CC BY
67
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
УДК 579.6
ВЫДЕЛЕНИЕ ЭПИФИТНЫХ ШТАММОВ AUREOBASIDIUM PULLULANS, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ
О.И. Сазонова, А.А. Ветрова, А.Б. Гафаров, С.Л. Соколов
Исследованы три штамма микромицетов, А3, Т2.1 и F11, выделенные методом прямого высева на селективной среде с салицилатом в качестве единственного источника углерода. Все три штамма были идентифицированы как Aureobasidium pul-lulans. Установлено, что изолированные микроорганизмы способны продуцировать эк-зополисахариды массой около 500 кДа и выше. Впервые показана способность штаммов A. pullulans использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии.
Ключевые слова: экзополисахариды, Aureobasidium pullulans, салицилат, фил-лосфера.
Во многих странах с развитым биотехнологическим производством большое внимание уделяется процессам промышленного получения внеклеточных полисахаридов (экзополисахаридов, ЭПС), имеющих микробное происхождение. Они обладают такими важными для потребителей свойствами, как студнеобразование, загущение, влагоудержание, стабилизация, эмульгирование и др. [1]. Биоразлагаемость, нетоксичность, возобновляемость и другие вышеперечисленные свойства обеспечивают ЭПС применение при переработке сельхозпродукции, в медицине и во многих отраслях промышленности (нефтяной, пищевой, косметической, фармацевтической и др.). Кроме того, микробные полисахариды, в отличие от часто применяемых в России растительных ЭПС, обладают широким диапазоном свойств, на которые можно влиять, изменяя условия культивирования штаммов микроорганизмов [2].
Способность синтезировать ЭПС в количествах, представляющих интерес для их промышленной наработки, обнаружена у представителей различных родов бактерий (Xanthomonas, Acetobacter, Acinetobacter, Arthrobacter, Azotobacter, Paracoccus, Pseudomonas и др.), дрожжей (Cryptococcus, Hansenula, Saccharomyces и др.), микромицетов (Aureobasidium, Sclerotium и др.).
Среди вышеперечисленных микроорганизмов особое внимание следует уделить продуценту разнообразных экзополисхаридов -представителю аскомицетов Aureobasidium pullulans. Данный микроорганизм является эпифитным микроорганизмом, достаточно широко используется в биотехнологии, являясь потенциальным
источником промышленных ферментов (амилазы, ксиланазы, пектиназы), полисахаридной смолы, пуллулана [3, 4].
Целью данной работы являлся поиск, выделение и характеристика эпифитных аскомицетов, способных к синтезу внеклеточных полисахаридов.
Материалы и методы
В работе изучали три штамма аскомицетов, АЗ, Т2.1 и F11, выделенные методом прямого высева на минеральной среде Эванса с салицилатом в качестве единственного источника углерода и энергии как описано в работе [5].
Штаммы выращивали в среде 1/10 TSB (Tryptic Soy Broth) фирмы Sigma-Aldrich (США), а также в минеральной среде Эванса [6] при 28°С на качалке в течение 14-16 часов. Для приготовления агаризованной среды использовали Agar-Agar American type QP фирмы Panreac (Испания). В качестве единственного источника углерода и энергии в минеральную среду добавляли салицилат натрия в концентрации 1 г/л.
Геномную ДНК микроорганизмов выделяли с использованием AxyPrep Bacterial Genomic DNA MiniPrep Kit по протоколу фирмы-изготовителя («Axygen Biosciences», США).
Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакцию проводили в стандартных условиях, при конечной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов 200 мкМ и 1,5 мМ MgCl2. Для амплификации внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) и определения его первичной нуклеотидной последовательности использовали олигонуклеотидные праймеры ITS1-F (5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-З') и ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-З) [7, 8]. Размер амплифицированного фрагмента составлял около 620 п.н.
Электрофорез ДНК проводили в 0,8 % агарозном геле в 0,5 x трис-боратном буфере по стандартной методике [9]. Визуализацию ДНК проводили путем окрашивания геля в растворе бромистого этидия.
Идентификацию выделенных микроорганизмов-деструкторов осуществляли, используя систему MALDI Biotyper (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) по протоколу фирмы-изготовителя («Bruker Daltonics», Германия). Пробы для анализа готовили согласно [10].
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли c помощью генетического анализатора ABI З1З0 xl Analysis System («Applied Biosystem», США) по протоколу фирмы производителя. Анализ идентичности нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).
Эволюционные расстояния рассчитывали методом максимального правдоподобия на основе модели Tamura-Nei [11]. Исходные дендрограммы для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Joining и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием метода максимального правдоподобия (MCL). Эволюционный анализ и конструирование филогенетического дерева были проведены с использованием программного пакета MEGA v. 7.0 [12].
Способность штаммов продуцировать экзополисахариды проверяли в двух жидких питательных средах следующего состава:
- пептон 0,2 %, K2HPO4 0,2 %, NaCl 0,2 %, MgSÜ4 0,04 %, FeSÜ4 0,001 %, сахароза в конечной концентрации 10%;
- пептон 0,2 %, K2HPO4 0,2 %, NaCl 0,2 %, MgSÜ4 0,04 %, FeSÜ4 0,001 %, глюкоза в конечной концентрации 10 %.
Предварительно микроорганизмы выращивали в жидкой минеральной среде с салицилатом до OD62o = 0,6 - 0,8; затем инокулят (1 мл на 100 мл среды) переносили в ферментационные колбы с добавлением соответствующего углевода (см. выше). Ферментацию проводили 5-7 суток.
Экзополисахариды из культуральной жидкости осаждали тремя объемами метанола; полученный осадок промывали 96 %-ным этанолом и высушивали до постоянной массы. С полученными препаратами провели качественную реакцию на углеводы с a-нафтолом (реакция Подобедова -Молиша).
Молекулярно-массовое распределение и среднюю молекулярную массу полисахаридов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при помощи системы Agilent 1100 («Agilent Technologies», США) с рефрактометрическим детектором по протоколу фирмы-изготовителя. В работе использовали колонку BioSil TSK 250 (7,5 х 300 мм) фирмы Bio-Rad (США); элюент - натрий-ацетатный буфер (0,1 М, рН 5,0) с добавлением 0,15 M NaCl, скорость потока - 1 мл/мин Калибровку хроматографической колонки осуществляли по декстранам («Pharmacia Fine Chemicals», Швеция) с молекулярными массами в диапазоне 500000-20000 Да и мальтоолигосахаридам с массами 2610, 1620 и 900 Да («Aldrich», США, «Merck», Германия). Калибровочный график близок к линейному в диапазоне молекулярных масс 110000-2600 Да (время выхода максимума пика 11,2 - 21,4 мин).
Навески растворяли в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,0) с добавлением 0,15 M хлорида натрия в течение 2 часов; концентрация составляла 5 мг/мл. Перед анализом все образцы центрифугировали при 14000 g в течение 5 минут.
Результаты и их обсуждение
Объектами нашего исследования были три штамма аскомицетов, А3, Т2.1 и F11, выделенные с поверхности листовых пластинок трех видов древесных растений (клена, липы и ясеня) методом прямого высева на минеральной среде Эванса с салицилатом в качестве единственного источника углерода и энергии. Видовую принадлежность исследуемых микроорганизмов определяли, используя масс-спектрометрическую систему MALDI Biotyper; полученные результаты подтверждали секвенированием ITS региона. Данные методы позволили установить, что все исследуемые штаммы относятся к виду Aureobasidium pullulans, представители которого широко распространены в природе и нередко встречаются в местах с изменчивой влажностью, таких как филлосфера
[13].
Для филогенетического сравнения исследуемых в данной работе штаммов A. pullulans были выбраны последовательности ITS регионов различных штаммов грибов рода Aureobasidium. Как видно из рис. 1 ITS последовательности штаммов A. pullulans А3, Т2.1 и F11 полностью идентичны таковым у штаммов A. pullulans Sib5-3-1, ICMP:21612 и KUC3002, что подтверждает таксономическую принадлежность выделенных нами штаммов к виду Aureobasidium pullulans.
Aureobasidium pullulans, черный дрожжеподобный гриб, является продуцентом различных экзополисахаридов используемых в пищевой, легкой, фармацевтической, нефтяной и других отраслях промышленности. Представители данного вида обладают широкой субстратной специфичностью и могут утилизировать такие соединения, как целлобиозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, глицерин, ксилозу, фруктозу, ксилитол, раффинозу, но не целлюлозу, хитин, сукцинат и салицилат [14]. В настоящей работе впервые показана способность штаммов A. pullulans использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии.
Для изучения способности изолированных в ходе данной работы штаммов A. pullulans продуцировать экзополисахариды, грибы выращивали в течение 7 суток в жидкой питательной среде (см. раздел «Материалы и методы») с двумя разными источниками углерода -глюкозой или сахарозой. Образование внеклеточных полисахаридов замечено во всех исследуемых образцах как на среде с глюкозой, так и с сахарозой. Независимо от использованного источника углерода выход экзополисаридов практически не менялся ни у одного из исследованных в работе штаммов A. pullulans и составлял в среднем 0,74, 0,93 и 1,62 г для грибов, выделенных с поверхности листовых пластинок клена, ясеня и липы соответственно.
Aureobasidium pullulans Т2.1 Aureobasidium pullulans A3 Aureobasidium pullulans F11
— A. pullulans Sib5-3-1 (KX100335.1) A. pullulans ICMP: 21612 (MF687197.1)
- A, pullulans KUC3002 (KY294714.1)
A. proteae (KT693732.1)
-A. namibiae (KT693730.1)
A. melanogenum (KT693728 1)
-A. luecospermi (KT693684 1)
-A. subglaciale (FJ150896.1)
A.caulivorum (KT693740.1)
-A. thailandense (EU719513.1)
0.0050
Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения последовательностей ITS региона различных представителей рода Aureobasidium. Полужирным шрифтом выделены изученные в данной работе эпифитные штаммы Aureobasidium pullulans. В скобках приведены номера нуклеотидных последовательностей в GenBank
Гель-проникающая хроматография высокого разрешения позволила установить молекулярно-массовое распределение и среднюю молекулярную массу полученных препаратов внеклеточных полисахаридов. Все образцы имели основной пик высокомолекулярных продуктов массой около 500 кДа, а также некоторое количество более низкомолекулярных компонентов (от 1 кДа до 9 кДа). Без дополнительной очистки содержание высокомолекулярных продуктов в препаратах экзополисахаридов составляло от 85 до 98 %. Хроматографический профиль одного из образцов представлен на рис. 2.
Известно, что грибы рода Aureobasidium могут накапливать темный пигмент меланин в клеточной стенке. Интенсивность образования культурами A. pullulans этого пигмента различна и зависит от состава питательной среды, в частности от источника углерода [15]. Так, было показано, что в среде с ксилозой или глюкозой образцы внеклеточных полисахаридов имеют окраску от зеленой до черной (загрязнены пигментом), а в среде с сахарозой или лактозой - белую. У штаммов A. pullulans, изученных в настоящей работе, на среде с глюкозой не наблюдается меланиногенез, что делает их перспективными для использования в различных отраслях промышленности.
500 кДа
g 1400
1 1200
U
S3 1000
<L>
Ы
О 800
1=1
G
о С 600
400
200
0
-200
)
1
1_
|_
1
0 5 10 15 20 25 3
Время, мин
Рис. 2. Хроматограмма образца экзополисахарида штамма A. pullulans A3. Хроматограмма получена на колонке BioSil TSK 250 (7.5 х 300 мм)
Список литературы
1. Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов / под ред. Н.П. Елинова. М.: Высшая школа, 1984. 156с.
2. Кочетков Н.К. Синтез полисахаридов / под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Наука, 1994. 219с.
3. Deshpande M.S., Rale V.B., Lynch J.M. Aureobasidium pullulans in applied microbiology: A status report // Enzym. Microb. Tech. 1992. Vol. 14. P. 514 - 527.
4. Leathers T.D. Biotechnological production and applications of pullulan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. Vol. 62. P. 468 - 473.
5. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat: Methods in Microbiology. Vol. 2. / Eds.: J.R. Norris, D.W. Ribbons. London: Acad. Press, 1970. P. 277 -327.
6. Gardes, M. and Bruns, T.D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to identification of mycorhizae and rusts // Molecular Ecology. 1993. Vol. 2. P. 113 - 118.
7. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White [et al.]. New York: Academic Press, 1990. P. 315322.
8. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. / Eds. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G.
Seidman, J.A. Smith, K. Struhl. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1626 p.
9. Bacterial species identification from MALDI-TOF mass spectra through data analysis and machine learning / K. De Bruyne, B. Slabbinck, W. Waegeman [et al.] // Systematic and Applied Microbiology. 2011. Vol. 34. P. 20 - 29.
10. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular biology and evolution. 1993. Vol. 10. №3. P. 512526.
11. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger data sets // Molecular biology and evolution. 2016. Vol. 33. №7. P. 1870-1874.
12. Эпифитные микроорганизмы-деструкторы ароматических углеводородов филлосферы городских древесных растений / О.И. Сазонова [и др.] // Микробиология. 2017. Т. 86. № 1. С. 72 - 79.
13. Morphogenesis and adhesion of Aureobasidium pullulans / J.H. Andrews, R.F. Harris, R.N. Speaer [et al.] // Canadian Journal of Microbiology. 1994. Vol. 40. P. 6-17.
14. Thailand habitats as sources of pullulan-producing strains of Aureobasidium pullulans / S. Prasongsuk, R.F. Sullivan, M. Kuhirun // World J. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 21. P. 393-398.
15. Шубаков А.А., Елькина Е.А., Ларина В.Е. Продуцирование пуллулана дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans ВКПМ F-571 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2007. Т. 3. № 2. С. 26 - 30.
Сазонова Олеся Ивановна, канд. биол. наук, науч. сотр., [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук,
Ветрова Анна Андрияновна, канд. биол. наук, науч. сотр., [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущинский государственный естественно-научный институт,
Гафаров Арслан Булатович, науч. сотр., gafarov@,ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук,
Соколов Сергей Львович, канд. биол. наук, науч. сотр., [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущинский государственный естественнонаучный институт
ISOLATION OF EPIPHITIC AUREOBASIDIUM STRAINS PRODUCING HIGH-MOLECULAR WEIGHT EXOPOLYSACCHARIDES
O.I. Sazonova, A.A. Vetrova, A.B. Gafarov, S.L. Sokolov
Three Aureobasidium strains, A3, T2.1 and F11, isolated by direct plating on a selective medium with salicylate as a sole carbon source have been studied. All strains above have been taxonomically identified as Aureobasidium pullulans, and they are able to produce exopolysaccharides with a molecular mass of about 500 kDa and higher. The ability of A. pullulans strains to use salicylate as a sole source of carbon and energy has been demonstrated for the first time.
Key words: exopolysaccharides, Aureobasidium pullulans, salicylate, phyllosphere
Sazonova Olesya Ivanovna, Candidate of Biological Sciences, Researcher, [email protected], Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Vetrova Anna Andriyanovna, Candidate of Biological Sciences, Researcher, [email protected], Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences; Pushchino State Institute of Natural Sciences,
Gafarov Arslan Bulatovich, Researcher, gafarov@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,
Sokolov Sergey Lvovich, Candidate of Biological Sciences, Researcher, sls@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences; Pushchino State Institute of Natural Sciences
