Chausovsky A., Bershadsky A. D., BorisyG. G. Cadherin-mediated regulation of microtubule dynamics I I Nat. Cell Biol. — 2000. — Vol. 2. — P. 797-804.
21. Chevrier V., Piel M., Collomb N., Saoudi Y, Frank R., Paintrand M., Narumiya S., BornensM., Job D. The Rho-associated protein kinase pl60ROCKis required for centrosome positioning // J. Cell Biol. —
2002. - Vol. 157. - P. 807-817.
22. Chrzanowska-Wodnicka M., Burridge K. Rho-stimulated contractility drives the formation of stress fibers and focal adhesions // J. Cell Biol. —
1996. - Vol. 133. - P. 1403-1415.
23. Cook T. A., Nagasaki T., Gundersen G. G. Rho guanosine triphosphatase mediates the selective stabilization of microtubules induced by lysophos-phatidic acid // J. Cell Biol. - 1998. - Vol. 141. - P. 175-185.
24. Copeland J. W., Treisman R. The diaphanous-related formin mDial controls serum response factor activity through its effects on actin polymerization 11 Mol. Biol. Cell. — 2002. — Vol. 13. — P. 4088—4099.
25. Cross R. A., Carter N. J. Molecular motors // Curr. Biol. — 2000. — Vol. 10. - P. R177-R179.
26. Cukierman E., Pankov R., Stevens D. R., Yamada K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension // Science. — 2001. —
Vol.294.-P. 1708-1712.
27. Danen E. H., Sonneveld P., Brakebusch C., FasslerR., SonnenbergA. The fibronectin-binding integrins alpha5betal and alpha5beta3 differentially modulate RhoA-GTP loading, organization of cell matrix adhesions, and fibronectin fibrillogenesis // J. Cell Biol. — 2002. —
Vol. 159.-P. 1071-1086.
28. Danowski B. A. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors // J. Cell Sci, — 1989. — Vol. 93. —
P. 255-266.
29. Daub H., GevaertK., Vandekerckhove J., SobelA., Hall A. Rac/Cdc42 and p65PAK regulate the microtubule-destabilizing protein stathmin through phosphorylation at serine 16 //J. Biol. Chem. — 2001. —
Vol. 276. - P. 1677-1680.
30. Del Pozo M. A., Kiosses W. B., Alderson N. B., MellerN., Hahn K. M., Schwartz M. A. Integrins regulate GTP-Rac localized effector interactions through dissociation of Rho-GDI // Nat. Cell Biol. — 2002. — Vol. 4. - P. 232-239.
31. Dembo M., Wang Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts I I Biophys. J. — 1999. — Vol. 76. —
P. 2307-2316.
32. Elbaum M., Chausovsky A., Levy E. T., Shtutman M., Bershadsky A. D. Microtubule involvement in regulating cell contractility and adhesion-dependent signalling: a possible mechanism for polarization of cell motility// Biochem. Soc. Symp. — 1999. — Vol. 65. — P. 147—172.
33. Etienne-Manneville S., Hall A. Rho GTPases in cell biology //
Nature. - 2002. - Vol. 420. - P. 629-635.
34. Euteneuer U., Schliwa M. Persistent, directional motility of cells and cytoplasmic fragments in the absence of microtubules // Nature. — 1984.-Vol. 310.-P. 58-61.
35. Evangelista M., Zigmond S., Boone C. Formins: signaling effectors for assembly and polarization of actin filaments // J. Cell Sci. — 2003. — Vol. 116.-P. 2603-2611.
36. Feng Y., Olson E. C., StukenbetgP. T., Flanagan L. A., Kirschner M. W., Walsh C. A. LIS1 regulates CNS lamination by interacting with mNudE, a central component of the centrosome // Neuron. — 2000. — Vol. 28. - P. 665-679.
37. Fuchs E., Karakesisoglou I. Bridging cytoskeletal intersections //
Genes Dev. — 2001. — Vol. 15. — P. 1—14.
38. FukataM., Watanabe T., NoritakeJ., Nakagawa M., YamagaM., Kuroda S., Matsuura Y., Iwamatsu A., Perez. F., Kaibuchi K. Racl and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170 //
Cell. - 2002. - Vol. 109. - P. 873-885.
39. Fukata Y, Amano M., Kaibuchi K. Rho-Rho-kinase pathway in smooth muscle contraction and cytoskeletal reorganization of nonmuscle cells // Trends Pharmacol. Sci. — 2001. — Vol. 22. — P. 32—39.
40. Gail M. H., Boone C. W. Effect of colcemid on fibroblast motility // Exp. Cell Res. - 1971. - Vol. 65. - P. 221-227.
41. Galbraith C. G., Sheetz M. P. A micromachined device provides a new bend on fibroblast traction forces I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —
1997. — Vol. 94. - P. 9114-9118.
42. GardinerE. M., Pestonjamasp K. N., BohlB. P., Chamberlain C.,
Hahn K M., Bokoch G. M. Spatial and temporal analysis of Rac activation during live neutrophil chemotaxis // Curr. Biol. — 2002. — Vol. 12. —
P. 2029-2034.
43. Geiger B., Bershadsky A. Assembly and mechanosensory function of focal contacts // Curr. Opin. Cell Biol. — 2001. — Vol. 13. — P. 584—592.
44. Geiger B., Bershadsky A. Exploring the neighborhood: adhesion-cou-pled cell mechanosensors // Cell. — 2002. — Vol. 110.—
P. 139-142.
45. Geiger B., Bershadsky A., Pankov R., Yamada K. M. Transmembrane extracellular matrix-cytoskeleton crosstalk//Nat. Rev. Mol. Cell Biol. —
2001. - Vol. 2. - P. 793-805.
46. Goldman R. D. The role of three cytoplasmic fibers in BHK-21 cell motility. I. Microtubules and the effects of colchicine // J. Cell Biol. — 1971. - Vol. 51. - P. 752-762.
47. Gundersen G. G. Evolutionary conservation of microtubule-capture mechanisms // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2002. - Vol. 3. - P. 296-304.
48. Harris A K, Wild P., StopakD. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion // Science. — 1980. — Vol. 208. — P. 177—179.
49. Heald R., Nogales E. Microtubule dynamics // J. Cell Sci. — 2002. — Vol. 115, —P. 3-4.
50. Helfman D. M., Levy E. T., Berthier C., Shtutman M., Riveline D., Grosheva I., Lachish-Zalait A., Elbaum M., Bershadsky A. D.
Caldesmon inhibits nonmuscle cell contractility and interferes with the formation of focal adhesions // Mol. Biol. Cell. — 1999. — Vol. 10. —
P. 3097-3112.
51. Holly S. P., Larson M. K, Parise L. V. Multiple roles of integrins in cell motility // Exp. Cell Res. - 2000. - Vol. 261. - P. 69-74.
52. Howard J., Hyman A. A. Dynamics and mechanics of the microtubule plus end // Nature. - 2003. - Vol. 422. — P. 753—758.
53. Ingber D. E. Mechanical signaling and the cellular response to extracellular matrix in angiogenesis and cardiovascular physiology // Circ. Res. - 2002. - Vol. 91. - P. 877-887.
54. Ishizaki T., Morishima Y., Okamoto M., Puruyashiki T., Kato T.,
Narumiya S. Coordination of microtubules and the actin cytoskeleton by the Rho effector mDial //Nat. Cell Biol. — 2001. — 'Vol. 3. — P. 8—14.
55. Itoh R. E., Kurokawa K, Ohba Y., Yoshizaki H., MochizukiN., Matsuda M. Activation of rac and cdc42 video imaged by fluorescent resonance energy transfer-based single-molecule probes in the membrane of living cells // Mol. Cell Biol. - 2002. —Vol. 22. - P. 6582-6591.
56. Ivanova O. Y., Svitkina T. M., VasilievJ. M., Gelfand I. M. Effect of col-cemid on the distribution of pseudopodial activity in fibroblasts. Microtubule-independent stabilization of cell surface // Exp. Cell Res. — 1980. - Vol. 128. - P. 457-461.
57. Kaverina I., RottnerK, Small J. V. Targeting, capture, and stabilization of microtubules at early focal adhesions j I J. Cell Biol. — 1998. — Vol. 142.-P. 181-190.
58. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J. V Microtubule targeting of substrate contacts promotes their relaxation and dissociation // J. Cell Biol. - 1999. - Vol. 146. - P. 1033-1044.
59. Kaverina I., Krylyshkina O., Gimona M., Beningo K., Wang Y. L.,
Small J. V. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules // Curr. Biol. — 2000. — Vol. 10. — P. 739—742.
60. Kaverina L, Krylyshkina O., Beningo K., Anderson K., Wang Y-L.,
Small J. V. Tensile stress stimulates microtubule outgrowth in living cells//J. Cell Sci. -2002. - Vol. 115. - P. 2283-2291.
61. Keating T. J., Peloquin J. G., Rodionov V. I., Momcilovic D., Borisy G. G. Microtubule release from the centrosome // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. - 1997. - Vol. 94. - P. 5078-5083.
62. Keller H. U., Niggli V. Colchicine-induced stimulation of PMN motility related to cytoskeletal changes in actin, alpha-actinin, and myosin // Cell Motil. Cytoskeleton. — 1993. — \fol. 25. — P. 10—18.
63. Khawaja S., Gundersen G. G., Bulinski J. C. Enhanced stability of microtubules enriched in detyrosinated tubulin is not a direct function of detyrosination level //J. Cell Biol. — 1988. — Vol. 106. — P. 141—149.
64. Kimura K., Ito M., Amano M., Chihara K, Fukata Y, Nakafuku M., Yamamori B., FengJ., Nakano T., OkawaK, IwamatsuA., KaibuchiK. Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase Rho-kinase// Science. - 1996. - Vol. 273. - P. 245-248.
65. Kirchner J., Kam Z., TzurG., Bershadsky A. D., Geiger B. Live-cell monitoring of tyrosine phosphorylation in focal adhesions following microtubule disruption // J. Cell Sci. — 2003. — Vol. 116.—
P. 975-986.
66. KjollerL., Hall A. Signaling to Rho GTPases // Exp. Cell Res. —
1999. - Vol. 253. - P. 166-179.
67. Kolodney M. S., Elson E. L. Contraction due to microtubule disruption is associated with increased phosphorylation of myosin regulatory light chain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1995. — Vol. 92. —
P. 10 252-10 256.
68. Komarova Y. A., Vorobjev I. A., Borisy G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary// J. Cell Sci. — 2002. —\fc>l. 115. — P. 3527-3539.
69. KovarD. R., Kuhn J. R., TichyA. L., Pollard T. D. The fission yeast cytokinesis formin Cdcl2p is a barbed end actin filament capping protein gated by profilin // J. Cell Biol. — 2003. — Vol. 161. —
P. 875-887.
70. Kraynov V S., Chamberlain C., Bokoch G. M., Schwartz M. A.,
Slabaugh S., Hahn K. M. Localized Rac activation dynamics visualized in living cells // Science. — 2000. — Vol. 290. — P. 333—337.
71. Krylyshkina O., Anderson K. I., Kaverina I., Upmann I., Manstein D. J., Small J. V., Toomre D. K Nanometer targeting of microtubules to focal adhesions // J. Cell Biol. — 2003. — Vol. 161. - P. 853-859.
72. Lauffenburger D. A., HorwitzA. F. Cell migration: a physically integrated molecular process I I Cell. — 1996. — Vol. 84. — P. 359—369.
73. Lee J., Jacobson K. The composition and dynamics of cell-substratum adhesions in locomoting fish keratocytes // J. Cell Sci. — 1997. —
Vol. 110.-P. 2833-2844.
74. Li P, Higgs H. N. The mouse Formin mDial is a potent actin nucleation factor regulated by autoinhibition // Curr. Biol. — 2003. —
Vol. 13.-P. 1335-1340.
75. Littlefield R., Fowler V.M. A minor actin catastrophe // Nat. Cell Biol. — 2002. - Vol. 4. - P. E209-E211.
76. Lo C. M., Wang H. B., Dembo M., Wang Y. L. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate // Biophys. J. — 2000. — Vol. 79. —
P. 144-152.
77. Machesky L. M., Insall R. H. Scarl and the related Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP, regulate the actin cytoskeleton through the Arp2/3 complex // Curr. Biol. — 1998. — Vol. 8. — P. 1347—1356.
78. Miao H., Li S., Hu Y. L., Yuan S., Zhao Y., Chen B. P., Puzon-McLaughlin W., Tarui T., ShyyJ. Y., Takada Y, UsamiS., ChienS. Differential regulation of Rho GTPases by betal and beta3 integrins: the role of an extracellular domain of integrin in intracellular signaling //
J. Cell Sci. - 2002. — Vol. 115. - P. 2199-2206.
79. Mitchison T. J. Compare and contrast actin filaments and microtubules // Mol. Biol. Cell. - 1992. - Vol. 3. - P. 1309-1315.
80. Moritz M., Agard D. A. Gamma-tubulin complexes and microtubule nucleation//Curr. Opin. Struct. Biol. — 2001.— Vol. 11, —P. 174—181.
81. Nakano K, Imai J., Aral R., Toh E. A., Matsui Y, Mabuchi I. The small GTPase Rho3 and the diaphanous/formin For3 function in polarized cell growth in fission yeast // J. Cell Sci. — 2002. — \bl. 115. — P. 4629—4639.
82. Palazzo A. F., Cook T. A., Alberts A. S., Gundersen G. G. mDia mediates Rho-regulated formation and orientation of stable microtubules // Nat. Cell Biol. - 2001. - Vol. 3. - P. 723-729.
83. Pantaloni D., Le Clainche C., CarlierM. F. Mechanism of actin-based motility// Science. — 2001. — Vol. 292. — P. 1502—1506.
84. Pelham R. J., Wang Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1997. — Vol. 94.-P. 13 661-13 665.
85. Peterson J. R., Mitchison T. J. Small molecules, big impact. A history of chemical inhibitors and the cytoskeleton // Chem. Biol. — 2002. — Vol. 9.-P. 1275-1285.
86. Pletjushkina O. J., Belkin A. M., Ivanova O. J., Oliver T., Vasiliev J. M., Jacobson K. Maturation of cell-substratum focal adhesions induced by depolymerization of microtubules is mediated by increased cortical tension // Cell Adhes. Commun. — 1998. — Vol. 5. —
P. 121-135.
87. Pollard T. D., Beltzner C. C. Structure and function of the Arp2/3 complex // Curr. Opin. Struct. Biol. — 2002. — Vol. 12. — P. 768—774.
88. Pollard T. D., Borisy G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments // Cell. — 2003. — \fol. 112. — P. 453—465.
89. Price L. S., Leng J., Schwartz M. A., Bokoch G. M. Activation of Rac and Cdc42 by integrins mediates cell spreading // Mol. Biol. Cell. —
1998.-Vol. 9.-P. 1863-1871.
90. Pruyne D., Evangelista M., Yang C., Bi E., Zigmond S., BretscherA., Boone C. Role of formins in actin assembly: nucleation and barbed-end association // Science. — 2002. — Vol. 297. — P. 612—615.
91. Rehberg M., GrafR. Dictyostelium EB1 is a genuine centrosomal component required for proper spindle formation // Mol. Biol. Cell. —
2002. - Vol. 13. - P. 2301-2310.
92. Ren X. D., Kiosses W. B., Schwartz M. A. Regulation of the small GTP-binding protein Rho by cell adhesion and the cytoskeleton // Embo J. —
1999. - Vol. 18. - P. 578-585.
93. Ridley A. J. Rho GTPases and cell migration //J. Cell Sci. — 2001. — Vol. 114.-P. 2713-2722.
94. Ridley A. J., Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors // Cell. - 1992. - Vol. 70. - P. 389-399.
95. Riveline D., ZamirE., Balaban N. Q., Schwarz U. S., Tshizaki T.,
Narumiya S., Kam Z., Geiger B., Bershadsky A. D. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDial-dependent and ROCK-independent mechanism//! Cell Biol. - 2001. - \fcl. 153. - P. 1175-1186.
96. Rodionov V, Nadezhdina&, Borisy G. Centrosomal control of microtubule dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1999. —
Vol. 96.-P. 115-120.
97. Rodriguez O. C., Schaefer A. W., Mandato C. A., Forscher P.,
Bement W. M., Waterman-Storer C. M. Conserved microtubule-actin interactions in cell movement and morphogenesis // Nat. Cell Biol. —
2003. - Vol. 5. - P. 599-609.
98. RottnerK., Hall A., Small J. V. Interplay between Rac and Rho in the control of substrate contact dynamics // Curr. Biol. — 1999. — Vol. 9. — P. 640-648.
99. Sagot I., Rodal A. A., Moseley J., Goode B. L., Pellman D. An actin nucle-ation mechanism mediated by Bnil and profllin // Nat. Cell Biol. —
2002. - Vol. 4. - P. 626-631.
100. Schmidt A., Hall A. Guanine nucleotide exchange factors for Rho GTPases: turning on the switch // Genes Dev. — 2002. — Vol. 16. —
P. 1587-1609.
101. Severson A. F., Baillie D. L., Bowerman B. A. Formin Homology Protein and a Profllin Are Required for Cytokinesis and Arp2/3-Independent Assembly of Cortical Microfilaments in C. elegans //
Curr. Biol. - 2002. - Vol. 12. - P. 2066-2075.
102. Sharpless K. E., Harris S. D. Functional characterization and localization of the Aspergillus nidulans formin SEPA // Mol. Biol. Cell. — 2002. — Vol. 13. - P. 469-479.
103. Small J. V., Geiger B., Kaverina L, Bershadsky A. Opinion: How do microtubules guide migrating cells? // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. —
2002. - Vol. 3. - P. 957-964.
104. Small J. V, Stradal T., Vignal E., RottnerK. The lamellipodium: where motility begins // Trends Cell Biol. — 2002. — Vol. 12. —
P. 112-120.
105. Sroka J., von Gunten M., Dunn G. A., Keller H. U. Phenotype modulation in non-adherent and adherent sublines of Walker carcinosarcoma cells: the role of cell-substratum contacts and microtubules in controlling cell shape, locomotion and cytoskeletal structure // Int. J.
Biochem. Cell Biol. - 2002. - Vol. 34. - P. 882-899.
106. Svitkina T. M., Bulanova E. A., Chaga O. Y, Vignjevic D. M., Kojima S., Vdsiliev J. M., Borisy G. G. Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network // J. Cell Biol. — 2003. —
Vol. 160. - P. 409-421.
107. Tien J., Nelson C. M., Chen C. S. Fabrication of aligned microstructures with a single elastomeric stamp // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —
2002. - Vol. 99. - P. 1758-1762.
108. Tominaga T., Sahai E., Chardin P., McCormickF, Courtneidge S. A., Alberts A. S. Diaphanous-related formins bridge Rho GTPase and Src tyrosine kinase signaling // Mol. Cell. — 2000. — Vol. 5. — P. 13—25.
109. Tsuji T., Ishizaki T., Okamoto M., Higashida C., Kimura K., Furuyashiki T., Arakawa Y., Birge R. B., Nakamoto T., Hirai H., Narumiya S. ROCK and mDiai antagonize in Rho-dependent Rac activation in Swiss 3T3 fibroblasts //J. Cell Biol. — 2002. — Vol. 157. — P. 819-830.
110. Tsuruta D., Gonzales M., Hopkinson S. B., Otey C., Khuon S.,
Goldman R. D., Jones J. C. Microfilament-dependent movement of the beta3 integrin subunit within focal contacts of endothelial cells //
Faseb. J. - 2002. — Vol. 16. - P. 866-868.
111. Turner C. E., Brown M. C. Cell motility: ARN O and ARF6 at the cutting edge // Curr. Biol. - 2001. - Vol. 11. - P. R875-R877.
112. TzimaE., DelPozo M.A., Kiosses W. B., MohamedS.A., Li S., ChienS., Schwartz M. A. Activation of Racl by shear stress in endothelial cells mediates both cytoskeletal reorganization and effects on gene expression// Embo J. - 2002. - Vol. 21. — P. 6791-6800.
113. Vale R. D., Milligan R. A. The way things move: looking under the hood of molecular motor proteins // Science. — 2000. — Vol. 288. —
P. 88-95.
114. Vasiliev J. M., Gelfand I. M., Domnina L. V, Ivanova O. Y., Komm S. G., Olshevskaja L. V. Effect of colcemid on the locomotory behaviour of fibroblasts //J. Embryol. Exp. Morphol. — 1970. —Vol. 24. —
P. 625-640.
115. Verkhovsky A. B., Svitkina T. M., Borisy G. G. Self-polarization and directional motility of cytoplasm // Curr. Biol. — 1999. — Vol. 9. —
P. 11-20.
116. WallarB. JAlberts A. S. The formins: active scaffolds that remodel the cytoskeleton // Trends Cell Biol. — 2003. — Vol. 13. — P. 435—446.
117. Watanabe N., Madaule P., Reid T., Ishizaki T., Watanabe G., Kakizuka A., Saito Y., Nakao K, Jockusch B. M., Narumiya S. pl40mDia, a mammalian homolog of Drosophila diaphanous, is a target protein for Rho small GTPase and is a ligand for profilin // Embo J. - 1997. - Vol. 16. - P. 3044-3056.
118. Watanabe N., Kato T., FujitaA., Ishizaki T., Narumiya S.
Cooperation between mDial and ROCK in Rho-induced actin reorganization//Nat. Cell Biol. - 1999. - Vol. 1. - P. 136-143.
119. Waterman-Storer C. M., Salmon E. D. Microtubule dynamics: tread-milling comes around again // Curr. Biol. — 1997. — Vol. 7. —
P. R369-R372.
120. Webster D. R., Gundersen G. G., Bulinski J. C., Borisy G. G.
Differential turnover of tyrosinated and detyrosinated microtubules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987. - Vol. 84. - P. 9040-9044.
121. Wehrle-Haller B., Imhof B. The inner lives of focal adhesions // Trends Cell Biol. - 2002. - Vol. 12. - P. 382-389.
122. Wittmann T., Waterman-Storer C. M. Cell motility: can Rho GTPases and microtubules point the way? //J. Cell Sci. — 2001. — Vol. 114. —
P. 3795-3803.
123. Wittmann T., Bokoch G. M., Waterman-Storer C. M. Regulation of leading edge microtubule and actin dynamics downstream of Racl //
J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 161. - P. 845-851.
124. Yoshizaki H., Ohba Y., Kurokawa K, Itoh R. E., Nakamura T., Mochizuki N., Nagashima K., Matsuda M. Activity of Rho-family GTPases during cell division as visualized with FRET-based probes //
J. Cell Biol. - 2003. - Vol. 162. - P. 223-232.
125. Zamir E., KatzM., Posen Y., ErezN., YamadaK. M., KatzB. Z., Lin S., Lin D. C., Bershadsky A., KamZ., Geiger B. Dynamics and segregation of cell-matrix adhesions in cultured fibroblasts 11 Nat. Cell Biol. —
2000. - Vol. 2. - P. 191-196.
