CC BY
87
И. Каверина, Дж. В. Смолл
НАПРАВЛЕННАЯ ПОДВИЖНОСТЬ: МИКРОТРУБОЧКИ УКАЗЫВАЮТ ПУТЬ
Институт молекулярной биологии Австрийской академии наук, Зальцбург, Австрия
Для перемещения на новую территорию клетки должны принимать асимметричную поляризованную форму, при которой передний (вьщвигающийся) и задний (поджимающийся) края более или менее диаметрально противоположны. Процессы выдвижения (протрузии) и поджатия производятся актиновым цитоскелетом. Но для поляризации необходимы и микротрубочки, поскольку при их разрушении она исчезает или делается нечеткой. Как же микротрубочки влияют на поляризацию подвижных клеток? Наши исследования с использованием живых клеток и специфических молекулярных проб дают основания предположить, что микротрубочки локально модулируют динамику фокальных контактов с субстратом путем прямого направленного взаимодействия плюс-концов с контактами — таргетинга. Другие данные говорят о том, что регуляция динамики контактов достигается локально: под действием микротрубочек происходят изменения в сократимости актомиозина на концах стресс-фибрилл, где они соединяются с контактами. Натяжение также играет роль в направленном подрастании микротрубочек к контактам, что говорит о существовании обратной связи между сократимостью и динамикой полимеризации микротрубочек. Мы пришли к выводу, что микротрубочки контролируют организацию актинового цитоскелета, а значит, и поляризацию клетки, путем дифференциальной регуляции динамики фокальных контактов.
Ключевые слова: фокальные контакты, концы микротрубочек, подвижность клеток, передача сигнала, актиновый цитоскелет.
То invade new territory, a cell must set up an asymmetric, or polarised form, whereby the protruding and retracting zones are more or less diametrically opposed. The processes of protrusion and retraction are mediated by the actin cytoskeleton. But polarisation requires the cooperation of microtubules, since it is lost or impaired when microtubules are disassembled. So how do microtubules influence cell polarity in migrating cells? Our studies using living cells and specific molecular probes suggest that microtubules influence cell polarity by modulating the spatial dynamics of substrate adhesions via direct «targeting» interactions of microtubules with adhesion foci. Other lines of evidence suggest that this regulation of adhesion site dynamics is achieved via a local, microtubule-dependent modulation of actomyosin contractility at the ends of the actin bundles where they enter adhesion foci. The signals regulating contractility and turnover have yet to be identified, but the microtubule motor kinesin has already been implicated in the delivery of the putative signal along microtubules. Contractility also plays a role in the guidance of microtubules into adhesion foci, suggesting a feedback between contractility and microtubule polymerisation dynamics. We conclude, that by spatially regulating the turnover of adhesion foci, microtubules modulate the organisation of the actin cytoskeleton and thereby the polarity of a cell.
Key words: focal adhesions, microtubule tips, cell motility, signaling, actin cytoskeleton
Таинственная «проблема Васильева»
приводит к их деполяризации и потере способности к направленному движению (рис. 1). На фоне тогдашнего уровня знаний это был безусловно поразительный результат. Идеи современников о клеточной подвижности основывались преимущественно на биохимических и структурных данных о мышечном сокращении, где актиновые и миозино-вые филаменты играют центральную роль. Уже был выделен
Исследования, которым посвящен наш обзор, проводились уже в начале 70-х гг., когда Ю. М. Васильев с коллегами показали, что разрушение микротрубочек в фибробластах
© Каверина И., Смолл Дж. В., 2003 УДК 576.3/.7
актомиозин, уже было показано, что цитохалазин, разрушающий актин, ингибирует клеточную подвижность... Какое же отношение имеют к этому микротрубочки?
В последующие годы, по мере того как развивалась наука о цитоскелете, Ю. М. Васильев с сотрудниками продолжали работать в том же направлении и создали целую концепцию на эту тему, а именно: микротрубочки оказывают важное влияние на актиновый цитоскелет и тем самым стабилизируют дифференциацию активных (подвижных) и неактивных участков края клетки [41; 42]. Однако как именно они оказывают это влияние, оставалось неясным.
Поляризация клетки и адгезия
В своих работах на подвижных клетках основоположники 70-х показали, что перемещение клетки включает протрузию на переднем крае и поджатие задней части клетки. Было отмечено, что протрузия может принимать форму плоских или же цилиндрических выростов цитоплазмы, которые стали называть ламеллоподиями и филоподиями; поджатие же рассматривали как процесс, аналогичный сокращению [1; 42].
Прежде чем продолжить, мы не можем обойти вниманием вопрос о технологиях, которые применяли в то время для фиксирования данных о клеточных движениях под микроскопом. Роскошь ССБ-камер и цифровой записи изображения просто не существовала. Вместо этого под рукой была трудоемкая микрокиносъемка на 16-миллиметровую пленку и бесконечная каторга в фотолаборатории. Анализ полученных данных также занимал много времени и был под силу лишь наблюдательному, терпеливому и увлеченному исследователю.
Вернемся к теме. Уже из описанных ранних работ было ясно, что подвижность возможна лишь при условии регулируемой адгезии клетки к субстрату. Адгезивные структуры возникают на активно продвигающемся ведущем крае и затем специфически видоизменяются [41]. Этот динамический процесс был впоследствии детально изучен с помощью метода интерференционного отражения (например, [16]), а также иммунофлюоресцентной микроскопии компонентов цитоскелета. Выяснилось, что контакт с субстратом осуществляется через участки клеточной поверхности, соединенные внутри клетки с актиновым цитоскелетом. Таким образом, исследование клеточной подвижности свелось к изучению механизмов, определяющих координированную перестройку актина и адгезивных структур, соединяющих его с внеклеточным матриксом.
Различные типы адгезивных структур могут быть выделены уже на основе их морфологии и локализации (например, [38]): маленькие точечные или продолговатые фокальные комплексы, располагающиеся в ламеллоподиях и филоподи-ях, и большие эллипсовидные фокальные контакты [4], располагающиеся на концах актиновых стресс-фибрилл, натянутых в цитоплазме. Последующие работы А. Холла, А. Ридли и других дали существенный толчок этим исследованиям, показав, что малые ГТФазы семейства №0 управляют формированием различных компонентов актинового цитоскелета и ассоциированных с ними контактных структур. Согласно этим исследованиям, сигналы от И.ас и Сёс42 идут, соответственно, к ламеллоподиям и филоподиями (вместе с фокальными комплексами), а Шю необходим для формирования
Рисунок 1. Деполяризация клетки и изменения фокальных контактов.
Короткими стрелками указаны фокальные комплексы, длинными — зрелые фокальные контакты. А. — Деполяризация клетки и изменения фокальных контактов после разрушения микротрубочек. Фибробласт рыбы показан до и через 1 ч после обработки 2,5 мг/мл нокодазола. Вверху: фазово-контрастная микроскопия. Внизу: флюоресцентная микроскопия ОРР-зиксина. Б. — Деполяризация клетки и изменения 'фокальных контактов при блокировании кинезина-1. Фибробласт ксенопуса показан до и спустя 1 ч после микроиньекции антител 81Ж-4. Флюоресцентная микроскопия ОРР-зиксина.
стресс-фибрилл и фокальных контактов [13]. Исходя из этого судить о поляризации клетки можно, основываясь на картине контактов с субстратом, даже при отсутствии информации об активном крае. Проще говоря, фокальные комплексы указывают на ведущий край, а краевые фокальные контакты — на поджимающийся «хвост» (рис. 1, левая часть).
Микротрубочки и актин
встречаются в контактах
Намек на то, как микротрубочки могут воздействовать на актиновый цитоскелет, последовал из наблюдения, что концы микротрубочек нередко совпадают в локализации с недавно сформированными контактами у ведущего края клетки. На основе этих данных, полученных сопоставлением киносъемки и иммунофлюоресценции, была сформулирована гипотеза, что микротрубочки могут стабилизировать фокальные контакты [33].
Спустя 10 лет мы вернулись к вопросу о возможной корреляции между микротрубочками и контактами — на этот раз с использованием технологий, позволяющих анализировать динамику микротрубочек и контактов с субстратом в живых клетках [23]. Добавив к анализу фактор времени, мы убедились, что взаимодействие микротрубочек с контактами является не редким, а, наоборот, частым событием. В действительности, все фокальные контакты, формирующиеся как позади ведущего края, так и в результате поджатая клетки,
CLASP
Растущая микротрубочкаfj ЕВ1 -фр
CLIP-170
*APQ
Диссоциация
*«
Asef ^
Растущая : j микротрубонка fji
Активный Rho '
Разбирающийся фокальный контакт у Неактивный
№0
-г—_____Активный статмин
СбОР-170)
.. .. ................../
Микротрубочка н-.v/
__ Катастрофа
CLIP 170
Неактивный
РАК
Спасение
.CLIP-17^
^ж^ж
{ ФокальныйНеак-контакт тивный
Неактивный статмин ^?с
Рост ГТПП
Активный РАК
Рисунок 2. Таргетинг фокального контакта микротрубочкой.
А. — Показаны кадры из видеозаписи фибробласта, трансфицированного вРР-тубулином и вРР-зиксином, снятые с использованием флюоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Все наблюдаемые объекты находятся на расстоянии проникновения скользящего луча (не более 100 нм от субстрата). На первом кадре (0 мин) конец микротрубочки отмечен белой стрелкой, а фокальный контакт — черной. За время фильма (1 мин) одна и та же микротрубочка подходит к контакту 3 раза (обозначение 1—3). Анализ интенсивности изображения в зоне скользящего луча доказывает, что микротрубочка удалена от мембраны в зоне контакта менее чем на 50 нм. Время указано в секундах. Б. — Возможные сценарии передачи сигнала при таргетинге. I. Микротрубочки могут концентрировать в районе контакта активный Вас. Благодаря этому снижается активность ЯИо и происходит разборка контакта. Модуляторами этого процесса выступают плюс-концевые белки АРС и СиР-170, которые связывают Рас-ОЕР АэеТ и 1СЮАР соответственно. II. Микротрубочки могут захватывать и дезактивировать вЕР-Н1, вызывая локальное подавление активности ЯРю и способствуя динамичности контактов. III. Многократный повторный таргетинг фокальных контактов может регулироваться через цепочку Вас-РАК-статмин. РАК сконцентрирован в фокальных контактах и может фосфорилировать и ингибировать статмин, способствуя росту микротрубочки и регулируя частоту и длительность таргетинга. Насколько этот механизм определяет динамику микротрубочек в этом районе, зависит от локального баланса Иас и ЯЬо. СиР-170 также может влиять на частоту таргетинга.
подвергались таргетингу — процессу направленного подрастания микротрубочки [21; 23].
Недавние исследования с использованием техники скользящего луча (микроскопии полного внутреннего отражения) продемонстрировали непосредственную близость этого взаимодействия (рис. 2) [28]. С помощью этого метода клетки, сидящие на стеклянной подложке, можно подвергнуть освещению в тонком прилегающем к стеклу слое (100— 200 нм). Было установлено, что в фибробластах, экспрессирующих ОРР-тубулин, микротрубочки могут подрастать вниз к дорсальной поверхности клетки на расстояние не более 50 нм. Такая активность наблюдается преимущественно у пе-
риферии клетки и совпадает с таргетингом. Иными словами, растущие концы микротрубочек взаимодействуют с фокальными контактами в радиусе менее 50 нм, т. е. на расстоянии, достаточно близком для обмена регуляторными молекулами.
Таргетинг усиливает динамичность фокальных контактов
Результат одновременного анализа динамики микротрубочек и контактов в живых клетках четко доказывает, что микротрубочки оказывают отрицательное влияние на сборку контактных структур (рис. 3) [21]. Этот вывод был сделан по результатам различных экспериментов. Первые данные
Обмен компонентами
Сократимость
Слабый
ЯЬо
■■■маанм^Фкс*
тО'1а
Иас
Рисунок 3. Разборка фокальных контактов и поджатие края клетки при таргетинге фокальных контактов микротрубочками.
А. — На рисунке показаны кадры из видеозаписи фибробласта, экспрессирующего СРР-тубулин и СРР-зиксин, во время восстановления после локального применения нокодазола. Время восстановления показано в минутах. Б. — Типы контактов в подвижных клетках (схема). Первые распознаваемые сайты адгезии — фокальные комплексы (ФКС), которые возникают в ламеллоподиях или филоподиях под влиянием Рас и Сс1с42. Они поддерживают протрузию и либо разбираются через несколько минут, либо дифференцируются в более долгоживущие фокальные контакты под действием Р1ю. Вероятно, р190Р1юСар противостоит этой дифференцировке и способствует тем самым быстрому обороту компонентов контактов и протрузии. Вывод о существовании промежуточной стадии созревании фокального комплекса (ФКС*) истекает из сведений о том, что Рас может активироваться через т01а. Для дифференцировки фокальных контактов необходимы наличие миозина в составе актиновых пучков и активация сократимости через цепочку Я!то—ПЬю-киназа с участием таких факторов, как вЕР-Ж. Фокальные контакты позади активного края остаются неподвижны и постепенно разбираются (ФК). Фокальные контакты на поджимающемся краю начинают скользить по субстрату и разбираются «на ходу» (скФК). В клетках, обработанных ингибитором РЬо-киназы, микротрубочки (диагональные полосы) подрастают к контактам, а также некоторым фокальным комплексам (предположительно ФКС*). Сигналы, доставляемые микротрубочками, могут задерживать рост или вызывать разборку контактов.
были получены из наблюдений за формированием контактов в распластывающихся клетках при их начальном взаимодействии с субстратом. В контрольных клетках первые образовавшиеся контакты разбираются по мере того, как последующие формируются на продвигающейся вдаль от центра клетки активной периферии. В присутствии нокодазола, напротив, ранние контакты не разбираются, но удлиняются по мере увеличения радиуса клетки. Этот феномен объясняет задержку распластывания клеток в нокодазоле, описанную еще Ю. М. Васильевым и И. М. Гельфандом [42]. Очевидно, микротрубочки необходимы для поддержания обмена компонентов контактов, ускоряющего распластывание.
Другие эксперименты показали, что разборка контактов на поджимающихся краях предваряется, а также сопровождается многократно повторяющимся таргетингом (рис. ЗА). Как мы отмечали ранее, таргетинг фокальных контактов
наблюдается и в зонах активной протрузии, где рост фокальных контактов ограничен. Однако, если ингибировать таргетинг у активного края низкой концентрацией таксола, размер фокальных контактов увеличивается в несколько раз. Все эти факты свидетельствуют о том, что взаимодействие микротрубочек с фокальными контактами либо задерживает рост контактов, либо, более того, приводит к их полной разборке и последующему обмену компонентов.
Сократимость: функциональная связь
Надо заметить, что Ю. М. Васильев и И.М. Гельфанд предсказали взаимодействие микротрубочек с сократимыми структурами, по всей вероятности — пучками микрофиламен-тов. Более того, Васильев разработал идею о том, что натяжение играет роль в созревании и поддержании фокальных кон-тактов, впоследствии доказанную работами К. Барриджа [5]
и А. Бершадского [3; 34]. Связь между микротрубочками и сократимостью была впечатляюще продемонстрирована тем, что натяжение в фибробластах возрастает при разборке микротрубочек [7]. Этот эффект сопровождается ростом фокальных контактов [3; 9], который в свою очередь может подавляться ингибиторами миозина II [3]. Перечисленные работы указывают на то, что микротрубочки в процессе регуляции уменьшают натяжение, продуцируемое миозином в составе акти-нового цитоскелета.
После открытия таргетинга фокальных контактов микротрубочками, мы выдвинули предположение, что подавление микротрубочками сократимости четко локализовано, а именно происходит только в фокальных контактах. В этом случае во время коротких событий таргетинга микротрубочки обеспечивают доставку к контактам определенных «расслабляющих» сигналов, которые запрещают рост контактов или провоцируют их разборку (рис. 3,Б). Обоснованием для такой точки зрения явились эксперименты, в которых мы искусственно вызывали локальное расслабление, доставляя ингибиторы миозина на край клетки с помощью микропипетки [20; 21]. С помощью этого подхода мы индуцировали поджатие края клетки, аналогичное тому, которое происходит на заднем крае мигрирующей клетки. Использование клеток с микроинъецированным меченым миозином показало, что поджатие вызывалось сокращением стресс-фибрилл в теле клетки, в то время как актомиозин на краю (в зоне фокальных контактов) оставался расслабленным. В дальнейшем мы показали, что подобное асимметричное расслабление миозина может индуцировать подвижность обработанных но-кодазолом неполяризованных клеток [20]. Обобщая эти данные, мы пришли к выводу, что микротрубочки вызывают поляризацию клеток путем поддержания градиента сократимости внутри клетки. Такой градиент формируется путем создания различной степени расслабления фокальных контактов в разных частях клетки.
Кинезин и доставка сигналов
Микротрубочки служат магистралями, по которым молекулярные моторы транспортируют различные грузы между центросомой и периферией клетки [14; 18]. Логично выяснить, вовлечены ли моторы (кинезины и динеин) в передачу сигналов, модулирующих фокальные контакты. Вопрос об участии кинезина в регуляции поляризации клетки [35], а также фокальных контактов [24] был поднят в лабораториях Ю. М. Васильева и И.М. Гельфанда, где были проанализированы фиксированные препараты предварительно микроинъ-ецированных антикинезиновыми антителами клеток. Эти работы показали, что изменения морфологии клеток и рисунка контактов в клетках с заблокированным кинезином сходны с изменениями, наблюдаемыми после разборки микротрубочек. Позже мы вернулись к вопросу, участвует ли главный и наиболее распространенный кинезин (кинезин-1) в регуляции контактов. Для этого мы использовали антитела, специфически блокирующие функцию этого мотора, а также мутантный вариант тяжелой цепи кинезина, необратимо связывающий микротрубочки [29].
Когда активность кинезина была блокирована в живых фибробластах с помеченными компонентами контактов
(винкулином или зиксином), размер контактов увеличивался (рис. 1 ,Б) в соответствии с предшествующими данными на фиксированных клетках [24]. Наблюдение за динамикой микротрубочек при дополнительной трансфекции ОРР-тубу-лином показало отсутствие изменений в таргетинге. Блокирование функций динеина, напротив, не вызывало реакции ни в поляризации клеток, ни в динамике контактов.
Динамика контактов после инактивации кинезина совпадает с динамикой, вызванной разрушением микротрубочек, что указывает на участие кинезина в передаче сигнала. Связывание транспортируемой молекулы считается функцией легких цепей кинезина [43], однако специфическая делокализация легких цепей не приводит к описанному воздействию на контакты (неопубликованные данные). Вероятно, транспорт компонентов, необходимых для разборки контактов, обеспечивается все же тяжелой цепью кинезина.
Регуляторные факторы встречаются у контактов
Как мы уже отмечали, флюоресцентная микроскопия в скользящем луче показала, что концы микротрубочек взаимодействуют с контактами чрезвычайно тесно — в пределах десятков нанометров. Поэтому мы предположили, что микротрубочки катализируют реакции в контактах за счет переноса в непосредственную близость с ними молекулярных сигнальных комплексов. Регуляторные молекулы, ассоциированные с микротрубочками, могут быть разделены на три группы: 1) связывающиеся вдоль всей длины микротрубочки; 2) переносимые моторами; 3) компоненты белкового комплекса на плюс-концах микротрубочек.
Присутствие специализированных белков на концах микротрубочек было впервые обнаружено Т. Крайсом и коллегами [31]. Они показали, что СЫР-170 связывается с растущими концами микротрубочек в живых клетках. Другие выявленные с тех пор плюс-концевые белки [11; 37] ведут себя более или менее аналогично: они связываются с растущими концами и диссоциируют, когда полимеризация останавливается. Микроскопия в скользящем луче позволяет доказать, что плюс-концевые комплексы направляются непосредственно в контакты [28], что делает белки-компоненты первыми кандидатами на локальную регуляторную функцию.
Основываясь на последних данных, мы предложили несколько возможных сценариев регуляции, приводящей к дестабилизации и разборке контактов [22; 39]. В качестве потенциальных регуляторов можно упомянуть АвеГ (Ыас-активирующий фактор), который связывается с белком АРС на плюс-концах микротрубочек [25], или 1СЮАР (лиганд для активных Лас и С<3с42), который связывается с СЫР-170 [10]. Увеличение концентрации одного из них в области фокального контакта приводит к локальной активации Ыас. Поскольку Яас является функциональным антагонистом Юю [36], это вызовет локальное подавление сократимости и, соответственно, дестабилизацию контакта.
Другой сценарий основан на том, что некоторые обменные факторы для Юю, а именно р190ЮгоСЕР и вЕР-Ш/Ыс [12; 27; 32; 40] связываются с микротрубочками. Самое интересное, что СЕР-Н1 при таком связывании дезактивируется и может являться фактором, вызывающим сокращение при
Микротрубочка
Актиновый филамент
I
'бО^З-
Фокаль-.
ный
контакт
да»
Натя'
Рисунок 4. Влияние натяжения на динамику микротрубочек.
А. — Приложение внешней силы к телу клетки стимулирует полимеризацию микротрубочек в сторону периферии в клетках меланомы В16. Показаны микротрубочки в клетке, экспрессирующей ЭРР-тубулин, до (0 мин) и после (4 мин) приложения силы. В центре: показано смещение тела клетки микропипеткой (фазово-контрастная микроскопия). Стрелками указано направление натяжения, рамками показано массовое прорастание микротрубочек в ламеллу. Б. — Модель направленной полимеризации микротрубочек. Натяжение в акти-новом цитоскелете вызывает рост микротрубочек. Сила, приложенная к актиновым филаментам, соединенным с контактами, может менять их конформацию. Тогда натянутые филаменты узнает адаптер, соединенный с плюс-концевым комплексом (+) (вероятно, миозином), который связывает две структуры и направляет полимеризацию микротрубочки по актину к контакту. В. — Модель подрастания микротрубочек к контактам (вид сбоку). Показано различие в расположении концов растущей и укорачивающейся микротрубочки. Полимеризация направлена вниз к фокальному контакту и в зону проникновения. Направление обеспечивается закреплением плюс-кон-цевого комплекса за актиновый «рельс». Деполимеризация сопряжена с потерей концевого комплекса и со смещением микротрубочки вверх от «рельса» и от субстрата. При динамической нестабильности деполимеризующиеся микротрубочки могут переключиться в фазу роста (спасение) и вновь войти в цикл для повторного таргетинга. В увеличенной рамке показано взаимное положение фокального контакта и микротрубочки. Фокальный контакт и ось микротрубочки (диаметром около 24 нм) отстоят от субстрата на 15 и 50 нм соответственно. Многочисленные известные белки плюс-концевого комплекса (+), по-видимому, покрывают поверхность микротрубочки более густо, чем на этой схеме. Соединение между микротрубочкой и актином осуществляется посредством одного из компонентов этого комплекса. Таким посредником может быть миозин или иной связующий белок. Микротрубочки могут быть временно стабилизированы в контакте (крюк).
деполимеризации микротрубочек. В этом случае микротрубочки могут «очищать» область контакта от этого фактора и таким образом снижать активность Шю и способствовать динамичности контактов.
Как кинезин-1 способствует этому процессу, остается неясным. Однако было показано, например, что такой фактор, как ШгоО, активирующий ]1ас/Сс1с42, ингибируется при блокировке кинезина-1 [44].
Другой кинезин — КША,В участвует в доставке плюс-концевого белка АРС [17; 30]. Возможно, другие плюс-кон-цевые белки тоже перемещаются с помощью кинезинов.
Фокальные контакты влияют на динамику микротрубочек
Собственно таргетинг включает в себя подрастание конца микротрубочки к контакту и короткую фазу колокализации. Далее, можно рассматривать три возможных сценария: микротрубочка может (1) продолжать расти, (2) впасть в паузу в контакте или (3) претерпеть катастрофу и разобраться. Доставка трех описанных выше групп факторов зависит, таким образом, от динамики микротрубочки. Как мы уже отмечали, важной характеристикой плюс-концевых белков является то, что они высвобождаются, когда растущая микротрубочка переходит к разборке в результате катастрофы. Для доставки факторов этой группы наиболее эффективным способом является повторяющийся таргетинг, при котором фазы спасения следуют сразу за фазами катастроф несколько раз подряд. Спасение может зависеть от наличия такого плюс-концевого белка, как СЫР-170, который обладает способностью индуцировать спасение [26]. Также переключение к разборке может инициироваться фактором катастроф стат-мином [6]. Статмин в свою очередь регулируется РАК — эффектором Иас и Сс1с42 [8], который часто концентрируется в фокальных контактах [2]. Следуя логике рассуждения, можно сделать вывод, что факторы сигнального пути семейства Шю влияют на динамику микротрубочек, замыкая функциональную петлю обратной связи во взаимодействии микротрубочек и контактов.
Картина усложняется еще и тем, что доставка регуляторов с помощью кинезина представляется наиболее эффективной, если микротрубочка остается ассоциированной с контактом долгое время. В связи с этим интересно наше наблюдение способности контактов захватывать и временно стабилизировать микротрубочки [23], что удлиняет промежуток времени, когда возможна доставки сигналов моторами.
Актин задает тон: натяжение и направление роста микротрубочек
Как осуществляется полимеризация микротрубочек в направлении к фокальным контактам? Ключ к пониманию проблемы направленного роста появился из наблюдения, что натяжение актинового цитоскелета оказывает принципиальное влияние на рост микротрубочек. Впервые это было продемонстрировано в упомянутых выше экспериментах с локальной аппликацией ингибиторов сократимости. Краткое локальное расслабление клеточного края с помощью нанесения ВЮМ или МЬ-7 из микрокапилляра вызывало быструю деполимеризацию микротрубочек в этом районе [21]. После удаления ингибитора микротрубочки вновь полиме-ризовались в сторону клеточной периферии.
Более прямо влияние натяжения на динамику микротрубочек было проиллюстрировано при помощи подхода, разработанного А. Бершадским и коллегами [34]. В их работе механическое натяжение, сообщаемое ламелле живых фибробластов с помощью микропипетки, вызывало рост фокальных контактов, подтверждая предсказание Ю. М. Васильева. Более того,
они доказали, что приложение внешней силы в этом эксперименте подменяет функцию миозина. Когда подобный опыт был проделан нами на клетках, экспрессирующих кроме маркера контактов еще и GFP-тубулин, вызванный стрессом рост контактов сопровождался массовой полимеризацией микротрубочек в сторону края клетки (рис. 4) [23]. Количество микротрубочек, подрастающих к контактам на периферии, при этом возрастало в 2—3 раза. В третьей серии экспериментов с использованием растяжимых субстратов в качестве подложки был получен сходный результат. В этом случае напряжение было приложено к клеткам снизу, путем растяжения субстрата. И снова микротрубочки реагировали на стресс усиленной полимеризацией в сторону приложения силы [23].
Относящиеся к вопросу направления полимеризации результаты были получены и при изучении клеток, экспрессирующих GFP-тубулин, путем микроскопии в скользящем луче. Было замечено, что микротрубочки, прорастающие вниз, в 50-нанометровую зону, часто следуют по одному и тому же пути по направлению к контакту, что наводило на мысль об общей направляющей структуре [28]. На основе всех вышеизложенных данных мы предположили что плюс-конец микротрубочки может захватываться механосенсорной молекулой, возможно, специальным миозином (unconventional myosin), который распознает и связывает актиновые фила-менты, испытывающие натяжение. Другим условием является то, что такие актиновые филаменты должны быть присоединены к контактам «оперенным» концом, чтобы движение миозина было направлено к периферии. Поскольку концы микротрубочек редко движутся вдоль стресс-фибрилл, эти натянутые филаменты во многих случаях еще не объединились в крупные пучки. Разработанная нами модель направленного таргетинга похожа на механизм, экспериментально доказанный для дрожжей [19]. В Saccharomyces cerevisiae направленная полимеризация микротрубочек к образующейся почке осуществляется гомологом миозина V, связанным с плюс-концевым комплексом, который использует параллельные оси клетки актиновые пучки как направляющие [19; 45]. Интересно отметить, что и в фибробластах концы деполиме-ризующихся микротрубочек отдаляются от мембраны, позволяя предположить, что потеря плюс-концевого комплекса приводит к разрыву связи микротрубочки с направляющей структурой [28].
Заключение
Общепринятая точка зрения состоит в том, что микротрубочки взаимодействуют с кортикальным актином в различных клетках и при различных обстоятельствах [15]. Наши исследования на фибробластах в культуре указывают, что взаимодействие микротрубочек и актина, предсказанное Ю. М. Васильевым, происходит в специфических местах кортекса, а именно в фокальных контактах. Понимание этого факта позволяет нам теперь сконцентрировать усилия на изучении природы взаимодействия, его причинах и последствиях. Описанные нами данные были получены во многом благодаря прогрессу в технологии записи изображения, а также разработке методов выявления белков в живых клетках. Только одновременная запись взаимного расположения микротрубочек и фокальных контактов в пространстве и во времени
позволяет выявить их связь точно так же, как локализация плюс-концевых белков на растущих микротрубочках ранее не могла быть предсказана по фиксированным препаратам. Сейчас перед нами открываются широкие возможности для проверки наших идей и предположений о взаимодействии микротрубочек и фокальных контактов на живых клетках с использованием преимуществ молекулярных методов для модификации возможных регуляторов.
От себя не могу не добавить: никакие микроскопы, камеры и метки не помогут разобраться в данных, если человек не знает, куда смотреть. Поэтому мне еще раз хочется высказать свою горячую любовь и благодарность человеку, который научил меня видеть. Спасибо Вам, Юрий Маркович!
Ирина Каверина
ЛИ ТЕ РА ТУРА
1. Abercrombie М. The crawling movement of metazoan cells // Proc. R. Soc. Lond. B. - 1980. - Vol. 207. - P. 129-147.
2. Bagrodia S.,Cerione R. A. Pak to the ftiture // Trends Cell Biol. — 1999. — Vol. 9. - P. 350-355.
3. Bershadsky A., Chausovslcy A., Becker E., Lyubimova A., Geiger B. Involvement of microtubules in the control of adhesion-dependent signal transduction//Curr. Biol. — 1996.—Vol. 6. — P. 1279—1289.
4. Burridge K, Fath K, Kelly Т., Nuckolls G., Turner C. Focal adhesions: transmembrane junctions between the extracellular matrix and the cytoskeleton // Annu. Rev. Cell Biol. — 1988. — \bl. 4. — P. 487—525.
5. Burridge K, Chrzanowska-Wodniclca M. Focal adhesions, contractility, and signaling //Annu. Rev. Cell Dev. Biol. — 1996. — Vol. 12. —
P. 463-518.
6. Cassimeris L. The oncoprotein 18/stathmin family of microtubule destabilizers I I Curr. Opin Cell Biol. — 2002. — Vol. 14. — P. 18—24.
7. Danowski B. A. Fibroblast contractility and actin organization are stimulated by microtubule inhibitors // J. Cell Sci. — 1989. — Vol. 93 (Pt. 2). - P. 255-266.
8. Daub H., GevaertK, Vandekerckhove J., SobelA., Hall A. Rac/Cdc42 and p65PAK regulate the microtubule-destabilizing protein stathmin through phosphorylation at serine 16 // J. Biol. Chem. — 2001. —
Vol. 276. -P. 1677-1680.
9. Enomoto T. Microtubule disruption induces the formation of actin stress fibers and focal adhesions in cultured cells: possible involvement of the rho signal cascade //Cell Struct. Funct. — 1996. — Vol. 21. — P. 317—326.
10. Fukata М., Watanabe Т., Noritake J., Nakagawa М., Yamaga М.,
Kuroda S., Matsuura Y, IwamatsuA., Perez F., Kaibuchi K. Racl and Cdc42 capture microtubules through IQGAP1 and CLIP-170 // Cell. — 2002. - Vol. 109. - P. 873-885.
11. Galjart N., Perez F. A plus-end raft to control microtubule dynamics and function // Curr. Opin. Cell Biol. — 2003. — Vol. 15. — P. 48—53.
12. Glaven J. A., Whitehead I., Bagrodia S., Kay R., Cerione R. A. The Dbl-related protein, lie, localizes to microtubules and mediates the activation of Rac signaling pathways in cells // J. Biol. Chem. — 1999. — Vol. 274. — P. 2279-2285.
13. Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton // Science. — 1998. — Vol. 279.-P. 509-514.
14. Hirokawa N. Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport // Science. — 1998. — Vol. 279. —
P. 519-526.
15. Hwang E., Kusch J., Barral Y, Huffaker Т. C. Spindle orientation in Saccharomyces cerevisiae depends on the transport of microtubule ends along polarized actin cables // J. Cell Biol. — 2003. — \Ы. 161. —
P. 483-488.
16. Izzard C. S., Lochner L. R. Formation of cell-to-substrate contacts during fibroblast motility: an interference-reflection study // J. Cell Sci. — 1980.-Vol. 42.-P. 81-116.
17. Jimbo T., Kawasaki Y., Koyama R., Sato R., Takada S., HaraguchiK, Akiyama T. Identification of a link between the tumour suppressor APC and the kinesin superfamily// Nat. Cell Biol. — 2002. — \bl. 4. — P. 323—327.
18. KarcherR. L., Deacon S. W., Gelfand V. I. Motor-cargo interactions: the key to transport specificity // Trends Cell Biol. — 2002. — Vol. 12. — P. 21-27.
19. Kaverina I., Krylyshkina O., Beningo K, Anderson K, Wang Y.-L., Small J. V. Tensile stress stimulates microtubule outgrowth in living cells //1. Cell Sci. - 2002. - Vol. 115. - P. 2283-2291.
20. Kaverina I., Krylyshkina O., Gimona M., Beningo K., Wang Y. L.,
Small J. V. Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules // Curr. Biol. — 2000. — Vol. 10. — R 739—742.
21. Kaverina L, Krylyshkina O., Small J. V. Microtubule targeting of substrate contacts promotes their relaxation and dissociation //J. Cell Biol. - 1999. - Vol. 146. - P. 1033-1044.
22. Kaverina I., Krylyshkina O., Small J. V. Regulation of substrate adhesion dynamics during cell motility // Int. J. Biochem. Cell Biol. —
2002. — Vol. 34. - P. 746-761.
23. Kaverina 1., RottnerK, Small J. V. Targeting, capture, and stabilization of microtubules at early focal adhesions // J. Cell Biol. — 1998. — Vol. 142.-P. 181-190.
24. Kaverina I. N., Minin A. A., Gyoeva F. K, Vasiliev J. M. Kinesin-asso-ciated transport is involved in the regulation of cell adhesion // Cell Biol. Int. - 1997. - Vol. 21. - P. 229-236.
25. Kawasaki Y., Senda T., Ishidate T., Koyama R., Morishita T.,
Iwayama Y., Higuchi O., Akiyama T. Asef, a link between the tumor suppressor APC and G-protein signaling // Science. — 2000. —
Vol. 289.-P. 1194-1197.
26. Komarova Y. A. , Akhmanova A. S., Kojima S., Galjart N., Borisy G. G. Cytoplasmic linker proteins promote miorotubule rescue in vivo //
I. Cell Biol. - 2002. - Vol. 159. - P. 589-599.
27. Krendel M., Zenke F. T., Bokoch G. M. Nucleotide exchange factor GEF-H1 mediates cross-talk between microtubules and the actin cytoskeleton 11 Nat. Cell Biol. — 2002. — Vol. 4. — P. 294—301.
28. Krylyshkina O., Anderson K. I., Kaverina 1., Upmann I., Manstein D. J., Toomre D. K, Small J. V. Nanometer targeting of microtubules to focal adhesions I I J. Cell Biol. — 2003. — Vol. 161. — P. 853—859.
29. Krylyshkina O., Kaverina I., Kranewitter W., Steffen W., Alonso M. C., Cross R. A., Small J. V. Modulation of substrate adhesion dynamics via microtubule targeting requires kinesin-1 // J. Cell Biol. — 2002. —
Vol. 156.-P. 349-360.
30. Mimori-Kiyosue Y., Shiina N., Tsukita S. Adenomatous polyposis coli (APC) protein moves along microtubules and concentrates at their growing ends in epithelial cells // J. Cell Biol. — 2000. — Vol. 148. —
P. 505-518.
31. PerezF., Diamantopoulos G. S., StalderR., Kreis T. E. CLIP-170 highlights growing microtubule ends in vivo I j Cell. — 1999. — Vol. 96. —
P. 517-527.
32. Ren Y., Li R., Zheng Y., Busch H. Cloning and characterization of GEF-H1, a microtubule-associated guanine nucleotide exchange factor for Rac and Rho GTPases // J. Biol. Chem. — 1998. — Vol. 273. —
P. 34 954-34 960.
33. Rinnerthaler G., Geiger B., Small J. V. Contact formation during fibroblast locomotion: involvement of membrane ruffles and microtubules// J. Cell Biol. - 1988. - Vol. 106. - P. 747-760.
34. Riveline D., Zamir E., Balaban N. Q., Schwarz U. S., Ishizaki T., Narumiya S., Kam Z., Geiger B., Bershadsky A. D. Focal contacts as mechanosensors: externally applied local mechanical force induces growth of focal contacts by an mDial -dependent and ROCK-independent mechanism//J. Cell Biol. - 2001. - Vol. 153. - P. 1175-1186.
35. Rodionov V. I., Gyoeva F. K, Tanaka E., Bershadsky A. D., Vasiliev J. M., Gelfand V. I. Microtubule-dependent control of cell shape and pseudopo-dial activity is inhibited by the antibody to kinesin motor domain //
J. Ceil Biol. - 1993. - Vol. 123. - P. 1811-1820.
36. Sander E. E., ten KloosterJ. P., van Delft S., van derKammen R. A., Collard J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior // J. Cell Biol. - 1999. - Vol. 147. - P. 1009-1022.
37. Schuyler S. C., Pellman D. Microtubule «plus-end-tracking proteins»: The end is just the beginning // Cell. — 2001. — Vol. 105. — P. 421—424.
38. Small J. V, Rinnerthaler G. Cytostructural dynamics of contact formation during fibroblast locomotion in vitro // Expl. Biol. Med. — 1985. — Vol. 10. - P. 54-68.
39. Small J. V, Kaverina I. Microtubules meet substrate adhesions to arrange cell polarity // Curr. Opin. Cell Biol. — 2003. — Vol. 15. — P. 40—47.
40. van Horck F. P., Ahmadian M. R., Haeusler L. C., Moolenaar W. H., KranenburgO. Characterization of pl90RhoGEF, a RhoA-specific guanine nucleotide exchange factor that interacts with microtubules // J. Biol. Chem. - 2001. — Vol. 276. - P. 4948-4956.
41. Vdsiliev J. M. Spreading of non-transformed and transformed cells // Biochim. Biophys. Acta. — 1985. — Vol. 780. — P. 21—65.
42. VasilievJ. M., Gelfand I. M. Effects of colcemid on morphogenetic processes and locomotion of fibroblasts // Goldmam R. (ed.). Cell Motility. — Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory. — 1976. — P. 279—304.
43. VerheyK. J., MeyerD., DeehanR., BlenisJ., SchnappB. J., Rapoport T.A., Margolis B. Cargo of kinesin identified as JIP scaffolding proteins and associated signaling molecules // J. Cell Biol. — 2001. — Vol. 152. — P. 959-970.
44. Vignal E., BlangyA., Martin M., Gauthier-Rouviere C., Fort P. Kinectin is a key effector of RhoG microtubule-dependent cellular activity // Mol. Cell Biol. - 2001. - Vol. 21. - P. 8022-8034.
45. Yin H., Pruyne D., Huffaker T. C., BretscherA. Myosin V orientates the mitotic spindle in yeast // Nature. — 2000. — Vol. 406. — P. 1013—1015.
