CC BY
241
© КАРУСЕВИЧ А.А., БУЗУК ПН., 2005
ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ЭКДИСТЕРОИДОВ ИЗ ЛИСТЬЕВ ЛЕВЗЕИ САФЛОРОВИДНОЙ
КАРУСЕВИЧ А. А., БУЗУК Г.Н.
УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра организации и экономики фармации
Резюме. В настоящее время большой интерес представляют полиоксигидроксилированные стерины, выделенные из различных объектов животного и растительного происхождения - так называемые экдистероиды. Они структурно идентичны гормонам линьки и метаморфоза насекомых и обладают выраженным фармакологическим действием. Однако источников получения экдистероидов не так уж и много, несмотря на их широкую распространенность в растительном и животном мире. Среди таких источников можно назвать растения Serrtulla coronata, Ajuga reptans и Rhaponticum carthamoides. Из этих растений на территории Республики Беларусь широко может культивироваться последнее. Благодаря значительному содержанию экдистероидов во всех частях растения, и в листьях в частности, Rhaponticum carthamoides может расцениваться как источник этих дорогостоящих, фармакологически активных и перспективных соединений.
Ключевые слова: левзея сафлоровидная, экстракция, колоночная хроматография, качественные реакции.
Abstract. Nowadays polyoxihydroxil sterols (the so-called ecdisteroids) extracted from different objects of animal and vegetable origin are of great interest. They are structurally identical to hormones of shedding and metamorphose of insects and possess marked pharmacologic action.
However, in spite of their wide prevalence in animal and vegetable kingdom there are not so many sources to get ecdisteroids. Among such sources it is possible to mention Serrtulla coronata, Ajuga reptans and Rhaponticum carthamoides. The latter may be widely cultivated on the territory of the Republic of Belarus.
Due to significant ecdisteroids concentration in all parts of this plant and leaves in particular, Rhaponticum carthamoides may be considered as a source of these expensive, pharmacologically active and promising compounds.
Несмотря на множество средств, обладающих той или иной активностью, существуют определенные классы соединений, действие которых на организм определено, проявляется наиболее четко и не требует доказательств. Алкалоиды, гликозиды, фенотиазины, бензодиазепины и пр., несмотря на различия в структуре и характер заместителей, всегда в той или иной степени будут вызывать фармакологические эффекты. Разумеется, список
Адрес для корреспонденции: 210023, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27, Витебский государственный медицинский университет, кафедра организации и экономики фармации - Карусевич А. А.
подобных соединений растет благодаря достижениям фармацевтической науки и новейшим разработкам в этой области, однако изучение и модернизация уже имеющихся средств нисколько не утратило своей актуальности. Более того, углубленное изучение вещества с уже определенной физиологической активностью всегда менее трудоемко и более дешево (а по результатам и более предсказуемо), чем сплошной скрининг неизвестных соединений.
Одними из таких соединений являются экдистероиды - класс соединений, обладающих высокой фармакологической активностью. К настоящему времени установлена структура бо-
лее 150 экдистероидов. Экдистероиды являются весьма распространенными стероидными соединениями. Растительные источники экди-стероидов как по составу, так и по количеству значительно превосходят животные организмы [7]. Исключение не составляет и Rhaponticum carthamoides (левзея сафлоровидная).
Целью настоящей работы было:
Изучить динамику экстрагирования 70% этанолом экдистероидов из листьев левзеи в зависимости от кратности и длительности экстракции, а также разработать метод их очистки с использованием колонки с оксидом алюминия.
Методы
В качестве источника экдистероидов использовались измельченные листья левзеи сафлоровидной, собранные в конце вегетационного периода 2004 года (вторая половина августа). Сырье подвергалось предварительной очистке от минеральных примесей и измельчалось до порошка, проходящего в сито с диаметром отверстий 1 мм.
Экстракцию экдистероидов из листьев левзеи проводили по следующей методике:
1. 10 г сырья экстрагировали 70% этанолом. Экстракцию проводили до З раз, затем этанол удаляли при помощи ротационного испарителя. Остаточный экстракт помещали в делительную воронку и пятикратно обрабатывали хлороформом по З0 мл. Хлороформный слой оставляли для определения количества балластных веществ. Очищенный экстракт обрабатывали смесью хлороформ-изоп-ропиловый спирт (1:1) пятикратно. Органическую часть объединяли и удаляли элюент при 40ОС до получения светло-желтой аморфной массы.
2. Полученный сухой остаток растворяли в системе хлороформ-этанол (1:1) и хлоро-форм-этанол-ацетон (6:З:1) в объеме З мл и хроматографировали на колонке диаметром 1 см и длиной 20 см с оксидом алюминия (II по Брокману).
3. Из каждой фракции элюата, объем которого составлял 1 мл, отбирали 0,1 мл, упаривали досуха и проводили реакцию с ацетилхлоридом в ледяной уксусной кислоте для под-
тверждения присутствия экдистероидов (красно-бурое окрашивание).
4. Остаток элюата упаривали до сухого состояния, растворяли в 95% этаноле, измеряли оптическую плотность при À=242 нм, снимали спектр поглощения в диапазоне 220-З60 нм. Всего брали по 100 проб с каждой ко -лонки.
Общее содержание экдистероидов по ß-экдизону в сырье устанавливали после истощающей 10-ти кратной экстракции сырья 70% этанолом [6]. В зависимости от общего содержания экдистероидов выявляли динамику выхода экдистероидов из листьев левзеи при использовании вышеупомянутого экстрагента. Динамика выхода представлена на рис. З.
Спектр поглощения стандартного образца ß-экдизона снимали на спектрофотометре СФ-46, используя его раствор в этаноле. По этим данным строили градуировочный график. Для изучения динамики выхода экдисте-роидов пользовались спектрофотометрическим методом измерения концентрации экдис-тероидов [1,5,З] нм при использовании следующей методики [1,2,З]:
1. Пять грамм измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли З0 мл 70 % этилового спирта и перемешивали на механическом встряхива-теле при комнатной температуре. Экстракт фильтровали через вату в колбу вместимостью 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещали в колбу для экстрагирования и прибавляли З0 мл 70 % этилового спирта. Экстракцию повторяли 5 раз в описанных выше условиях, фильтруя извлечения в ту же колбу. Затем экстракты объединяли и отгоняли растворитель на ротационном испарителе при температуре 40ОС до объема З0 мл.
2. Полученное извлечение помещали в делительную воронку вместимостью 100 мл, прибавляли 20 мл хлороформа и перемешивали в течение 10 минут. Хлороформные вытяжки отбрасывали. Операцию повторяли еще пятикратно в описанных выше условиях.
3. К очищенному от липофильных балластных веществ водному извлечению прибавляли 20 мл смеси, состоящей из хлороформа и изопропилового спирта (1:1) и перемешива-
ли в течение 5 минут. Органическую фазу переносили в колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли еще пятикратно, фильтруя извлечения в ту же колбу. Затем извлечения перемешивали и отгоняли растворитель на ротационном испарителе до объема 10 мл.
4. 10 мкл раствора наносили на стартовую линию пластинки «Сорбфил» в виде пятна диаметром 5 мм, высушивали на воздухе и хроматографировали в системе растворителей хлороформ-этанол-ацетон (6: 3: 1 ) [1,З,4,5]. Время насыщения камеры - З0 минут. Затем пластину вынимали, сушили на воздухе и снимали сорбент в зоне Rf = 0,67 (ширина зоны » 2 см). Сорбент количественно переносили в колбу с 25 мл 95% этанола и перемешивали на встряхивателе в течение 5 часов. Затем снимали оптическую плотность раствора при À=242 нм. Концентрацию экдистероидов вычисляли по градуировочному графику.
Динамику выхода экдистероидов из колонки с оксидом алюминия определили в зависимости от систем растворителей хлороформ-этанол (1:1) и хлороформ-этанол-ацетон (6:З:1) [1].
Содержание ß-экдизона в пересчете на сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:
х = / ái% ' Ê , где
/ Á1ñi
ái%0 - коэффициент поглощения чистого 20-гидроксиэкдизона; А - оптическая плотность испытуемого раствора; К - коэффициент разведения.
1,2 1
G,B А G,6
G,4
G,2
G
2GG 22G 24G 26G 2BG 3GG 32G
Длина волны
Рис. 1. Спектр поглощения ß-экдизона.
! \
/ > \ \
/ \
\ \
/
Результаты и обсуждение
Спектр поглощения |3-экдизона представлял собой кривую с выраженным одним пиком поглощения при длине волны 242 нм.
Градуировочный график в-экдизона представлен на рис. 2.
A
C моль/л
Рис. 2. Градуировочный график ß-экдизона.
Кратность экстракции
Рис. З. Динамика экстрагирования экдистероидов в зависимости от кратности экстракции.
Как видно из рис. З, достаточно полный выход экдистероидов наблюдается уже после З-х кратной экстракции. Продолжение экстракции не дает значимого выхода экдистероидов, поэтому в дальнейшем при количественном определении экдистероидов в растительном сырье использовали З-х кратную экстракцию.
Используя 3-х кратную экстракцию, изучали динамику выхода экдистероидов в зависимости от ее продолжительности.
Динамика выхода экдистероидов в зависимости от продолжительности экстракции выглядела следующим образом: первая экстракция - ~ 300 минут, вторая экстракция - ~ 200 минут, третья - ~ 120 минут. Увеличение продолжительности этих этапов не приводила к увеличению выхода экдистероидов (рис. 4,5 и 6).
Первый контакт
Время, мин
Рис. 4. Полнота экстракции при первом контакте с экстрагентом.
Третий контакт
100
Л , я і
ёя 40 s
S 20
0 -I-----------------,-----------------,-----------------,-----------------
0 100 200 300 400
Время, мин
Рис. 6. Полнота экстракции при третьем контакте с экстрагентом.
Второй контакт
Время, мин
Рис. 5. Полнота экстракции при втором контакте с экстрагентом.
№проЕь1
Рис. 7. Динамика выхода экдистероидов из хроматографической колонки при использовании элюента хлороформ-этанол-ацетон (6:3:1).
По общей сумме выделенных экдисте-роидов в сравнении с внесенными в колонку вычисляли степень выхода в-экдизона в процентах. Было установлено, что при использовании в качестве элюента смеси хлороформ-этанол-ацетон (6:3:1) полнота выхода составила в 80,7%, при использованиии элюента хлороформ-этанол (4:1) - 81,1%. Однако при использовании последнего экстракт недостаточно очищался и наряду с фракцией экдис-тероидов элюировались красящие вещества.
Выводы
1. Достаточно полный выход экдистеро-идов при экстракции 70% этанолом наблюдается после 3-х кратной экстракции. Продолжение экстракции приводит лишь к расходу экстрагента;
2. Динамика выхода экдистероидов в зависимости от продолжительности экстракции выглядит следующим образом: первая экстракция - ~ 300 минут, вторая экстракция - ~ 200 минут, третья - ~ 120 минут. Увеличение продолжительности этих этапов не приводит к значимому увеличению выхода экдистерои-дов;
3. При использовании в качестве элюен-та смеси хлороформ-этанол-ацетон (6:3:1) полнота выхода составила 80,7%, при использо-ваниии элюента хлороформ-этанол (4:1) -81,1%.
4. Красящие и другие сопутствующие вещества элюируются в первых 10-12 мл
№ пробы
Рис. 8. Динамика выхода экдистероидов из хроматографической колонки при использовании элюента хлороформ-этанол (4:1).
(смесь хлороформ-этанол-ацетон (6:3:1)), и в первые 15 мл (хлороформ-этанол (4:1));
5. Наилучшим элюентом для колоночной хроматографии является смесь хлороформ-этанол-ацетон (6:3:1), наиболее полно очищающая экстракт от балластных веществ.
Литература
1. Выделение и анализ природных биологически активных веществ/ Краснов Е.А. [и др.]; под общ. ред. Е.Е Сироткиной. - Томск: Изд-во Томского университета, 1987. - 184 с.
2. Пунегов В.В. Метод внутреннего стандарта для определения экдистероидов в растительном сырье и лекарственных формах с помощью ВЭЖХ/ В.В. Пунегов, Н.С.Савиновская // Растительные ресурсы. - 2001. - Т.37.- Вып1. - С.97-102.
3. Рапонтикум сафлоровидный = КИароШкит
carthamoides//Лекарственные растения Государственной фармакопеи. Лекарственные растения, разрешенные для производства ГЛС.- М. 2001. -С. 369 - 373.
4. Алексеева Л .И. Метод концентрирования минорных гидрофобных экдистероидов с использованием фронтальной хроматографии/Л.И. Алексеева, В.В. Володин, В.Г. Лукша // Растительные ресурсы. - 2002. - Вып.4. - С.122-127.
5. Зарембо Е.В Содержание 20-гидроксиэкдизона в видах ЯМропйсит ЬМтс'. и 8еггаЩ1а Ь. флоры Дальнего Востока России. //Е.В. Зарембо, Л.И. Соколова, П.Г. Горовой// Растительные ресурсы. -2001. - Вып.3. - С.59-64.
6. Маматханов А.У Выделение экдистероидов из корней ЯМропйсит carthamoides/ А.УМаматха-нов., М.Н.Шамсутдинов, Т.Г. Шакиров //Химия природных соединений. - 1980. - №4. - С.528-529.
7. Фитоэкдистероиды - растительные аналоги гормонов линьки насекомых/ В.В. Володин [и др.]// Растительные ресурсы. - 2004. - Вып.2 - С. 1-18.
Поступила 16.09.2005 г. Принята в печать 26.09.2005 г.
