CC BY
96
DOI: 10.14258/jcprm.2018033639
Низкомолекулярные соединения
УДК 543.544.5.068.7:543.645.2+547.926
МЕТОДИКА БЫСТРОГО АНАЛИЗА 20-ГИДРОКСИЭКДИЗОНА В РАСТЕНИЯХ И ПАПОРОТНИКАХ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТВЕРДОФАЗНОЙ ЭКСТРАКЦИИ НА ПОЛИАМИДЕ И МИКРОКОЛОНОЧНОЙ ВЭЖХ-УФ
© Д-Н. Олейников , Н.И. Кащенко
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия), e-mail: [email protected]
Разработана методика быстрого количественного анализа 20-гидроксиэкдизона методом микроколоночной об-ращенно-фазовой ВЭЖХ с УФ-детекгированием (246 нм) с применением колонки ProntoSIL-120-5-C18 (2x75 мм) и градиентной элюентной системы LiC104 / НСЮ4-ацетонитрил. Длительность хроматографического этапа анализа составила 5 мин, что позволило охарактеризовать методику как самую быструю. Для предварительной очистки растительного извлечения была использована твердофазная экстракция на полиамиде, что привело к возрастанию чувствительности анализа. Валидационные исследования показали, что методика характеризовалась удовлетворительными метрологическими показателями. Значения предела детектирования (LOD) и предела количественного определения (LOQ) 20-гидроксиэкдизона составили 3.3 и 10 мкг/мл соответственно. Показатели точности для уровней содержания 20-гидроксиэкдизона 80-120% не превышали 98.57-101.38%. Методика была применена для анализа 20-гидроксиэкдизона цветковых растений и папоротников, произрастающих на территории Республики Бурятия. Присутствие 20-гидроксиэкдизона было установлено в 22 видах, включая 18 цветковых растений и 4 папоротника. Уровни концентрации 20-гидроксиэкдизона в растениях варьировали от следовых (Athyrium filix-femina, Diplazium sibiricum, Pteridium aquilinum) до очень высоких (25,40 мг/г в Rhaponticum uniflorum и 25.87 мг/г в Silene jeniseensis). Впервые присутствие 20-гидроксиэкдизона было выявлено в трех видах, в том числе в Gastrolychnis gracilis, G. saxatilis и Silene violascens. Разработанная методика является быстрой, простой, чуствительной и стабильной и может быть рекомендована для поиска новых растительных источников 20-гидроксиэкдизона.
Ключевые слова: экдистероиды, 20-гидроксиэкдизон, количественный анализ, твердофазная экстракция, микроколоночная хроматография, ВЭЖХ, флора Бурятии.
Используемые сокращения: 20Е - 20-гидроксиэкдизон, LOD - предел детектирования, LOQ - предел количественного определения, RSD - относительное стандартное отклонение, SD - стандартное отклонение.
Исследование выполнено при поддержке ФАНО в рамках научного проекта № 0337-2016-0006.
Экдистсроиды занимают отдельное место среди низкомолекулярных метаболитов растений, являясь структурными аналогами гормонов линьки и метаморфоза насекомых [1]. Экдистсроиды по химической природе принадлежат к полиоксистероидам с гидроксильными группами в стероидном ядре и боковой цепи [2]. Данный класс соединений обладает рядом биологических свойств, таких как анаболическое, гипо-гликемическое, гипохолестеринемическое и другими [3, 4]. Многочисленные клинические исследования экдистероидов в восстановительной спортивной медицине, при астенических и астенодепрессивных состояниях, при лечении инфекционных заболеваний, неврозов и гипотонии подтвердили их высокую эффек-
Введение
Олейников Даниил Николаевич - ведущий научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований, доктор фармацевтических наук, тел. / факс: +73012434743, e-mail: [email protected] Кащенко Нина Игоревна - научный сотрудник лаборатории медико-биологических исследований, кандидат фармацевтических наук, тел. / факс: +73012434743, e-mail: ninkk@mail
тивность [5, 6]. В целом, лекарственное растительное сырье, содержащее экдистероиды, может быть отнесено к фитоадаптогенам - препаратам, которые усиливают адаптацию человека к физической нагрузке и другим стрессовым факторам, связанным с напряжением физиологических функций. Растительные адаптогены могут с успе-
Автор, с которым следует вести переписку.
хом использоваться в качестве лечебных и профилактических средств представителями многих профессий: шахтерами, геологами, полярниками, теми, чья трудовая деятельность связана с экстремальными физическими нагрузками и большим физическим напряжением [7]. Кроме того, сложившаяся за последние годы напряженная обстановка в российском спорте, связанная с обвинениями в адрес атлетов в приеме запрещенных препаратов, располагает к поиску новых эффективных средств, которые бы применялись спортсменами для восстановления физиологических функций организма в период интенсивных тренировок, но, в отличие от допингов, не выключали бы регуляторные функции нервной системы. Таким образом, поиск экдистероидсодержащих растений как сырья для получения новых адаптогенных лекарственных препаратов, тонизирующих пищевых добавок и косметических композиций представляет большой интерес. Для детектирования экдистсроидов в лекарственном растительном сырье и последующей количественной оценке их содержания необходимо использование разнообразных аналитических методик.
К настоящему времени в экспериментальной науке накоплен определенный объем научной информации о методах количественного анализа растительного сырья, содержащего экдистероиды. Согласно данным наукометрического исследования баз данных Scopus (www.scopus.com), WOS (apps.webofknowledge.com) и eLIBRARY (elibrary.ru), количество статей, относящихся к количественным методам хроматографического анализа экдистероидов, и, в частности, 20-гидроксиэкдизона как маркерного растительного экдистероида за период 1979-2017 гг., составило более 800 единиц. Метод высокоэффективной жикостной хроматографии является наиболее часто применяемым вместе с детекторами диодноматричного и ультрафиолетового типов. В таблице 1 приведены некоторые наиболее часто используемые условия хроматографического разделения экдистсроидов. Длительность анализа в известных методиках варьировала от 15 до 77 мин. Для рутинной работы, которая подразумевает быстрый анализ большого количества растительных видов, длительность анализа более 15 мин нежелательна, что указывает на необходимость разработки экспресс-метода количественного определения. Разделение основных компонентов растительных видов чаще всего осуществлялось на обращен-но-фазовых сорбентах, таких как Alltima С18, Ascentis С18, Cogent Bidentate C8, Diamonsil C18, Diasorb 130-C16-T, Hypersil, Kromasil C18, Lichrospher 100RP-18e, Microsorb-MV C18, Nucleosil C18, Perfect Sil ODS-3, Luna C18, Sphereclone ODS2, ProntoSIL-120-5-C18, Spherisorb 5 ODS2 C18, Synergi Polar-RP, Spherisorb ODS-2, Symmetry С18, Zorbax и Eclipse. Значительно реже использовались нормально-фазовые (Kromasil, Zorbax SIL) и диольные (Apex II diol) сорбенты.
Таблица 1. Хроматографические условия анализа 20-гидроксиэкдизона с применением ВЭЖХ с диодно-матричным и ультрафиолетовым детектированием
Время анализа, мин Колонка Мобильная фаза Литература
1 2 3 4
15 Microsorb-MV С18 (150x4.6 ммх5 мкм) Н20 pH 3.7 (A), MeCN - МеОН (1:1) (В) [8]
15 ProntoSIL-120-5-C18 (60x1 ммх1 мкм) 4.1 М LiC104 - 0.1 М НС104(5 : 95) (А), MeCN (В) [9]
15 Ascentis С18 (100x2.1 ммхЗ мкм) Н20 (A), MeCN (В) [10]
15 Cogent Bidentate С8 (150x2.1 ммх4 мкм) 0.01% НСООН (A), MeCN (В) [П]
18 Hypersil ODS (250x4.0 ммх5 мкм) Н20 (A), MeCN (В) [12]
20 Lichrospher 100RP-18e (250x4.6 ммх5 мкм) 0.01% TFA (A), MeCN [13]
20 Apex II diol (150x4.6 ммх5 мкм) МеОН (А), СН2С12 (В) [14]
20 Waters Spherisorb ODS-2 (250x4.6 ммх5 мкм) Н20 (A), MeCN (В) [15]
20 Zorbax Eclipse XDB C8 (150x4.6 ммх5 мкм) 0.1%) TFA (А), МеОН (В) [16]
20 Zorbax XDB-C8 (50x2.1 мм) Н20 (A), MeCN (В) [16]
21 Phenomenex Luna C18 (250x4.6 ммх5 мкм) 0.05% Н3Р04 (A), MeCN (В) [17]
25 Phenomenex CI8 Sphereclone ODS2 (150 x 4.6 мм x 5 мкм); Phenomenex C6 Sphereclone (150 x 4.6 мм x 5 мкм) Н20 (А), МеОН (В) [14]
25 Zorbax SIL (250x4.6 ммх5 мкм) СН2С12-'Рг0Н-Н20 [18]
25 Zorbax-ODS, Zorbax SB-C18 (250x4.6 мм x5 мкм) Н20 (A), MeCN (В) [19]
30 Waters Symmetry C18 (150x3.9 ммх5 мкм) D20 (A), MeCN-d3 (В) [19]
35 Zorbax SB-C18 (150x4.6 ммх5 мкм) Н20 (А), 'РЮН (В) [20]
40 Spherisorb 5 ODS2 C18; C6 (150x4.6 ммх5 мкм) Н20 (А), МеОН (В) [21]
40 Spherisorb ODS2 (150-250x4.6 ммх5 мкм) MeCN- 'PrOH - Н20 [22]
40 Zorbax SIL (250x4.6 ммх5 мкм) C6H12-'Pr0H-H20 [22]
40 Zorbax TMS (250x4.6 ммх5 мкм) 0.1% TFA (А), MeCN - 'РЮН (В) [23]
Окончание таблицы 1
2
3
Diasorb 130-С16-Т (80x2 ммхб мкм) ProntoSIL-120-5-C18AQ (75x2 ммх5 мкм)
ProntoSIL-120-5-C18AQ (75x2 ммх5 мкм)
Kromasil (250x4.6 ммх3.5 мкм) Zorbax SIL (250x4.6 ммх5 мкм) Zorbax SB-C18 (150x4.6 ммх5 мкм) Zorbax Eclipse XDB-C18 (150x3 ммх3.5 мкм) Synergi Polar-RP (150x4.6 ммх4 мкм)
Kromasil (250x4.6 ммх3.5 мкм)
Spherisorb 50DS2 (250x4.6 ммх5 мкм)
Alltima С18 (250x4.6 ммх5 мкм)
Diamonsil С18 (250x4.6 ммх5 мкм)
Hypersil HIRPB С18 (100x4.6 ммх5 мкм), Hypersil H5BDS-C18 (250x4.6 ммх5 мкм) Zorbax SIL (150x4.6 ммх5 мкм) Kromasil С 18 (250x4.6 ммх5 мкм) Perfect Sil ODS-3 (250x4.6 ммх5 мкм) Nucleosil CI8 (250x4.6 ммх5 мкм)
/ / 14U11COS11 I I О I Z Н.Ч_
Сокращения: ВиОН - бутанол, С6Н12 - циклогексан, ЕЮН изопропанол, TFA - трифторуксусная кислота.
Н20- ЕЮН -ВиОН
0.2 М LiC104/0.006 М НСЮ4 (A), MeCN (В)
0.6 М LiC104/0.009 М НСЮ4 (A), MeCN (В)
CHjCb-'PrOH-HjO
С6Н12-Рг0Н-Н20
0.1% Н3Р04 (А), МеОН (В)
Н20 (A), MeCN (В)
0.05% НСООН (А), 0.05%
HCOOH/MeCN (В)
СН2С12 - 'РгОН - Н20; С6Н12 - 'РгОН -
Н20;
Н20 (А), МеОН (В); 0.1% TFA (А), MeCN/PrOH (В)
0.2% НСООН - 0.2% 'РгОН (A), MeCN (В)
0.2% НСООН - 20 мМ CH3COONH4-Н20 (A), MeOH/MeCN (1:1) (В) D20 (A), MeCN (В)
С6Н12-'РЮН-Н20 MeCN - Н20 - Н3Р04 0.1% TFA (A), MeCN/*PrOH (В) Н2Р (А), МеОН (В)
\* у, \ J__I I
этанол, MeCN - ацетонитрил, МеОН - метанол, 'РгОН
Показатель длины хроматографических колонок также варьировал - от колонок обычной длины (250 мм) до микроколонок (60 мм). Следует отметить приоритет использования последних в фармацевтическом анализе, так как метод микроколоночной ВЭЖХ имеет ряд преимуществ, таких как экспрессность, экономичность, удовлетворительные метрологические показатели, а также экологичность анализа. В качестве элюентов применялись смеси спиртов (метанол, изопропанол), ацетонитрила, дихлорэтана, циклогек-сана, воды, солей (ацетат аммония, перхлорат лития), а также растворы кислот (муравьиная, уксусная, трифторуксусная, ортофосфорная).
Таким образом, создание методики быстрого анализа (< 5 мин) 20-гидроксиэкдизона (20Е) с использованием метода микроколоночной хроматографии является актуальной задачей аналитической химии. Наиболее востребованным приложением данной методики может считаться фитохимический скрининг растительных объектов с целью поиска новых источников 20Е. Подобные исследования были ранее осуществлены для изучения флоры Европейского Северо-Востока России [7], Алтая [39, 40] и Монголии [35]. Встречаемость эвдистероидов в растениях Байкальского региона ранее не изучалась. Учитывая перспективность подобных исследований для теоретической и практической науки, в рамках настоящей работы нами была разработана методика быстрого анализа 20Е методом микроколоночной хроматографии и проведен анализ 371 вида растений из флоры Республики Бурятия.
Экспериментальная часть
Растительное сырье. Образцы цветковых растений и папоротников были собраны в различных районах Республики Бурятия в 2010-2017 гг. Видовая принадлежность определена д.фарм.н. Т.А. Асеевой (ИОЭБ СО РАН). Сырье высушивали воздушно-теневым способом до значений влажности < 5%. Ботаническая номенклатура видов приведена в соответствии с рекомендациями The Plant List.
Условия анализа 20-гидроксиэкдизона (20Е) методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ. Для количественного анализа 20Е в образцах цветковых растений и папоротников использовали следующие условия: микроколоночный жидкостный хроматограф «Милихром А-02» (Эконова, Новосибирск, Россия); колонка
The Plant List (2013). Version 1.1. Published on the Internet; http://www.theplantlist.org/ (accessed 1st January).
ProntoSIL-120-5-C18 AQ (2 * 75 мм, 0 5 мкм; Metrohm AG, Herisau, Switzerland); подвижная фаза: 0.2 М LiC104 в 0.006 М НСЮ4 (A), MeCN (В); градиентный режим элюирования; условия градиента (% В): 03.3 мин 12-35. 3.3-5 мин 35-70; v 450 мкл/мин; температура колонки 35 °С; УФ-детектор, X 246 нм.
Приготовление стандартного раствора 20Е (1000 мкг/мл). Точную навеску 20Е (10 мг) предварительно высушенного 20Е переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяли в 70% этаноле и доводили объем раствора до метки тем же растворителем.
Валидационный анализ. Для построения градуировочного графика серию разведений 20Е (101000 мкг/мл) хроматографировали в описанных выше условиях трижды для каждой концентрации вещества. По полученным данным проводили построение градуировочного графика в координатах «концентрация, мкг/мл - площадь пика» и определяли вид уравнения линейной регрессии (Y = а*Х + />). значения коэффициента детерминации (г2) и стандартного отклонения (<Syx) с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.2 (Alentum Software, Inc., США). Предел детектирования (LOD) и предел количественного определения (LOQ) определяли по уравнениям: LOD = (3.3/Л'ух)/д и LOQ = ( IOaS'-,-.;)/«. где SYX - стандартное отклонение, а - коэффициент при X в уравнении линейной регрессии. Для определения воспроизводимости серию стандартных растворов 20Е (250-1000 мкг/мл) анализировали в 3-кратной повторности. Вариабельность методики определяли в двух вариантах: «день-в-день» (intra-day) и «день-через-день» (inter-day). В первом варианте стандартный раствор 20Е (250 мкг/мл) анализировали в течение одного дня 6-кратно, во втором варианте анализа - стандартный раствор 20Е (250 мкг/мл) анализировали в течение трех последовательных дней 3-кратно. Стабильность методики определяли на одном образце листьев Rhaponti-сит uniflorum, анализируя его через 2, 4, 8, 12, 24 и 72 ч после первого анализа. Показатель точности методики выявляли на двух образцах экстрактов - 20Е-содержащем (листья Rhaponticum uniflorum) и 20Е-не содержащем (листья Arctium tomentosum), с введением в навеску растительного сырья чистого 20Е в количестве 80-120% от исходного содержания, с последующими экстракцией и анализом. В качестве показателя эффективности методики при определении вариабельности, воспроизводимости, стабильности и точности использовали величину относительного стандартного отклонения (RSD), рассчитанную как RSD = (lOOxSy/Xcp, где .S'vl - стандартное отклонение х,; хф - среднее значение х.
Пробоподготовка растительных образцов. Точную навеску измельченного растительного сырья (300-500 мг) помещали в емкость для экстракции (5 мл) с завинчивающейся крышкой, приливали 2 мл 70% этанола, закрывали крышку и экстрагировали в ультразвуковой ванне (100 Вт, 35 кГц) при 50 °С в течение 40 мин. Полученную пробу центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин и супернатант переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл. Экстракцию повторяли в тех же условиях еще раз. Объем объединенного экстракта доводили до метки 70% этанолом (раствор А). 3 мл раствора А переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем раствора до метки водой (раствор Б). Далее 5 мл раствора Б наносили на полиамидный патрон, предварительно прекондиционированный 20 мл 95% этанола и 30 мл воды, и элюировали водой в мерную колбу вместимостью 10 мл, которую доводили до метки водой (раствор В). После этого раствор В фильтровали через PTFE фильтр (0.22-|im) и использовали для анализа методом ВЭЖХ без предварительного разбавления. Все анализы осуществляли в трехкратной повторности и результаты представлены в виде среднего значения (мг/г) ± стандартное отклонение (SD).
Обсуждение результатов
Оптимизация условий хроматографического анализа 20-гидроксиэкдизона (20Е) методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ. В ходе выбора хроматографических условий анализа 20Е методом микроколоночной ВЭЖХ нами были использованы некоторые хроматографические колонки, заполненные обращено-фазовым сорбентом (Kromasil 100-5-С18 LiChrosorb RP18 5 |im. Nucleosil-5-C18 Silasorb C18 (LC) 5 |im. ProntoSil 120-5-Cig-AQ), а так же различные комбинации подвижных фаз, содержащих ацетонитрил, метанол и воду с добавлением органических и неорганических кислот и солей. В качестве дополнительных условий выбора варьировались температура колонки (30-60°С) и скорость подвижной фазы (50-600 мкл/мин). В результате было установлено, что применение градиентного режима элюирования в системе ацетонитрил / LiCIO i / НСЮ4 на колонке ProntoSil 120-5-Ci8-AQ при температуре 35 °С и скорости подвижной фазы 450 мкл/мин позволяет добиться оптимальной формы хроматографического пика 20Е по показателям высоты и симметрии (0.991.01) при общем времени хроматографической процедуры 5 мин (рис. 1).
I 1 I 1 I 1 I 1 I.....I 1 I 1 I ' i 1 п^ i i i 1 i 1 l
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 /, мин
Рис. 1. Хроматограммы растворов 20-гидроксиэкдизона (20Е) с концентрациями 1000 мкг/мл (I), 250 мкг/мл (II) и 0 мкг/мл (III). На IV - спектр поглощения 20Е
Спектр поглощения 20Е содержит единственный максимум поглощения в УФ-области спектра, находящийся при 246 нм, который был использован в качестве рабочей длины волны. Величины спектральных отношений (Sa. / S2iо) для растворов с различной концентрацией 20Е характеризовались наименьшей вариабельностью около экстремума спектра поглощения (95.4-99.5%) и области коротких длин волн (92.3-98.7%) (табл. 2).
Валидация метода. Регрессионный анализ градуировочного графика 20Е показал, что он линеен (г = 0.9999) в области концентраций от 10 до 1000 мкг/мл, которые составили рабочий диапазон методики (табл. 3). Величины предела детектирования (LOD) и предела количественного определения (LOQ) составили 3.3 и 10 мкг/мл соответственно. Разработанная методика демонстрировала хорошие показатели воспроизводимости (RSD < 1.0%), вариабельности (RSD < 0.8%) и стабильности (RSD < 1.0%).
Оптимизация условий экстракции 20Е из растительного сырья. Различные методы экстракции (водяная баня, ультразвуковая, микроволновая), типы растворителей (вода, этанол, метанол, ацетон, ДМСО), температура (20-100 °С) и длительность экстракции (5-90 мин) были использованы для выбора лучших условий экстракции. По результатам проведенных исследований было показано, что применение 70% этанола в сочетании с ультразвуковой экстракцией при 45-50 °С в течение 30-40 мин позволяет извлечь наибольшее количество целевого соединения из растительной матрицы.
Таблица 2. Хроматографические и спектральные параметры 20-гидроксиэкдизона
с, мкг/мл fR, мин ^пшх, нм Спектральные отношения S-А/ S2io (% от соответствующего значения для образца 1000 мкг/мл)
220 230 240 250 260 270 280
1000 2.43±0.03 246 1.237 1.760 2.464 2.711 1.939 0.742 0.129
250 2.40±0.02 246 1.219 1.735 2.432 2.687 1.930 0.747 0.126
(98.5) (98.4) (98.7) (99.1) (99.5) (100.0) (97.7)
10 2.42±0.01 246 1.142 1.631 2.325 2.608 1.850 0.668 0.075
(92.3) (92.7) (94.4) (96.2) (95.4) (90.0) (58.1)
Таблица 3. Валидационные параметры методики количественного определения 20-гидроксиэкдизона методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ
Показатель Значение
Уравнение регрессии 7 = 0.025 хА'+ 0.018*
Коэффициент детерминации (г2) 0.9999
Стандартное отклонение (5Ух) 2.56-10"2
Предел детектирования (ЬОБ), мкг/мл 3.3
Предел количественного определения (ЬОС)), мкг/мл 10
Рабочий диапазон, мкг/мл 10-1000
Воспроизводимость, % (и =15) 0.94
Вариабельность «день-в-день», % (и = 6) 0.52
Вариабельность «день-через-день», % (и = 9) 0.71
Стабильность, % (и = 7) 0.82
А" - концентрация, мкг/мл; Г - площадь пика.
Для устранения мешающего влияния посторонних соединений на ход хроматографической процедуры к растительному экстракту была примененена процедура твердофазной экстракции. В качестве неподвижной фазы был выбран полиамид, который при высокой скорости элюции отличается малым сродством к экдистероидам в противоположность большинству УФ-поглощающих фенольных соединений, связывающихся с данным сорбентом. На примере экстракта Шшроппсит ит/1огит было показано, что необработанный экстракт листьев содержал комплекс УФ-активных соединений с близкими к 20Е временами удерживания (рис. 2-1). Несмотря на детектируемый уровень концентрации 20Е в экстракте, осуществление количественного анализа было невозможно по причине ко-элюции 20Е и других соединений.
После нанесения растительного экстракта на полиамидный патрон и последующей элюции водой происходило почти количественное (97.6-98.7% от исходного) удаление 20Е и близких соединений с сорбента. Эта способность твердофазного носителя к быстрой десорбции 20Е повлияла на качество получаемых хроматограмм, которые содержали хорошо разрешенные пики 20Е и других экдистероидов (рис. 2-П). Сопутствующие компоненты нестероидной природы элюировались с полиамида этанолом (рис. 2-Ш) или раствором аммиака (рис. 2-IV).
Согласно данным по определению точности методики уровень определения 20Е составил 98.57101.38% для растительного образца, содержащего 20Е, и 97.92-100.33% для образца без 20Е (табл. 4). Данные результаты позволяют охарактеризовать методику как точную.
Рис. 2. Хроматограммы (МК-ВЭЖХ-УФ) экстракта листьев Шшроппсит ит/1огит до (I) и после твердофазной экстракции на полиамиде (II - элюент вода, III - элюент 96% этанол, IV - элюент 0.5% аммиак в 96% этаноле). Положение 20Е обозначено звездочкой (*)
Таблица 4. Результаты определения точности количественного определения 20-гидроксиэкдизона (20Е) методом микроколоночной ВЭЖХ-УФ
Показатель Уровень
80% 90% 100% 110% 120%
20Е-содержащий образец
20Е в образце, мг в 1 г 10.14 10.14 10.14 10.14 10.14
Введено 20Е, мг в 1 г 8.11 9.13 10.14 11.15 12.17
Должно быть 20Е, мг в 1 г 18.25 19.27 20.28 21.29 22.31
Найдено 20Е, мг в 1 г 17.99 19.14 20.56 21.38 22.23
Точность, % 98.57 99.33 101.38 100.42 99.64
20Е-не содержащий образец
20Е в образце, мг в 1 г 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00
Введено 20Е, мг в 1 г 8.11 9.13 10.14 11.15 12.17
Должно быть 20Е, мг в 1 г 8.11 9.13 10.14 11.15 12.17
Найдено 20Е, мг в 1 г 7.96 8.94 9.97 11.08 12.21
Точность, % 98.15 97.92 98.32 99.37 100.33
Содержание 20Е в растениях из флоры Республики Бурятия. Разработанная методика была применена для анализа растительных видов, произрастающих на территории Республики Бурятия (табл. 5). Всего анализу было подвергнуто 359 видов цветковых растений и 12 видов папоротников. Подобное исследование флоры Байкальского региона на присутствие 20Е было осуществлено нами впервые. Для анализа цветковых растений были использованы образцы листьев, собранных в фазу бутонизации - начала цветения, а у папоротников - молодые раскрывающиеся вайи.
В результате проведенных исследований присутствие 20Е было выявлено в 22 видах, в том числе в 18 цветковых растениях и 4 папоротниках (6% от общего числа видов). Ранее наличие данного соединения было установлено в некоторых видах, включая Rhaponticum carthamoides, R. uniflorum [41], Serratula centauroides [42.43], S. coronata [44], S. marginata [39], Gastrolychnis brachypetala [40], G. tristis [45], Silene chamarensis [35], S. chlorantha [46], S. jeniseensis [25], S. nutans [47], S. repens [35], S. samojedorum [48], S. uralensis subsp. apétala [35], Ajuga reptans [49], Athyrium filix-femina, Diplazium sibiricum, Pteridium aquilinum и Polypodium vulgare [50]. Впервые присутствие 20E выявлено в Gastrolychnis gracilis, G. saxatilis и Silene violascens. Согласно данным количественного анализа установленные 20Е-содержащие виды - это растения с умеренным (0.01-0.10 мг/г), высоким (0.10-1.00 мг/г) и очень высоким (>10 мг/г) содержанием 20Е. Наибольшая концентрация 20Е была отмечена в листьях Silene jeniseensis (25.87 мг/г), Rhaponticum uniflorum (25.40 мг/г), R. carthamoides (14.10 мг/г), Serratula coronata (12.27 мг/г), Silene chlorantha (11.06 мг/г) и Serratula centauroides (10.14 мг/г).
Таблица 5. Содержание 20-гидроксиэкдизона (20Е) в листьях некоторых видов цветковых растений (Ма|рюИор11у1а) и молодых вайях папоротников (Ро1урос1юр1п1а)
Вид 20E, мг/г ± SD*
Magnoliophyta
Семейство Asteraceae
Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin 14.10±0.28
R. uniflorum (L.) DC. 25.40±0.51
Serratula centauroides L. 10.14±0.21
S. coronata L. 12.27±0.25
S. marginata Tausch. 4.56±0.10
Семейство Caryophyllaceae
Gastrolychnis brachypetala Tolm. & Kozuh. 1.02±0.02
G. gracilis (Tolm.) Czerep. 2.72±0.05
G. saxatilis Peshkova 1.37±0.02
G. tristis (Bunge) Czerep. 2.16±0.04
Silene apnea Turcz. (Elisanthe apnea (Turcz. ex Fisch. & C.A.Mey.) Peschkova) -
S. chamarensis Turcz. 9.02±0.17
S. chlorantha (Willd.) Ehrh. 11.06±0.21
S. jeniseensis Willd. 25.87±0.54
S. noctíflora L. (Elisanthe noctíflora (L.) Rupr.) -
S. nutans L. 6.35±0.12
S. latifolia Poir. (Melandrium album (Mill.) Garcke) -
S. repens Patrin 8.63±0.18
S. samojedorum (Sambuk) Oxelman (Lychnis sibirica L.) 0.10±0.00
S. uralensis subsp. apétala (L.) Bocquet (Gastrolychnis apétala (L.) Tolm. & Kozhanch.) 1.16±0.02
S. violascens (Tolm.) V.V.Petrovsky & Elven . (Gastrolychnis violascens Tolm.) 1.84±0.04
S. vulgaris (Moench) Garcke (Oberna behen (L.) Ikonn.) -
Семейство Lamiaceae
Ajuga reptans L. 0.34±0.00
Polypodiophyta
Семейство Athyriaceae
Athyrium filix-femina (L.) Roth <LOQ
Diplazium sibiricum (Turcz. ex Kunze) Sa. Kurata <LOQ
Семейство Dennstaedtiaceae
Pteridium aquilinum (L.) Kuhn <LOQ
Семейство Polypodiaceae
Polypodium vulgare L. 0.1Ш.00
Прочерк «-» означает отсутствие 20Е (концентрация ниже предела детекции, ЬОБ).
Несмотря на ранние сведения о наличии 20Е в отдельных растительных видах, нам не удалось подтвердить эти данные для следующих видов: Asteraceae - Saussurеа controversa, S. davurica, S. salicifolia [51]; Boraginaceae - Buglossoides arvensis [52]; Butomaceae - Butomus umbellatus [53]; Ceratophyllaceae -Ceratophyllum demersum [54], Caryophyllaceae: Sagina procumbens, Spergula arvensis [53], Silene aprica [39]; Chenopodiaceae - Axyris amaranthoides [54], Chenopodium album [55], С. suecicum [56]; Ranunculaceae -Anemone altaica,A. sylvestris [57], Pulsatilla ambigua [58], Thalictrum minus [53].
В результате проведенных исследований было установлено, что разработанная методика позволяет осуществлять быстрый количественный анализ 20Е в растительных образцах. В предложенной методике впервые объединены преимущества твердофазной экстракции и микроколоночной ВЭЖХ-УФ для анализа 20Е в растениях, что позволяет рекомендовать ее для широкого применения в исследовании экдистероид-содержащих растительных видов.
Выводы
1. Разработана методика количественного анализа 20-гидроксиэкдизона (20Е), представляющая собой комбинацию твердофазной экстрации на полиамиде и микроколоночной высокоэффективной хроматографии с УФ-детектированием, которая отличается от извествных методик экспрессностью этапа хромато-графического разделения (5 мин), чувствительностью и точностью.
2. С применением разработанной методики были успешно проанализированы растения из флоры Республики Бурятия и установлено присутствие 20Е в 22 видах, в том числе впервые присутствие данного соединения было показано в Gastrolychnis gracilis, G. saxatilis и Silene violascens.
Список литературы
1. Abubakirov N.K. Ecdysteroids of flowering plants (Angiospermae)// Chem. Nat. Comp. 1981. Vol. 17. Pp. 489-503. DOI: 10.1007/BF00574363.
2. Baltaev U.A. Phytoecdysteroids: Structure, sources, and biosynthesis in plants // Russ. J. Bioorg. Chem. 2000. Vol. 26. Pp. 799-831.
3. Lafont R., Dinan L. Practical uses for ecdysteroids in mammals including humans: an update // J. Insect Sei. 2003. Vol. 3. Pp. 1-30.
4. Parr M.K., Botre F., Naß A., Hengevoss J., Diel P., Wolber G. Ecdysteroids: A novel class of anabolic agents? // Biol. Sport. 2015. Vol. 32. Pp. 169-173. DOI: 10.5604/20831862.1144420.
5. Volodin V.V., Sidorova Iu.S., Mazo V.K. 20-Hydroxyecdysone-plant adaptogen: an anabolic effect, possible use in sports nutrition // Vopr. Pitan. 2013. Vol. 82. Pp. 24-30.
6. Hu J., Luo C.X., Chu W.H., Shan Y.A., Qian Z.-M., Zhu G., Yu Y.B., Feng H. 20-Hydroxyecdysone protects against oxidative stress-induced neuronal injury by scavenging free radicals and modulating NF-кВ and JNK Pathways//PLoS ONE. 2012. Vol. 7. ID e50764. DOI: 10.1371/journal.pone.0050764.
7. Володин B.B. Фитоэкдистероиды. СПб., 2003. 293 с.
8. Katsarova М., Dimitrova S., Lukanov L., Sadakov F. Determination of phenolic acids, flavonoids, terpenes and ecdysteroids in medicinal plant extracts and food supplements // Cr. Acad. Bulg. Sei. 2017. Vol. 70. Pp. 947-956.
9. Nikolaeva I.G., Tsybiktarova L.P., Garmaeva L.L., Nikolaeva G.G., Olennikov D.N., Matkhanov I.E. Determination of ecdysteroids in Fornicium uniflorum (L.) and Serratula centauroides (L.) raw materials by chromatography-UV spectrophotometry//! Anal. Chem. 2017. Vol. 72. Pp. 854-861. DOI: 10.1134/S1061934817080093.
10. Новожилова E.B., Рыбин В.Г., Горовой П.Г., Гавриленко И.Г. Фитоэкдистероиды в надземной части дальневосточных видов Caryophyllaceae // Turczaninowia. 2014. Т. 17. С. 42^18.
11. Stevens J.F., Reed R.L., Моггё J.T. Characterization of phytoecdysteroid glycosides in meadowfoam (Limnanthes alba) seed meal by positive and negative ion LC-MS/MS // J. Agric. Food Chem. 2008. Vol. 56. Pp. 3945-3952. DOI: 10.1021/jf800211k.
12. Rybin V., Boltenkov E., Novozhilova E. Application of high-performance liquid chromatography for simultaneous identification of integristerone A, 20-hydroxyecdysone, ecdysone and 2-deoxy-20-hydroxyecdysone // Nat. Prod. Com. 2007. Vol. 2. Pp. 1101-1104.
13. Ghosh D., Laddha K.S. Extraction and monitoring of phytoecdysteroids through HPLC // J. Chromatogr. Sei. 2006. Vol. 44. Pp. 22-26
14. Lapenna S., Dinan L. HPLC and TLC characterisation of ecdysteroid alkyl ethers // J. Chromatogr. B. 2009. Vol. 877. Pp. 2996-3002. DOI: 10.1016/j.jchromb.2009.07.014.
15. Карусевич A.A., Моисеев Д.В., Бузук Г.Н. Идентификация и количественное определение 20-гидроксиэкдизона в листьях левзеи сафлоровидной методом ВЭЖХ // Вестн. фармац. 2007. Т. 37. С. 1-5.
16. Зибарева Л.Н., Волкова О.В., Морозов С.В., Черняк Е.И. Фитоэкдистероиды корней Silene frivaldszkyana ham-ре//Химия растит. сырья. 2017. №1. С. 71-75. DOI: 10.14258/jcprm.2017011416.
17. Da Rosa H.S., Salgueiro A.C.F., Colpo A.Z.C., Paula F.R., Mendez A.S.L., Folmer V. Sida tuberculoid (Malvaceae): A study based on development of extractive system and in silico and in vitro properties // Braz. J. Med. Biol. Res. 2016. Vol. 49. E5282. DOI: 10.1590/1414-431X20165282.
18. Hunyadi A., Gergely A., Simon A., Toth G., Veress G., Bathoril M. Preparative-scale chromatography of ecdyster-oids of Serratula wolffii Andrae // J. Chromatogr. Sci. 2007. Vol. 45. Pp. 76-86.
19. Wilson I.D., Morgan E.D., Lafont R., Shockcor J.P., Lindon J.C., Nicholson J.K., Wright B. High performance liquid chromatography coupled to nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry applied to plant products: Identification of ecdysteroids from Silene otitis II Chromatographia 1999. Vol. 49. Pp. 374-378. DOI: 10.1007/BF02467609.
20. Альмагамбетов A.M., Тулеуов Б.И., Адекенов С.М. Количественное определение 20-гидроксиэкдизона в растении Acanthophyllum borszczowii Litv. (колючелистник Борщова) // Биологические особенности лекарственных и ароматических растений и их роль в медицине: сборник научных трудов Международной научно-практической конференции, посвященной 85-летию ВИЛАР. 2016. С. 444^146.
21. Meng Y., Whiting P., Zibareva L., Bertho G., Girault J.-P., Lafont R., Dinan L. Identification and quantitative analysis of the phytoecdysteroids in Silene species (Caryophyllaceae) by high-performance liquid chromatography. Novel ecdysteroids from S. pseudotites. И J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 935. Pp. 309-319. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00893-7.
22. Reixach N., Lafont R., Camps F., Casa J. Biotransformations of putative phytoecdysteroid biosynthetic precursors in tissue cultures of Polypodium vulgare И Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 266. Pp. 608-615. DOI: 10.1046/j. 1432-1327.1999.00905.x.
23. Ho R., Girault J.-P., CousteauP.-Y., Bianchini J.-P., Raharivelomanana P., Lafont R. Isolation of a new class of ec-dysteroid conjugates (glucosyl-ferulates) using a combination of liquid chromatographic methods // J. Chromatogr. Sci. 2008. Vol. 46. Pp. 102-110. DOI: 10.1093/chromsci/46.2.102.
24. Пунегов В.В., Савиновская Н.С. Метод внутреннего стандарта для определения экдистероидов в растительном сырье и лекарственных формах с помощью ВЭЖХ // Растит, ресурсы. 2001. Т. 37. С. 97-102.
25. Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Phytoecdysteroids from Silene jenisseensis // Chem. Nat. Сотр. 2017. Vol. 53. Pp. 1199-1201. DOI: 10.1007/s 10600-017-2239-1.
26. Цыбиктарова Л.П. Фармакогностическое исследование Serratula centauroides L. и разработка лекарственного средства на ее основе, обладающего адаптогенной активностью: дис. ... канд. фарм. наук. Улан-Удэ, 2016. 200 с.
27. Петрук А.А., Высочила Г.И., Ершова Э.А. Динамика содержания астрагалина, изокверцитрина и 20-гидроксиэкдизона в ваях Pteridium aquilinum и Matteuccia struthiopteris, произрастающих в окрестностях Новосибирска//Химия растит. сырья. 2013. №4. С. 151-157. doi:10.14258/jcprm,1304151.
28. Алиева Н.К., Нигматуллаев A.M., Бобаев И.Д., Тайжанов К., Рамазанов Н.Ш. Распространение и сырьевые запасы Rhaponticum integrifolium (Asteraceae) в Узбекистане//Растит, ресурсы. 2014. Т. 50. С. 505-512.
29. Abdukadirov I.T., Yakubova M.R., Nuriddinov Kh.R., Mamatkhanov A.U., Turakhozhaev M.T. Ecdysterone and tur-kesterone in Ajuga turkestanica determined by HPLC // Chem. Nat. Сотр. 2005. Vol. 41. Pp. 475^176. DOI: 10.1007/sl 0600-005-0184-x.
30. Wang Y.-H., Avula В., Jadhav A.N., Smillie T.J., Khan I.A. Structural characterization and identification of ecdysteroids from Sida rhombifolia L. in positive electrospray ionization by tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. Vol. 22. Pp. 2413-2422. DOI: 10.1002/rcm.3625.
31. Snogan E., Vahirua-Lechat I., Ho R., Bertho G., Girault J.-P., Ortiga S., Maria A., Lafont R. Ecdysteroids from the medicinal fern Microsorum scolopendria (Burm. f.) // Phytochem. Anal. 2007. Vol. 18. Pp. 441^150. DOI: 10.1002/pca.l000.
32. Wu J.-J., Cheng K.-W., Wang H., Ye W.-C., Li E.T.S., Wang M. Simultaneous determination of three phytoecdysteroids in the roots of four medicinal plants from the genus Asparagus by HPLC // Phytochem. Anal. 2009. Vol. 20. Pp. 58-63. DOI: 10.1002/pca.l097.
33. Shi Q., Yan S., Liang M., Yang Y., Wang Y., Zhang W. Simultaneous determination of eight components in Radix Tinosporae by high-performance liquid chromatography coupled with diode array detector and electrospray tandem mass spectrometry // J. Pharm. Biomed. Anal. 2007. Vol. 43. Pp. 994-999. DOI: 10.1016/j.jpba.2006.09.028.
34. Louden D., Handley A., Taylor S., Lenz E., Miller S., Wilson I.D., Sage A., Lafon R. Spectroscopic characterisation and identification of ecdysteroids using high-performance liquid chromatography combined with on-line UV-diode array, FT-infrared and 'H-nuclear magnetic resonance spectroscopy and time of flight mass spectrometry // J. Chromatogr. A. 2001. Vol. 910. Pp. 237-246. DOI: 10.1016/S0021-9673(00)01204-8.
35. Munkhzhargal N., Zibareva L.N., Lafont R., Pribytkova L.N., Pisareva S.I. Investigation of ecdysteroid content and composition of Silene repens indigenous in Mongolia and introduced into Western Siberia // Russ. J. Bioorg. Chem. 2010. Vol. 36. Pp. 133-138. DOI: 10.1134/S1068162010070216.
36. Дармограй С.В., Ерофеева Н.С., Филиппова А.С., Дубоделова Г.В., Морозова В.А., Дармограй В.Н. К хемо-таксономическому изучению некоторых видов растений семейства Гвоздичных (Caryophyllaceae Juss.), принадлежащих к различным его подсемействам // Международн. журн. прикл. фундамент, иссл. 2017. №1. С. 287-290.
37. Эрст А.А., Зибарева JI.H., Железниченко Т.В., Ковзунова О.В. Культура генетически трансформированных корней (hairy roots) Silene roemeri Friv. - источник получения фитоэкдистероидов // Вестн. Томского госуд. унив. 2017. №37. С. 17-30.
38. Kayser Н., Eilinger P. HPLC method for the analysis of acetonides of ecdysteroids providing structural information on different vicinal diols // Arch. Insect. Biochem. Physiol. 1999. Vol. 41. Pp. 162-170. DOI: 10.1002/(SICI)1520-6327(1999)41:3<162::AID-ARCH8>3.0.CO;2-O.
39. Мунхжаргал H, Зибарева JI.H., Оюнчимэг Д., Пяк А.И. Поиск экдистероидсодержащих видов во флоре Монголии и Русского Алтая // Вестн. Томск, гос. унив. 2007. № 305. С. 192-196.
40. Ревина Т.А., Ревушкина А.С., Ракитин А.В. Экдистероид содержащие виды из флоры Горного Алтая // Растит. ресурсы. 1988. Т. 34. С. 565-570.
41. Zang Х.-Р., Zhang J., Dong М., Zhang M.-L., Hun C.-H., Shi Q.-W., Gu Y.-C. Chemical constituents of plants from the genus Rhaponticum И Chem. Biodiv. 2010. Vol. 7. Pp. 594-609. DOI: 10.1002/cbdv.200800275.
42. Vorob'eva A.N., Rybin V.G., Zarembo E.V., Boltenkov E.V. Phytoecdysteroids from Serratilla centauroides И Chem. Nat. Сотр. 2005. Vol. 41. Pp. 105-106. DOI: 10.1007/sl0600-005-0090-2.
43. Олейников Д.Н., Кащенко Н.И. Фитоэкдистероиды родов Serratilla L. и Klasea Cass. (Asteraceae): Хеморазно-образие, методы выделения и анализа // Химия растит, сырья. 2017. № 4. С. 123-135. DOI: 10.14258/jcprm.2017042016.
44. Volodin V. V., Alexeeva L.I., Kolegova N.A., Sarker S.D., Sik V., Lafont R., Dinan L. Further ecdysteroids from Serratilla coronata L. (Asteraceae) // Biochem. Syst. Ecol. 1998. Vol. 26. Pp. 459^161. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00130-0.
45. Olennikov D.N. Phytoecdysteroids and flavonoids of Gastrolychnis tristis И Chem. Nat. Сотр. 2018. Vol. 54. Pp. 104-106.
46. Zibareva L. Distribution and levels of phytoecdysteroids in plants of the genus Silene during development // Arch. Insect Biochem. Physiol. 2000. Vol. 43. Pp. 1-8. DOI: 10.1002/(SICI)1520-6327(200001)43:1<1::AID-ARCH1>3,O.CO;2-D.
47. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei K., Lafont R. Isolation and identification of new ecdysteroids from the Caryophyllaceae // J. Nat. Prod. 1990. Vol. 53. Pp. 279-293. DOI: 10.1021/np50068a002.
48. Novozhilova E., Rybin V., Gorovoy P., Gavrilenko I., Doudkin R. Phytoecdysteroids of East Asian Caryophyllaceae //Pharmacogn. Magazine. 2015. Vol. 11. Pp. 225-230. DOI: 10.4103/0973-1296.157746.
49. Tomás J., Camps F., Claveria E., Coll J., Melé E., Messeguer J. Composition and location of phytoecdysteroids in Ajuga reptans in vivo and in vitro cultures // Phytochemistry. 1992. Vol. 31. Pp. 1585-1591. DOI: 10.1016/0031-9422(92)83112-C.
50. Takemoto Т., Okuyama Т., Jin H., Arai Т., Kawahara M., Konno C., Nabetani S. Arihara S., Hikino Y., Hikino H. Isolation of phytoecdysones from Japanese ferns // Chem. Pharm. Bull. 1973. Vol. 21. Pp. 2336-2338. DOI: 10.1248/cpb.21.2336.
51. Avdeeva E., Reshetov Y., Shurupova M., Zibareva L., Borisova E., Belousov M. Chemical analysis of bioactive substances in seven Siberian Saussurea species. AIP Conf. Proc. 2017. Vol. 1899. Art. No 050001. DOI: 10.1063/1.5009864.
52. Dinan L., Savchenko Т., Whiting P. On the distribution of phytoecdysteroids in plants. Cell. Molec. Life Sci. 2001. Vol. 58. Pp. 1121-1132.
53. Volodin V., Chadin I., Whiting P., Dinan L. Screening plants of European North-East Russia for ecdysteroids // Biochem. Syst. Ecol. 2002. Vol. 30. Pp. 525-578. DOI: 10.1016/S0305-1978(01)00128-4.
54. Dinan L. Distribution and levels of phytoecdysteroids within individual plants of species of the Chenopodiaceae // Eur. J. Entomol. 1995. Vol. 92. Pp. 295-300.
55. DellaGreca M., D'Abrosca В., Fiorentino A., Previtera L., Zarrelli A. Structure elucidation and phytotoxicity of ecdysteroids from Chenopodium album И Chem. Biodiv. 2005. Vol. 2. Pp. 457^162. DOI: 10.1002/cbdv.200590025.
56. Dinan L., Whiting P., Scott A.J. Taxonomic distribution of phytoecdysteroids in seeds of members of the Chenopodiaceae//Biochem. Syst. Ecol. 1998. Vol. 26. Pp. 553-576. DOI: 10.1016/S0305-1978(98)00005-2.
57. Savchenko Т., Whiting P., Sarker S.D., Dinan L. Analysis of species of the Ranunculaceae for ecdysteroid agonists and antagonists II. Ecdysteroids in the genus Anemone II Biochem. Syst. Ecol. 1998. Vol. 26. Pp. 131-134. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00086-0.
58. Sarker S.D., Savchenko Т., Whiting P., Sik V., Rees H.H., Dinan L. Analysis of species of the Ranunculaceae for ecdysteroid agonists and antagonists I: Ecdysteroids in the genus Pulsatilla. Biochem. Syst. Ecol. 1997. Vol. 25. Pp. 473^174. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00042-2.
Поступило в редакцию 30 декабря 2017 г.
После переработки 4 марта 2018 г.
Для цитирования: Олейников Д.Н., Кащенко Н.И. Методика быстрого анализа 20-гидроксиэкдизона в растениях и папоротниках с применением твердофазной экстракции на полиамиде и микроколоночной ВЭЖХ-УФ//Химия растительного сырья. 2018. №3. С. 41-52. БО!: 10.14258/]сргт.2018033639.
Olennikov D.N.*, Kashchenko N.I. METHOD OF THE RAPID ANALYSIS OF 20-HYDROXYECDYSONE CONTENT IN PLANTS AND FERNS USING SOLID-PHASE EXTRACTION ON POLYAMIDE AND MICROCOLUMN HPLC-UV
Institute of General and Experimental Biology, Siberian Branch, Russian Academy of Science, 6 Sakh 'yanovoy Street,
Ulan-Ude, 670047 (Russia), e-mail: [email protected]
A method for the rapid quantitative analysis of 20-hydroxyecdysone in plants was developed using the microcolumn re-versed-phase HPLC with UV detection (246 nm) on the ProntoSIL-120-5-C18 column (2x75 mm) and the gradient eluent system LiC104/HC104-acetonitrile. The chromatographic stage of the analysis was 5 minutes long, which made it possible to characterize the technique as the fastest. For preliminary purification of the plant extracts, solid phase extraction on polyamide was used which led to an increase in the sensitivity of the analysis. Validation studies showed that the technique characterized by satisfactory metrological data. The values of the limit of detection (LOD) and the limit of quantification (LOQ) of 20-hydroxyecdysone were 3.3 and 10 |xg/ml, respectively. The accuracy indices for various levels of 20-hydroxyecdysone content (80-120%) did not exceed 98.57-101.38%). The method applied to the analysis of 20-hydroxyecdysone in 359 species of flowering plants and 12 ferns species growing on the territory of the Buryatia Republic. The presence of 20-hydroxyecdysone was established in 22 species including 18 flowering plants and 4 ferns. The concentration levels of 20-hydroxyecdysone in plants varied from trace (Athyrium filix-femina, Diplazium sibiricum, Pteridium aquilinum) to very high (25.40 mg/g in Rhaponticum uniflorum and 25.87 mg/g in Silene jeniseensis). The presence of 20-hydroxyecdysone was firstly detected in three species including Gastrolychnis gracilis, G. saxatilis and Silene violascens. The developed technique is fast, simple, sensitive and stable and can be recommended for searching purpose to evaluate the new plant sources of 20-hydroxyecdysone.
Keywords: ecdysteroids, 20-hydroxyecdysone, quantitative analysis, solid phase extraction, microcolumn chromatography, HPLC, flora of Buryatia.
References
1. Abubakirov N.K. Chem. Nat. Comp., 1981, vol. 17, pp. 489-503. DOI: 10.1007/BF00574363.
2. Baltaev U.A. Russ. J. Bioorg. Chem., 2000, vol. 26, pp. 799-831.
3. Lafont R., Dinan L. J. Insect Sei., 2003, vol. 3, pp. 1-30.
4. Parr M.K., Botre F., Naß A., Hengevoss J., Diel P., Wolber G. Biol. Sport, 2015, vol. 32, pp. 169-173. D01:10.5604/20831862.1144420.
5. Volodin V.V., Sidorova Iu.S., Mazo V.K. Vopr. Pitan., 2013, vol. 82, pp. 24-30. (in Russ.).
6. Hu J., Luo C.X., Chu W.H., Shan Y.A., Qian Z.-M., Zhu G, Yu Y.B., Feng H. PLoS ONE, 2012, vol. 7, ID e50764. DOI: 10.1371/journal.pone.0050764.
7. Volodin V. V. Phytoecdysteroids. St Petersburg, 2003. 293 p. (in Russ.).
8. Katsarova M., Dimitrova S., Lukanov L., Sadakov F. Cr. Acad. Bulg. Sei., 2017, vol. 70, pp. 947-956.
9. Nikolaeva I.G., Tsybiktarova L.P., Garmaeva L.L., Nikolaeva G.G., Olennikov D.N., Matkhanov I.E. J. Anal. Chem., 2017, vol. 72, pp. 854-861. D01:10.1134/S1061934817080093.
10. Novozhilova E.V., Rybin V.G., Gorovoi P.G., Gavrilenko I.G. Turczaninowia, 2014, vol. 17, pp. 42^18. (in Russ.).
11. Stevens J.F., ReedR.L., Morre J.T. J. Agric. Food Chem., 2008, vol. 56, pp. 3945-3952. DOI: 10.1021/jfö00211k.
12. Rybin V., Boltenkov E., Novozhilova E. Nat. Prod. Comm., 2007, vol. 2, pp. 1101-1104.
13. Ghosh D., Laddha K.S. J. Chromatogr. Sei., 2006, vol. 44, pp. 22-26
14. Lapenna S., Dinan L. J. Chromatogr. B, 2009, vol. 877, pp. 2996-3002. D01:10.1016/j.jchromb.2009.07.014.
15. Karusevich A.A., Moiseev D.V., Buzuk G.N. Vestn. Pharmats., 2007, vol. 37, pp. 1-5. (in Russ.).
16. Zibareva L.N., Volkova O.V., Morozov S.V., Chernyak E.I. Khim. Rastit. Syr'ya. 2017. №1. C. 71-75. DOI: 10.14258/jcprm.2017011416. (in Russ.).
17. Da Rosa H.S., Salgueiro A.C.F., Colpo A.Z.C., Paula F.R., Mendez A.S.L., Folmer V. Braz. J. Med. Biol. Res., 2016, vol. 49, E5282. DOI: 10.1590/1414-431X20165282.
18. Hunyadi A., Gergely A., Simon A., Töth G, Veress G., Bäthoril M. J. Chromatogr. Sei., 2007, vol. 45, pp. 76-86.
19. Wilson I.D., Morgan E.D., Lafont R., Shockcor J.P., Lindon J.C., Nicholson J.K., Wright B. Chromatographia, 1999, vol. 49, pp. 374-378. DOI: 10.1007/BF02467609.
20. Al'magambetov A.M., Tuleuov B.I., Adekenov S.M. Biological features of medicinal and aromatic plants and their role in medicine, 2016, pp. 444^146. (in Russ.).
21. Meng Y., Whiting P., Zibareva L., Bertho G., Girault J.-P., Lafont R., Dinan L. J. Chromatogr. A, 2001, vol. 935, pp. 309-319. DOI: 10.1016/S0021-9673(01)00893-7.
22. Reixach N., Lafont R., Camps F., Casa J. Eur. J. Biochem., 1999, vol. 266, pp. 608-615. D01:10.1046/j.l432-1327.1999.00905.x.
23. Ho R., Girault J.-P., CousteauP.-Y., Bianchini J.-P., Raharivelomanana P., Lafont R. J. Chromatogr. Sei., 2008, vol. 46, pp. 102-110. D01:10.1093/chromsci/46.2.102.
24. Punegov V.V., Savinovskaya N.S. Rastit. Resursy, 2001, vol. 37, pp.97-102. (in Russ.).
25. Olennikov D.N, Kashchenko N.I. Chem. Nat. Comp., 2017, vol. 53, pp. 1199-1201. DOI: 10.1007/sl0600-017-2239-l.
26. Tsybiktarova L.P. Farmakognosticheskoye issledovanie Serratula centauroides L. I razrabotka lekarstvennogo sredstva na eyo osnove, obladaushego adaptogennoi aktivnost'yu: dis. ... kand. farm. nauk. [Pharmacognostic research of Serratula centauroides L. and the development of the medical remedy with adaptogenic activity: dis. cand. pharm, sciences], Ulan-Ude, 2016. 200 p. (in Russ.).
27. Petruk A.A., Vysochina G.I., Ershova E.A. Khim. Rastit. Syr'ya, 2013, №4, pp. 151-157. DOI: 10.14258/jcprm. 1304151. (in Russ.).
28. Alieva N.K., Nigmatullaev A.M., Bobaev I.D., Taizhanov K., Ramazanov N.Sh. Rastit. Resursy, 2014, vol. 50, pp. 505-512. (in Russ.).
29. Abdukadirov I.T., Yakubova M.R., Nuriddinov Kh.R., Mamatkhanov A.U., Turakhozhaev M.T. Chem. Nat. Сотр., 2005, vol. 41, pp. 475^176. D01:10.1007/sl0600-005-0184-x.
30. Wang Y.-H., Avula В., Jadhav A.N., Smillie T.J., Khan I.A. Rapid Commun. Mass Spectrom., 2008, vol. 22, pp. 2413-2422. D01:10.1002/rcm.3625.
31. Snogan E., Vahirua-Lechat I., Ho R., Bertho G., Girault J.-P., Ortiga S., Maria A., Lafont R. Phytochem. Anal., 2007, vol. 18, pp. 441^150. D01:10.1002/pca.l000.
32. Wu J.-J., Cheng K.-W., Wang H., Ye W.-C., Li E.T.S., Wang M. Phytochem. Anal., 2009, vol. 20, pp. 58-63. DOI: 10.1002/pca. 1097.
33. Shi Q., Yan S., Liang M., Yang Y., Wang Y., Zhang W. J. Pharm. Biomed. Anal., 2007, vol. 43, pp. 994-999. D01:10.1016/j.jpba.2006.09.028.
34. Louden D., Handley A., Taylor S., Lenz E., Miller S., Wilson I.D., Sage A., Lafon R. J. Chromatogr. A, 2001, vol. 910, pp. 237-246. DOI: 10.1016/S0021-9673(00)01204-8.
35. Munkhzhargal N, Zibareva L.N., Lafont R., Pribytkova L.N., Pisareva S.I. Russ. J. Bioorg. Chem., 2010, vol. 36, pp. 133-138. DOI: 10.1134/S1068162010070216.
36. Darmograi S.V., Erofeeva N.S., Filippova A.S., Dubodelova G.V., Morozova V.A., Darmograi V.N. Mezhdunarodn. Zhurn. Prikl. Fundament. Issled., 2017, №1, pp. 287-290. (in Russ.).
37. Erst A.A., Zibareva L.N., Zheleznichenko Т. V., Kovzunova О. V. Vestn. Tomsk. Gosud. Univ., 2017, №37, pp. 17-30. (in Russ.).
38. Kayser H., Eilinger P. Arch. Insect. Biochem. Physiol., 1999, vol. 41, pp. 162-170. DOI: 10.1002/(SICI)1520-6327(1999)41:3<162::AID-ARCH8>3.0.CO;2-O.
39. Munkhzhargal N, Zibareva L.N., Oyunchimeg D., Pyak A.I. Vestn. Tomsk. Gosud. Univ., 2007, № 305, pp. 192-196. (in Russ.).
40. Revina T.A., Revushkina A.S., Rakitin A.V. Rastit. Resursy, 1988, vol. 34, pp. 565-570. (in Russ.).
41. Zang X.-P., Zhang J., Dong M., Zhang M.-L., Hun C.-H., Shi Q.-W., Gu Y.-C. Chem. Biodiv., 2010, vol. 7, pp. 594609. DOI: 10.1002/cbdv.200800275.
42. Vorob'eva A.N., Rybin V.G., Zarembo E.V., Boltenkov E.V. Chem. Nat. Сотр., 2005, vol. 41, pp. 105-106. DOI:10.1007/sl0600-005-0090-2.
43. Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Khim. Rastit. Syr'ya, 2017, № 4, pp. 123-135. DOI: 10.14258/jcprm.2017042016. (in Russ.).
44. Volodin V.V., Alexeeva L.I., Kolegova N.A., Sarker S.D., Sik V., Lafont R., Dinan L. Biochem. Syst. Ecol., 1998, vol. 26, pp. 459^161. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00130-0.
45. Olennikov D.N. Chem. Nat. Сотр., 2018, vol. 54, pp. 104-106.
46. Zibareva L. Arch. Insect Biochem. Physiol., 2000, vol. 43, pp. 1-8. DOI: 10.1002/(SICI)1520-6327(200001 )43: K1:: AID-ARCH1>3.0. CO;2-D.
47. Girault J.-P., Bathori M., Varga E., Szendrei К., Lafont R. J. Nat. Prod., 1990, vol. 53, pp. 279-293. DOI: 10.1021/np50068a002.
48. Novozhilova E., Rybin V., Gorovoy P., Gavrilenko I., Doudkin R. Pharmacogn. Magazine, 2015, vol. 11, pp. 225230. DOI: 10.4103/0973-1296.157746.
49. Tomás J., Camps F., Claveria E., Coll J., Melé E., Messeguer J. Phytochemistry, 1992, vol. 31, pp. 1585-1591. DOI: 10.1016/0031-9422(92)83112-C.
50. Takemoto Т., Okuyama Т., Jin H., Arai Т., Kawahara M., Konno C., Nabetani S. Arihara S., Hikino Y., Hikino H. Chem. Pharm. Bull., 1973, vol. 21, pp. 2336-2338. DOI: 10.1248/cpb.21.2336.
51. Avdeeva E., Reshetov Y., Shurupova M., Zibareva L., Borisova E., Belousov M. AIP Conf. Proc., 2017, vol. 1899, Art. No 050001. DOI: 10.1063/1.5009864.
52. Dinan L., Savchenko Т., Whiting P. Cell. Molec. Life Sei., 2001, vol. 58, pp. 1121-1132.
53. Volodin V., Chadin I., Whiting P., Dinan L. Biochem. Syst. Ecol., 2002, vol. 30, pp. 525-578. DOI: 10.1016/S0305-1978(01)00128-4.
54. Dinan L. Eur. J. Entomol., 1995, vol. 92, pp. 295-300.
55. DellaGreca M., D'Abrosca В., Fiorentino A., Previtera L., Zarrelli A. Chem. Biodiv., 2005, vol. 2, pp. 457^162. DOI: 10.1002/cbdv.2005 90025.
56. Dinan L., Whiting P., Scott A.J. Biochem. Syst. Ecol., 1998, vol. 26, pp. 553-576. DOI: 10.1016/S0305-1978(98)00005-2.
57. Savchenko Т., Whiting P., Sarker S.D., Dinan L. Biochem. Syst. Ecol., 1998, vol. 26, pp. 131-134. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00086-0.
58. Sarker S.D., Savchenko Т., Whiting P., Sik V., Rees H.H., Dinan L. Biochem. Syst. Ecol., 1997, vol. 25, pp. 473^174. DOI: 10.1016/S0305-1978(97)00042-2.
Received December 30, 2017 Revised March 4, 2018
For citing: Olennikov D.N., Kashchenko N.I. Khimiya Rastitel'nogo Syr'ya, 2018, no. 3, pp. 41-52. (in Russ.). DOI: 10.14258/jcprm.2018033639.
