Влияние температуры на физиологическую активность бактерии рзеивомошз putida BS3701 при росте в среде с салицилатом Текст научной статьи по специальности «Экологические биотехнологии»

УДК 579.22

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИИ PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 ПРИ РОСТЕ В СРЕДЕ С САЛИЦИЛАТОМ

А.А. Иванова, А.А. Ветрова, О.Н. Понаморева

Проведен сравнительный анализ физиологические параметров бактерий бактерии Pseudomonasputida BS3701 в ходе культивирования в жидкой минеральной среде с салицилатом при температурах 24 и 4 °С. Удельные скорости роста бактерий при температуре 24 °С в экспоненциальный фазе составила 0,73 ч-1 и при 4°С - 0,05 ч-1. Потребление салицилата при 4 °С начиналось с большой задержкой по времени, что связано с адаптацией клеток микроорганизмов к низкой температуре окружающей среды.

Ключевые слова: Pseudomonas putida, биодеградация, низкая температура, са-лицилат

Введение

В связи с растущими объемами нефтедобычи в регионах с холодным климатом возникает необходимость разработки биотехнологий очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Одними из наиболее токсичных и устойчивых к деградации соединений, входящих в состав нефти, являются полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Известно, что основную роль в деградации ПАУ играют микроорганизмы-деструкторы, в частности бактерии рода Pseudomonas. Штамм Pseudomonas putida BS3701 является эффективным деструктором нафталина и других ПАУ [1, 2]. Несмотря на то, что процесс микробной биодеградации ПАУ у псевдоманад, в частности у этого штамма, хорошо изучен и описан в литературе. Данные об этом процессе в условиях пониженных температур практически отсутствуют. Известно, что адаптация бактерий к условиям пониженных температур проявляется, прежде всего, в изменении состава мембран и синтезе криопротекторов [3]. Другой механизм адаптации к низким температурам связан с изменением метаболизма, например, за счет накопления в клетках больших количеств наиболее важных ферментов или изменения их конформации таким образом, что функционирование ферментных систем позволяет клетке поддерживать активность даже при неоптимальной температуре окружающей среды [4].

Салицилат играет важную роль индуктора ферментов путей деградации нафталина [5], поэтому исследование влияния температуры окружающей среды на способность бактерий метаболизировать салицилат при пониженных температурах является важным этапом в понимании

механизмов адаптации бактерий к условиям выживания и роста при пониженных температурах.

Материалы и методы

Штамм бактерий. В работе использовали бактерии Pseudomonas putida BS3701 (pBS1141, pBS1142), выделенные из почвенных образцов, загрязненных нефтепродуктами и отходами коксохимических производств на территории Московской области и описанные как деструкторы нафталина и фенантрена [1].

Культивирование бактерий. Бактерии культивировали в жидкой минеральной среде в присутствии салицилата при температурах 24 и 4 °С. Для определения численности бактерий использовали метод серийных разведений с последующим высевом на богатую агаризованную среду Луи-Бертрана.

Количественное определение салицилата. Концентрацию салициловой кислоты определяли спектрофотометрически по калибровочной кривой на спектрофотометре «Sintra 6 UV». Для этого супернатант исследуемых культур (0,5 мл) разводили дистиллированной водой до 3 мл. Затем добавляли 0,5 мл 5 % Fe(NO3) и 0,5 мл 1% HNO3, инкубировали при комнатной температуре 10 мин и измеряли оптическое поглощение раствора при 540 нм.

Результаты и их обсуждение

Численность микроорганизмов в ходе культивирования при температурах 24 и 4 °С в жидкой минеральной среде в присутствии салицилата определяли с использованием метода серийных разведений с последующим высевом на богатую агаризованную среду Лурия-Бертани в трех повторах. Параллельно определяли изменение концентрации салицилата в культуральной среде. Физиологическое поведение бактерий при температурах 24 и 4 °С значительно различается.

При 24 °С наблюдается рост микроорганизмов с параллельным быстрым потреблением субстрата - салицилата. В результате через 30 ч роста бактерий в культуральной среде салицилат исчезает. Следует отметить, что в последующие 8 ч наблюдается вторичный рост культуры, вероятно, за счет потребления накопленных метаболитов, образовавшихся в результате окисления салицилата (рис. 1). В течение первых 5 часов культивирования при 24°С наблюдается снижение численности живых клеток, вероятно, за счет токсического эффекта салицилата, при этом происходит адаптация бактерий, что обеспечивает постепенный рост культуры в последующие часы (рис. 2). Удельные скорости роста Pseudomonas putida BS3701 при температуре 24 °С в экспоненциальный фазе (4 - 12 ч) составила 0,73 ч-1, а при вторичном росте - 0,18 ч-1 (32 -38 ч).

.он

соон

nah G

Салициловая кислота

Катехол

ОН

ОН

ОН

Орто-расщепление

Мета- "" расщепление nah HILNJK

НО ^ СООН Гентизиновая кислота

Сукцинил СоА

+

ацетил СоА

Пируват +

ацет альдегид

Пируват +

фумарат

Рис. 1. Биодеградация салицилата

Рис. 2. Кривая роста P. putida BS3701 и потребление салицилата при температуре 24°С

При температуре 4 °С культура имела длительный период адаптации (60 ч) (рис. 3). В первые 10 ч культивирования не происходило изменений количества жизнеспособных клеток, вероятно, из-за низкой скорости биохимических и физиологических процессов, в том числе адаптации бактерий к условиям пониженных температур (например, изменения жирнокислотного состава мембран) [6]. Для поддержания текучести мембран и проницаемости для питательных веществ происходит превращение насыщенных жирных кислот в ненасыщенные при участии десатураз, индуцируемых понижением температуры окружающей среды, а также предпочтительный синтез короткоцепочечных жирных кислот и жирных кислот с разветвленным строением цепи [7]. Неадаптированные клетки были менее чувствительны к токсическому действию салицилата. Мы предположили, что это обусловлено невысокой проницаемой способностью мембран для салицилата при пониженных температурах. В

период с 10 до 60 ч культивирования при 4 °С наблюдалось изменение численности микроорганизмов (рис. 3). Вероятно, после изменения текучести мембран бактерий в ходе адаптации в первые часы культивирования увеличилась проницаемость для салицилата, который может являться ингибитором роста бактерий [8].

Рис. 3. Кривая роста Pseudomonasputida BS3701 и потребление салицилата при температуре 4°С

В течение первых 60 ч культивирования содержание салицилата в среде фактически оставалось на исходном уровне (рис. 3). Максимальной численности культура достигала через 97 ч культивирования, причем, максимальная удельная скорость роста в период (60 - 97 ч) составила 0,05 ч-1. К моменту, когда субстрат полностью поглощен (рис. 3), - через 100 ч, численность бактерий оставалась все еще на высоком уровне - 8*107 КОЕ/мл. Возможно, это связано с особенностями фазы отмирания культуры при пониженной температуре. Отмирание бактерий - процесс, связанный с метаболической активностью. Если эта активность заторможена, например, низкой температурой, то клетки могут сохранять жизнеспособность очень долго, например, в вечной мерзлоте или при криоконсервации [8].

Важной практической характеристикой физиологического поведения бактерий является экономический коэффициент, который показывает, сколько биомассы бактерий вырастает при потреблении одного грамма субстрата. Экономический коэффициент рассчитывают по формуле:

dX

Y = — * 100%

dS ,

где Y - экономический коэффициент; x - концентрация биомассы, г; S -концентрация потребленного субстрата, г.

Экономический коэффициент при температуре 4 °С составил 3,3, а при 24 °С - 3,7. Вероятно при 24 °С бактерии более эффективно используют салицилат как источник углерода и энергии, так как требуется меньше энергетических затрат для адаптации бактерий к факторам окружающей среды.

Таким образом, сделано предположение, что в начальный период роста культуры сначала при низкой температуре происходит адаптация бактерий к физическим факторам окружающей среды, в том числе за счет изменения состава мембраны, а затем в результате увеличения проницаемости мембраны микроорганизмов - адаптация к салицилату.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 16-38-50011 мол_нр.

Список литературы

1. Штамм Pseudomonas - деструктор нафталина и фенантрена / Н.В. Балашова, И. А. Кошелева, А.Е. Филонов [и др.] // Микробиология. 1997. Т.66. № 4. С. 480-493.

2. Биодеградация фенантрена и взаимодействие Pseudomonas putida BS3701 и Burkholderia sp. BS 3702 в ризосфере растений / А.А. Овчинникова, А.А. Ветрова, А.Е. Филонов [и др.] // Микробиология. 2009. Т.78. № 4. С.1-7.

3. De Carvalho Clara C.C.R.. Adaptation of Rhodococcus erythropolis cells for growth and bioremediation under extreme conditions // Research in Microbiology. 2012. V.163. I.2. P.125-136.

4. Margesin R., Moertelmaier Ch., Mair J. Low-temperature biodegradation of petroleum hydrocarbons (n-alkanes, phenol, anthracene, pyrene) by four actinobacterial strains // International Biodeterioration and Biodegradation. 2013. V.84. P. 185-191.

5. scp^-Новый ген салицилатгидроксилазы, локализованной на плазмидах деградации салицилата/капролактама / А.В. Панов, О.В. Волкова, И.Ф. Пунтус [и др.] // Молекулярная биология. 2013. Т.47. № 1. С.116-123.

6. Chattopadhyay M. K. Mechanism of bacterial adaptation to low temperature // Journal of Biosciences. 2006. V. 31. I.1. P.157-165.

7. Suutari M. and Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation // Critical Reviews in Microbiology. 1994. V. 20. P. 285-328.

8. Сазонова О.И., Измалкова Т.Ю., Боронин А.М. Деградация салицилата штаммами Pseudomonas putida без участия "классического" паИ2-оперона // Микробиология. 2008. Т. 77. №6. С. 798-804.

Понаморева Ольга Николаевна, д-р хим. наук, проф., [email protected], Россия, Тула, Тульский государственный университет,

Иванова Анастасия Алексеевна, канд. биол. наук, mrs. [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук,

Ветрова Анна Андрияновна, канд. биол. наук, [email protected], Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук

EFFECT OF TEMPERATURE ON THE PHYSIOLOGICAL ACTIVITY OF BACTERIA PSEUDOMONAS PUTIDA BS3701 IN MEDIUM

WITH SALICYLATE

A.A. Ivanova, A.A. Vetrova, O.N. Ponamoreva

Physiological characteristics of strain Pseudomonas putida BS3701 bacteria during the culture were examined in liquid mineral medium with salicylate as a carbon and energy source at the temperature of 4 ° C. Consumption salicylate test strains at 4 ° C started with a time delay, which is associated with the adaptation of the microorganism cells to low temperatures.

Keywords: Pseudomonas putida, biodegradation, low temperature, salicylate

Ponamoreva Olga Nikolaevna, doctor of chemical sciences, professor, [email protected], Russia, Tula, Tula State University

Ivanova Anastasia Alexeevna, candidate of biological sciences, [email protected], Russia, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms (IBPM), RAS

Vetrova Anna Andriyanovna, candidate of biological sciences, [email protected], Russia, Pushchino, Pushchino, Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms (IBPM), RAS