CC BY
72
УДК 616.062:616.604
С.С. Шулунов, И.А. Хаснатинов, Г.А. Данчинова, И.В. Козлова, Р.В. Адельшин, С.И. Беликов
РАЗНООБРАЗИЕ РИККЕТСИЙ В ИКСОДОВЫХ КЛЕЩАХ НА ТЕРРИТОРИИ ПРИБАЙКАЛЬЯ
Институт эпидемиологии и микробиологии ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (Иркутск)
Лимнологический институт СО РАН (Иркутск)
С помощью полимеразной цепной реакции была изучена зараженность риккетсиями клещей Dermacentor nuttalli, D. silvarum и Ixodes persulcatus в южной части Иркутской области и. в сопредельных районах республики. Бурятия. Обнаруженные микроорганизмы, были, генотипированы на основе анализа нуклеотидной, последовательности гена rOmpA. В результате были, выявлено 5 различных риккетсий: R. sibirica, R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. sp. «AT-1-подобный», R. sp. «candidatus R. tarasevichae». Фоновыми являются риккетсии групп R. sp. DnS14 и. R. sp. DnS28, которыми заражено около 60 % клещей D. nuttalli и. D. silvarum.. Риккетсиями R. sp. «AT-1-подобный» и R. sp. «candidatus R. tarasevichae» инфицированы. 27,5 % клещей I. persulcatus.
Ключевые слова: риккетсии, иксодовые клещи, генотип
DIVERSITY OF RICKETTSIA IN IXODES TICK IN BAIKAL AREA
S.S. Shulunov, M.A. Khasnatinov, G.A. Danchinova, I.V. Kozlova, R.V. Adelshin, S.I. Belikov
Institute of Epidemiology and Microbiology of SC ME ESSC SB RAMN, Irkutsk
Limnological Institute of SB RAN, Irkutsk
A total of 162 adult questing ticks of species Dermacentor nuttalli, D. silvarum., Ixodes persulcatus collected, from East Siberia (Irkutsk region) has been analysed, by PCR and sequence analysis for presence of microorganisms of order Rickettsiales. Rickettsial DNA were detected, in 64 % of D. silvarum., 75 % of D. nuttalli and. 27,5 % of I. persulcatus ticks. Analysis of rOmpA gene fragment sequences revealed, the presence of 5 different microorganisms: R. sibirica, R. sp. DnS14, R. sp DnS28, R. sp. «candidatus R. tarasevichae» and. new rickettsia R. sp. «AT-1-like». The first three are associated, with. Dermacentor sp. ticks, while the last two — with I. persulcatus.
Key words: rickettsia, ixodes ticks, genotype
Риккетсии являются облигатными внутриклеточными а-1-протеобактериями и относятся к порядку Rickettsiales. Некоторые из них при попадании в организм человека способны вызывать инфекционный процесс. В последние годы в России наблюдается значительный рост заболеваемости клещевыми инфекциями, особенно актуальны проблемы этих заболеваний для здравоохранения Сибири и Дальнего Востока. В Прибайкалье регистрируется клещевой риккетсиоз (КР) или клещевой сыпной тиф, вызываемый R. sibirica. Это заболевание, наряду с клещевым энцефалитом и клещевым боррелиозом, является одной из природноочаговых инфекций, переносимых иксодовыми клещами. Показатель заболеваемости КР по Иркутской области вырос более чем в 2,5 раза за последние 10 лет, особенно высокий рост, превышающий среднероссийский показатель в 20 раз, отмечен на территории Усть-Ордынского Бурятского Автономного округа (УОБАО) [1].
С развитием молекулярно-биологических методов к 90-м годам XX века расширились представления о многообразии риккетсий как в мире, так и на территории России. В настоящее время на территории страны в иксодовых клещах выявлено не менее 9 видов риккетсий, из них экологически связанные с клещами P. Dermacentor — R. sibirica, DnS14, DnS28, R. slovaca, Rickettsia sp. RpA4; с кле-
щами P. Haemaphysalis — R. heilongjiangensis; с клещами P. Ixodes — R. helvetica, R. sp. «candidatus Rickettsia tarasevichiae», риккетсия, близкая к Rickettsia sp. AT-1. Среди них, наряду с классическим патогеном человека R. Sibirica, выявлены так называемые «новые» патогены: R. slovaca, R. helvetica, R. heilongjiangensis, причастность которых к заболеваниям людей недавно доказана [5].
В нашем регионе ранее проводилось изучение возбудителя клещевого риккетсиоза — R. sibirica, данных по распространению других видов риккет-сий практически нет. В связи с этим авторами проведено исследование на наличие основных переносчиков риккетсий — иксодовых клещей, доставленных из различных точек региона.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Сбор клещей проводили с помощью фланелевого флага по общепринятой методике [4] с незначительными модификациями.
Район исследований охватывал типичные стации обитания различных видов иксодовых клещей в южной части Иркутской области, а также в сопредельных районах республики Бурятия. Всего было исследовано 162 клеща трех видов: Dermacentor nuttalli, D. silvarum, Ixodes persulcatus.
Выделение ДНК проводили индивидуально из каждого клеща по Дойлу-Диксону [6] с модифика-
циями. В деталях: клеща промывали в 70% этаноле, высушивали, гомогенизировали в 250 мкл 2Х СТАВ-буфера (100 mM Tris HCl (pH = 8.0); 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; 2% CTAB; 0,2% Р-меркаптоэта-нол) и инкубировали при 65 °С в течение 20 мин. Затем проводили экстракцию белков 500 мкл. смеси фенол — хлороформ (1:1). К верхней (водной) фазе добавляли равный объем изопропанола, инкубировали в течение 20 мин. при —20 °С, центрифугировали в течение 15 мин. при 10000 — 12000 об./мин. (микроцентрифуга) и промывали осадок 1 мл 70% этанола. Полученный осадок ДНК подсушивали в течение 5 мин. при 65 °С и растворяли в 30 мкл автоклавированной бидистиллиро-ванной воды. 1—3 мкл полученного раствора использовали в ПЦР в качестве матрицы. Также для выделения ДНК использовали коммерческие наборы «ДНК-сорбент» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора)
ДНК риккетсий амплифицировали в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами Rick33f (5-GCAATACAACAAGGTCTTAAAGCCGC-3) и Rick532r- (TGCAGCATTCGCTCCCCCTAAAG-3), комплементарными консервативным участками гена поверхностного мембранного белка rOmpA риккет-сий. Реакцию проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2,5 мкл 10 х PCR буфера (0,1 М Трис-HCl pH 8.8, 0,02 М MgCl2, 0,5 М KCl); 0,5-1 мкл смеси 4-х dNTP (10 мМ каждого) до конечной концентрации 0,2-0,4 мМ; 0,5 мкл каждого олигонуклеотид-ного праймера с концентрацией 10 мкМ; 1-5 мкл раствора ДНК; 1-2 единицы активности (ед. акт.) Taq ДНК-полимеразы и бидистиллированую стерильную воду до объема 25 мкл. К реакционной смеси добавляли 2 капли вазелинового масла для предотвращения испарения жидкости. Амплификацию проводили в термоциклере «Терцик» по следующей программе: 3 мин инициальной денатурации при 94 °С, затем 35 повторяющихся циклов: денатурация (94 °С) — 30 сек., отжиг праймеров (50 °C) — 30 сек., элонгация (72 °С) - 1 мин. По окончании последнего цикла пробы инкубировали при 72 °С в течение 3-5 минут для завершения полимеризации целевых фрагментов. Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Целевые фрагменты (ампликоны) длиной 499 п.н. вырезали из агарозы и очищали с помощью QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) согласно инструкции.
Идентификацию обнаруженных микроорганизмов проводили на основе филогенетического
анализа первичной нуклеотидной последовательности ампликонов. Секвенирование проводили с помощью автоматического секвенатора Applied Biosystems Model 373A с набором реактивов Thermo Sequenase II Dye Terminator Cycle Sequencing Premix Kit (Amersham Pharmacia Biotech Inc.). Анализ полученных последовательностей проводили с использованием программ BioEdit 7.0, Treecon 1.3. Для установления генетических дистанций между последовательностями использовали модель Джукса-Кантора [7], топологию филогенетического древа рассчитывали с помощью метода neighbour-joining. Достоверность анализа проверяли с помощью бутстреп-анализа на основе 100 повторов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Зараженность клещей D. silvarum, которые были отловлены в лугово-болотных и лесостепных биотопах, в среднем составила 64 %, зараженность клещей D. nuttalli из типичных степных стаций — 73 %. Уровень зараженности таежных клещей Ixodes persulcatus риккетсиями составил 27,5 %.
Часть образцов (19 ампликонов) была геноти-пирована, результаты приведены в таблице 1. В целом результаты указывают на то, что фоновыми видами в Прибайкалье являются риккетсии групп R. sp. DnS14 и R. sp. DnS28. Эти риккетсии были обнаружены в 15 клещах D. nuttalli и D. silvarum, тогда как R. sibirica была выявлена только в одном клеще D. silvarum. На основе филогенетического анализа мы установили, что риккетсии данных групп практически идентичны недавно опубликованным последовательностям нового вида Rickettsiaraoultii (номер GenBank DQ365802.). Судя по всему, данные риккетсии очень широко распространены в Евразии и могут инфицировать широкий спектр клещей рода Dermacentor — один из изолятов был выделен из D. reticulatus, мы обнаружили их в D. nuttalli и D. silvarum.
В пяти клещах I. persulcatus были обнаружены новые риккетсии, не относящиеся ни к одному из описанных к настоящему времени видов, групп или неклассифицированных риккетсий. Наиболее близкородственными по структуре гена rOmpA являются микроорганизмы Rickettsia sp. AT-1. Эта риккетсия с неустановленной патогенностью была впервые изолирована из клещей Amblyomma testudinarium в Японии в 1993 году [3]. Для более подробного изучения обнаруженных микроорга-
Таблица 1
Разнообразие риккетсий в Прибайкалье
Вид клеща Всего исследовано Заражено (%) R. sibirica R. sp. DnS28 R. sp. DnS14 R. sp. «AT-1 подобный»
D. nuttalli 12 9 (75 %) 0 4 2 0
D. silvarum 92 59 (64 %) 1 2 7 0
I. persulcatus 58 16 (27,5 %) 0 0 0 5
низмов мы попытались получить из этих же клещей фрагменты гена 16S рибосомальной РНК рик-кетсий. Это удалось только для двух образцов. Проанализировав нуклеотидные последовательности этих фрагментов мы установили, что они принадлежат риккетсии «candidatus Rickettsia tarasevichiae». Эта риккетсия выявлена в последние годы в различных регионах Урала, Западной Сибири, Дальнего Востока, а также в Красноярском крае в клещах I. persulcatus [2]. Однако до сих пор никому не удавалось получить последовательность гена rOmpA для этой риккетсии. Поэтому вопрос об идентичности обнаруженных нами рик-кетсий «candidatus Rickettsia tarasevichiae» остается открытым — возможно одновременное инфицирование клеща двумя патогенами, тем более что параллельные фрагменты гена 16S rRNA и гена rOmpA удалось получить только для двух образцов из пяти.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате исследования на территории Прибайкалья в иксодовых клещах было выявлено 5 различных риккетсий: R. sibirica, R. sp. DnS14, R. sp. DnS28, R. sp. «AT-1-подобный», «candidatus R. Tarasevichae», причем последние три ранее на указанной территории не обнаруживались. Фоновыми являются риккетсии групп R. sp. DnS14 и R. sp. DnS28, ими заражено порядка 60 % клещей
D. nuttalli и D. silvarum. До трети клещей I. persulcatus также инфицированы малоизученными либо ранее неизвестными риккетсиями. Патогенность всех этих риккетсий для человека неизвестна.
Необходимы интенсивные дальнейшие исследования для выяснения роли обнаруженных риккетсий в патологии человека в Сибири.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аитов К.А. Характеристика клещевого рик-кетсиоза Азии в природном очаге Иркутской области / К.А. Аитов, И.В. Малов // Журнал инфекционной патологии. — 2004. — Т. 11. — № 3 — 4. — С. 28 — 36.
2. Выявление нового вида риккетсий в клещах Ixodes persulcatus в России / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, P.-E. Fournier и др. // Мед. парази-тол. и паразитарные болезни. — 2005. — № 2. — С. 6 — 9.
3. Выявление новых генотипов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки на юге Урала, в Сибири, на Дальнем Востоке и в Казахстане / С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, В.К. Ястребов и др. // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 2005. — № 1. — С. 23 — 27.
4. Нецкий Г.И. Учет и прогноз изменений численности клещей Ixodes persulcatus P. Sch. и Dermacentor pictus Herm. в природных очагах клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки и туляремии в Западной Сибири / Г.И. Нецкий, И.И. Богданов // Метод. указания. — Омск: Омский НИИ природноочаговых инфекций, 1972. — 13 с.
5. Рудаков Н.В. Классификация и основные характеристики риккетсий / Н.И.Рудаков, С.Н. Шпынов, И.Е. Самойленко // Журнал инфекционной патологии. — 2004. — Т. 11. — № 3 — 4. — С. 99—107.
6. Doyle J.J. Preservation of plant samples for DNA restriction endonuclease analysis / J.J. Doyle, E. Dickson // Taxon. — 1987. — Vol. 36. — С. 715 — 722.
7. Jukes T.N. Evolution of protein molecules / T.N. Jukes, C.R. Cantor // Mammalian protein metabolism. Ed. H.H. Munro. — New York: Academic Press, 1969. — P. 21 — 132.
Поступила в редакцию 25.12.2006 г
