CC BY
60
Выявление различных видов риккетсий у иксодовых клещей, в крови людей и мелких млекопитающих на юге Западной Сибири и на Урале
11 ^ -j
Иголкина Я.П. , Фоменко Н.В. , Ливанова Н.Н. , Астанин В.Б. , Гостеева Л.А.4, Черноусова Н.Я.5, Рар В.А.1
Detection of different rickettsia species from ixodid ticks, human blood and blood of small mammals in the South-Western Siberia and Ural
Igolkina Ya.P., Fomenko N. V., Livanova N.N., Astanin V.B., Gosteeva L.A., Cher-nousova N. Ya., Rar V.A.
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск
2 Институт систематики и экологии животных СО РАН, г. Новосибирск
3 Территориальное управление Роспотребнадзора по Новосибирской области, г. Новосибирск
4 Центральная клиническая больница СО РАН, г. Новосибирск
5 Муниципальная инфекционная клиническая больница № 1, г. Новосибирск
© Иголкина Я.П., Фоменко Н.В., Ливанова Н.Н. и др.
Методом двухраундовой ПЦР исследованы клещи, образцы крови людей и образцы крови и тканей мелких млекопитающих. Выявлена высокая частота встречаемости Rickettsia tarasevichiae в Ixodes persulcatus и Rickettsia sp.RpA4 в Derma-centor reticulatus. ДНК патогенных Rickettsia helvetica и Rickettsia slovaca выявлена в клещах I. persulcatus и Dermacentor marginatus. В крови человека, а также в крови и печени мелких млекопитающих обнаружена ДНК Rickettsia sibirica.
Ключевые слова: риккетсии, иксодовые клещи, группа клещевой пятнистой лихорадки, мелкие млекопитающие,
ПЦР.
We investigated ticks, human blood samples, specimens of tissue and blood from small mammals using nested PCR. We detected high prevalence Rickettsia tarasevichiae and Rickettsia sp. RpA4 in samples of ticks Ixodes persulcatus and Dermacentor reticulatus, correspondingly. We observed DNA of pathogenic Rickettsia helvetica and Rickettsia slovaca in I. persulcatus and Dermacentor marginatus and DNA of Rickettsia sibirica in human blood and in blood and liver samples of small mammals.
Key words: rickettsia, ixodid ticks, spotted fever group, small mammals, PCR.
УДК 616.981.71/.988.25 (571)
Риккетсиозы — трансмиссивные инфекционные заболевания, вызываемые облигатными внутриклеточными бактериями, принадлежащими к роду Rickettsia семейства Rickettsiacea порядка Rickettsials.
Представители порядка Rickettsials — грамотри-цательные бактерии, имеющие кокковидную или палочковидную форму, чаще всего представляют собой короткие палочки 0,3—0,6 мкм в ширину и 0,8—2,0 мкм в длину. Экологической микронишей для риккетсий служит цитоплазма, а для ряда из них — ядро эука-риотической клетки. Размер генома риккетсий составляет от 1 100 до 1 600 тыс. п.н. Многие виды риккетсий выявляются исключительно в насекомых или клещах,
однако некоторые риккетсии являются возбудителями трансмиссивных инфекций человека и теплокровных животных [1].
Род Rickettsia включает три группы: группу сыпного тифа, группу клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) и группу неклассифицированных риккетсий [3, 14]. К группе сыпного тифа относятся два вида риккетсий: R. typhi — возбудитель крысиного сыпного тифа — передается человеку через блох. R. prowazekii вызывает эпидемический сыпной тиф, переносимый платяными вшами. В группу неклассифицированных риккетсий входят ряд риккетсий, переносимых клещами (R. bellii, R. canadensis и R. tarasevichiae и др.),
а также риккетсии эндосимбионты и паразиты грибов, амфизойных амеб, плодовых мушек, жуков и др.
[3, 14].
В настоящее время большинство риккетсий, ассоциированных с клещами, относят к группе КПЛ. Иксо-довые клещи вследствие исключительной способности к трансфазовой и трансовариальной передаче риккет-сий служат для последних не только переносчиками, но и природным резервуаром возбудителя [1]. Риккет-сии инфицируют почти все органы клещей, включая слюнные железы, и передаются позвоночным при присасывании [13].
В природных очагах риккетсии могут существовать не только в трехчленной паразитарной системе позвоночные — риккетсии — членистоногие, но и длительное время сохраняться в клещах исключительно за счет трансовариальной передачи [1]. Роль позвоночных как природных резервуаров риккетсий мало изучена [7, 10]. Известно, что у животных инфекция может вызывать кратковременную риккетсие-мию [12]. По-видимому, значение млекопитающих, в первую очередь грызунов, ограничено ролью временного резервуара инфекции. Однако млекопитающие имеют большое значение для поддержания циркуляции риккетсий в природе, так как обеспечивают прокормление иксодовых клещей — основных резервуаров и переносчиков инфекции. Последнее обстоятельство представляется особенно существенным, если учесть, что частота трансовариальной передачи возбудителя у клещей подвержена довольно резким колебаниям [1].
По степени патогенности риккетсии представлены широким спектром микроорганизмов — от классических и новых патогенов до симбионтов клеток эукари-от
[3, 14]. Патогенность для человека значительной части или даже большинства риккетсий пока не доказана. Непатогенные формы нередко встречаются на той же территории, где и возбудители заболеваний [3].
Человеку риккетсии группы КПЛ передаются при укусах инфицированными клещами. Риккетсии через лимфатическую систему проникают в кровь и затем в эндотелий сосудов органов и тканей. Основной мишенью для инфекции являются эндотелиальные клетки, хотя макрофаги, гепатоциты и клетки гладкой мускулатуры также могут быть инфицированы [9, 19]. Поражение эндотелия служит причиной повреждения
сосудов, приводящего к повышению их проницаемости. Клинические симптомы риккетсиозов включают лихорадку, первичный аффект на месте укуса, региональный лимфаденит, полиморфную сыпь, головную и мышечную боль.
Риккетсиозы диагностируются на основе клинических, эпидемиологических и лабораторных данных [5]. Для детекции и идентификации риккетсий применяются серологические (РСК, РНИФ, иммуноблот-тинг) и молекулярно-генетические (ПЦР, рестрикци-онный анализ и определение нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР) методы. Развитие ПЦР сделало возможным открытие новых видов, а также признание уже известных видов как патогенов человека [9].
На территории Урала и юга Западной Сибири распространены риккетсии, патогенность которых не установлена: Rickettsia sp. RpA4, Rickettsia sp. DnS14, Rickettsia sp. DnS28 и R. tarasevichiae, а также патогенные риккетсии группы КПЛ: R. slovaca и R. sibirica [5, 6, 15—18].
В данной работе приведены результаты выявления ДНК риккетсий в образцах от имаго клещей рода Dermacentor и таежных клещей Ixodes persulcatus, собранных на юге Западной Сибири (Новосибирская и Омская области), на Южном (Челябинская область) и Северном Урале (Свердловская область, территория заповедника «Денежкин камень»). Помимо этого, исследованы образцы крови и печени мелких млекопитающих, отловленных в Свердловской и Новосибирской областях и на Алтае. Результаты были получены с помощью метода двухраун-довой ПЦР с использованием праймеров, соответствующих фрагментам генов цитратсинтазы (gltA) [4] и поверхностного белка rOmpA, а также метода определения нуклеотидных последовательностей продуктов ПЦР.
По данным С.Н. Шпынова [18], примерно в 50% образцов D. reticulatus и 43% D. marginatus в Новосибирской области выявлена ДНК Rickettsia sp. RpA4. По результатам настоящего исследования, ДНК Rick-ettsia sp. RpA4 выявлена в 42—52% образцов D. reti-culatus в Омской и Новосибирской областях и в 3 % D. marginatus — в Челябинской области (таблица).
R. tarasevichiae — недавно открытый вид риккет-сий, который наиболее близок к патогенной R. cana-densis. Ранее ДНК R. tarasevichiae была выявлена в
9,0—20,5% имаго I. persulcatus, собранных на территории Южного Урала и Сибири [17]. В данном исследовании методом двухраундовой ПЦР с использованием специфичных для R. tarasevichiae праймеров была выявлена ДНК R. tarasevichiae в 46—90% клещей
Детекция и идентификация риккетсий в клещах, в крови людей и мелких млекопитающих
Источник Место сбора Общее чис- Число положительных проб
выделения (область) ло проб R. tarasevichiae R. helvetica Rickettsia sp.RpA4 R. slovaca R. sibirica
Новосибирская 40 36 — — — —
I. persulcatus Свердловская 35 16 — — — —
Челябинская 36 23 1 — — —
D. marginatus Челябинская 30 1 — 1 1 —
D. reticulatus Новосибирская Омская 31 24 1 — 16 10 — —
Кровь мелких млекопитающих Новосибирская Свердловская Алтай 64 104 28 3 1 — — — 1
Печень мелких млекопитающих Свердловская 36 1 — — — 1
Кровь людей Новосибирская Алтай 8 3 — — — — 1
I. persulcatus, собранных в Свердловской, Челябинской и Новосибирской областях, а также по одному образцу от клещей D. marginatus и D. ки^Шт из Челябинской и Новосибирской областей.
Кроме того, ДНК R. tarasevichiae выявлена в 3% образцов крови красных полевок Clethrionomys rutilus, отловленных в Свердловской области [4] и на Алтае, а также в 3% образцов печени Cl. rutilus из Свердловской области (таблица). Таким образом, авторами настоящей статьи впервые описаны случаи обнаружения ДНК R. tarasevichiae в клещах рода Dermacentor и образцах тканей мелких млекопитающих.
В образце от имаго I. persulcatus из Челябинской области была обнаружена ДНК R. helvetica. Этот возбудитель был выделен из тканей сердца двух молодых людей, которые умерли от внезапной сердечной недостаточности [2]. В настоящее время лишь предполагают, что R. helvetica связана с заболеваниями человека. R. helvetica была выявлена в клещах Ixodes ricinus во многих европейских странах [11]. Однако стало известно, что ее распространение не ограничивается территорией Европы. Так, риккетсии, идентичные и близкие к R. helvetica, были изолированы из клещей I. ovatus, I. persulcatus и I. monospinosis в Японии [8]. При сравнении полученной в настоящей работе нук-леотидной последовательности фрагмента гена gltA R. helvetica (DQ131912) с ранее известными оказалось, что найденная последовательность отличалась одной
нуклеотидной заменой от последовательности гена gltA (U59723) штамма C9P9, изолированного от I. rici-nus (рисунок).
R. slovaca, недавно признанная патогенной для человека, вызывает заболевание TIBOLA (tick-borne lymphadenopathy). Переносчиками данного возбудителя являются клещи D. marginatus и D. reticulatus. R. slovaca обнаружена в образцах от D. marginatus в европейской части России (Воронежская область, Ставропольский край) [6, 16]. Кроме того, описан случай изоляции риккетсий вида R. slovaca от клещей D. marginatus на Урале (Курганская область) [6]. ДНК этого патогена была обнаружена в ходе нашего исследования в 3% D. marginatus, собранных в Челябинской области (см. таблицу).
R. sibirica — этиологический агент клещевого риккетсиоза. Данное заболевание распространено преимущественно в азиатской части России. Высокие показатели заболеваемости клещевым риккетсиозом, (более 30 случаев на 100 тыс. населения) отмечены в Алтайском крае, республиках Алтай, Хакасия и Еврейской АО. Основным резервуаром и эпидемически значимыми переносчиками R. sibirica являются клещи родов Dermacentor (D. nutallii, D. marginatus, D. silva-
rum и D. reticulatus) и Haemaphysalis (H. concinna) [5]. Имеются данные об инфицированности R. sibirica клещей рода Ixodes, в частности I. persulcatus, в Новосибирской области и в Алтайском крае [5, 6]. На территории Сибири описаны очаги клещевого риккетсио-за
с высоким уровнем инфицированности клещей-переносчиков R. sibirica. Так, в 12% клещей D. nutallii на Алтае выявлена ДНК R. sibirica [15], а в Красноярском крае уровень зараженности этих же клещей возбудителем клещевого риккетсиоза составляет 5—17%. В настоящем исследовании не выявлена ДНК R. sibirica ни в одном из 196 проанализированных клещей, собранных в Новосибирской, Омской, Свердловской и Челябинской областях. Однако ДНК R. sibirica была обнаружена в одном образце крови Cl. rutilus и в одном образце печени обыкновенной бурозубки So-rex araneus, отловленных в Свердловской области на северной границе ареала распространения I. persul-catus.
ДНК R. sibirica была обнаружена также в 1 из 11 исследованных образцов крови больных с характерной для клещевого риккетсиоза полиморфной сыпью, госпитализированных в ЦКБ СО РАН и МИКБ № 1 г. Новосибирска после укусов клещами. Троим из 11 пациентов (в том числе и больному, в крови которого детектирована ДНК R. sibirica) поставлен диагноз клещевого риккетсиоза, однако при проведении РСК с R. sibirica в качестве антигена были получены отрицательные результаты.
Следует отметить, что нуклеотидные последовательности фрагмента гена gltA (830 п.н.) R. sibirica из
крови человека (DQ127824) и Cl. rutilus (DQ124930) отличались между собой четырьмя нуклеотидными заменами, а от единственной определенной ранее последовательности (U59734) — двумя нуклеотидными заменами (см. рисунок). Причем одна замена в нук-леотидной последовательности R. sibirica фрагмента гена gltA из образца крови человека приводила к аминокислотной замене со сменой класса аминокислоты (Glu ^ Gly). Нуклеотидная последовательность фрагмента гена ompA (530 п.н.) R. sibirica из крови человека полностью соответствовала определенной ранее последовательности (U83455).
Таким образом, в изучаемых районах Урала и юга Западной Сибири была выявлена высокая частота встречаемости риккетсий с неизвестной патогенно-стью R. tarasevichiae и Rickettsia sp. RpA4 в клещах I. persulcatus и D. reticulatus. ДНК патогенных риккет-сий
R. helvetica и R. slovaca была выявлена в клещах I. per-sulcatus и D. marginatus соответственно. В крови людей, а также в крови и тканях мелких млекопитающих была обнаружена ДНК R. sibirica.
90
30 24 52
76
99
Dm-23 (DQ176434)
R. slovaca (U59725)
75
■ R. sibirica (U59734) -Ub-24 (DQ124930)
Hb-2 (DQ127824) — Rickettsia sp. DnS28 (AF120027) Rickettsia sp. RpA4 (AF120029) L Rickettsia sp. DnS14 (AF120028) R. rickettsii (U59729)
64
r Ip-4 (DQ131912)
■ R. helvetica (U59723)
Бюллетень сибирской медицины, 2006. Приложение 1
- R. canadensis (U59713)
100
100
100
Dr-18
R. tarasevichiae (AF503167)
—I
0,00
0,04
0,03
0,02
0,01
Филогенетическое дерево, построенное на основании нуклеотидных последовательностей фрагмента гена gltA (817 п.н.) риккетсий, с использованием метода UPMGA. Для построения филогенетического дерева использовались нуклеотидные последовательности фрагмента гена gltA ДНК риккетсий, выделенных из клещей Dermacentor marginatus (Dm-23), Dermacentor reticulates (Dr-18) и Ixodes persulcatus (Ip-4), а также из образцов крови человека (Hb-2) и красной полевки Clethrionomys rutilus (Ub-24)
Несмотря на высокую частоту встречаемости R. tarasevichiae в клещах I. persulcatus, ДНК этого вида риккетсий была выявлена лишь в 3 из 168 образцов крови мелких млекопитающих из ареала распространения I. persulcatus, что может быть обусловлено низким уровнем риккетсиемии либо коротким временем циркуляции риккетсий в крови. Представляет особый интерес случай выявления в крови и печени мелких млекопитающих ДНК R. sibirica, так как основные переносчики этого патогенна — клещи рода Dermacentor — на Северном Урале не обитают.
Литература
1. Балашов Ю.С., Дайтер А.Б. Кровососущие членистоногие и риккетсии. Л.: Наука, 1973. 251 с.
2. Гратц Н.Г. Возникающие и возобновляющиеся трансмиссивные заболевания в Европе // Успехи соврем. биологии. 2005. Т. 125. № 1. С. 3—13.
3. Коренберг Э.И. Преадаптивное происхождение возбудителей природно-очаговых зоонозов // Успехи соврем. биологии. 2005. Т. 125. № 2. С. 131—139.
4. Ливанова Н.Н., Рар ВА, Ливанов С.Г., Иголкина Я.П. Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus Shculze на Северном Урале // Сиб. экол. журн. 2005 Т. 10. № 5. С. 1079—1084.
5. РудаковН.В., ОбертА.С. Клещевой риккетсиоз. Омск: ОмГМА, 2001. 120 с.
6. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В., Самойленко И.Е. и др. Генетическая идентификация риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки, изолированных в очагах клещевого риккетсиоза // Журн. микробиологии. 2004. № 5. С. 43—48.
7. Brouqui P., Bacellar F., Baranton G. et al. Guidelines for the diagnosis of tick-borne bacterial diseases in Europe // Clin. Microbiol. Infect. V. 10. № 12. P. 1108—1132.
8. Fournier P.E., Fujita H., Takada N., RaoultD. Genetic iden-
tification of rickettsiae isolated from ticks in Japan // J. Clin. Microbiol. 2002. V. 40. № 6. P. 2176—2181.
9. KatzB., Waites K. Emerging intracellular bacterial infections // Clin. Lab. Med. 2004. V. 24. № 3. P. 627—649.
10. Parola P., RaoultD. Ticks and tickborne bacterial diseases in humans: an emerging infectious threat // Clinical Infectious Diseases. 2001. V. 32. № 5. P. 897—928.
11. Parola P., Paddock C.D. and Raoult D. Tick-borne rickettsi-osis around the world: emerging diseases challenging old concepts // Clin. Microbiol. Rev. 2005. V. 18. № 4. P. 719—756.
12. Parola P., Davoust B., Raoult D. Tick- and flea-borne rickettsial emerging zoonoses // Vet. Res. 2005. V. 36. № 3. P. 469—492.
13. RaoultD., Roux V. Rickettsioses as paradigms of new or emerging infectious diseases // Clin. Microbiol. Rev. 1997. V. 10. № 4. P. 694—719.
14. Rudakov N.V., Shpynov S.N., Samoilenko I.E., Tanki-baev M.A. Ecology and epidemology of spotted fever group Rickettsia and new data from their study in Russia and Kazakhstan // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V. 990. P. 12—24.
15. Rydkina E., Roux V., Fetisova N., Rudakov N. New Rickettsiae in ticks collected in territories of the Former Soviet Union // Emerging Infectious Diseases. 1999. V. 5. № 6. P. 811— 814.
16. Shpynov S., Parola P., Rudakov N. et al. Detection and identification of spotted fever group Rickettsiae in Dermacentor ticks from Russia and Central Kazakhstan // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2001. V. 20. P. 903—905.
17. Shpynov S., Fournier P., Rudakov N., Raoult D. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V. 990. P. 162—172.
18. Shpynov S., Fournier P., Rudakov N. et al. Detection of a Rickettsia closely related to Rickettsia aeschlimannii, «Rickettsia heilongjiangensis», Rickettsia sp. strain RpA4, and Ehrlichia muris in ticks collected in Russia and Kazakhstan // J. Clin. Microbiol. 2004. V. 42. № 5. P. 2221—2223.
19. Walker D.H., Valbuena G.A., Olano J.P. Pathogenic mechanisms of diseases caused by Rickettsia // Ann. N.Y. Acad. Sci. 2003. V. 990. P. 1—11.
Поступила в редакцию 0б.01.200б г.
