CC BY
13Выбор кластерных моделей для исследования электронной структуры и динамики атомного остова гемсодержащих белков методами QM/MM и ONIOM
Романова Т. А. (1), Краснов П. О. (2), Аврамов П. В. ([email protected]) (2)
(1) Институт вычислительного моделирования СО РАН, г. Красноярск (2)Институт физики им. Л. В Киренского СО РАН, г. Красноярск
Основные функции железа в биологических системах - транспорт кислорода и участие в цепи переноса электрона. В этих случаях железо входит в структуру гема, который тесно связан с молекулой белка. Хелатный комплекс протопорфирина с Fe (II) называется протогемом или просто гемом, аналогичный комплекс с Fe (III) - гемин или гематин.
Гемоглобин, миоглобин и цитохромы содержат протопорфирин IX (четыре метильные группы, две винильные группы и два остатка пропионовой кислоты). В геме четыре лигандные группы порфирина образуют комплекс с железом, а оставшиеся пятая и шестая координационные связи железа расположены перпендикулярно плоскости порфиринового кольца. [Коттон Ф., Уилксон Дж. (1979)].
В молекуле гемоглобина гем-группа присоединяется к белку за счет координации по атому азота аминокислоты гистидина (His). Транс-положение по отношению к гистидиновому азоту занято молекулой воды в неокисленном состоянии, или молекулой кислорода в окисленной форме. Присоединение кислорода к одной их гем-групп гемоглобина увеличивает константу связывания для следующей молекулы кислорода и так далее
В миоглобине гем как бы вставлен внутрь структуры молекулы, при этом с водой контактирует только его ребро, погруженное в белок, как в своего рода корзину, образованную двумя а-спиралями и выстланную гидрофобными боковыми цепями аминокислот. Гем не имеет коваленитых связей с белком, удерживаясь нековалентными взаимодействиями. Всего насчитывается 80
который может находиться в разных частях белковой цепи. Поэтому потенциальная способность атома железа к связыванию кислорода подавлена [Ленинджер А., (1974)]
Рис. 1. Молекула цитохрома с (структура взята из РОБ) содержит 2 активных центра. Всего 3539 атомов.
Предполагается, что в молекуле цитохрома Р-450 (Рис.2) (катализатора первой стадии биотранформации экзогенных и эндогенных веществ в клетках) цистеин (Сув), а также гомологичные ему цистеины у других изоформ цитохрома Р450 являются 5-ым аксиальным лигандом гема. Таким образом, обнаруживается высокая степень гомологии гем-связывающего участка у различных форм гемопротеинов. Исследования спектральных и каталитических свойств мутантных белков позволили выявить функциональную значимость аминокислот, формирующих микроокружение гема. Неполярные аминокислоты фенилаланин (РИе-449), лейцин (Ьеи-451), глицин (01у-452), изолейцин
(Ile-457), глицин (Gly-458) необходимы для встраивания гема в апофермент цитохрома Р450. Предполагается, что гистидин участвует в связывании субстратов, а лизин (Lys-394, 402, 453), а также другие лизины 139, 144 и 251 могут быть центрами взаимодействия Р450 с другими белками-партнерами. Аминокислоты, содержащие гидроксильные группы, в частности тирозин (Tyr-380), претендуют на роль 6-ого транстиолатного лиганда железа гема. Но наиболее вероятным кандидатом на эту роль является атом кислорода молекулы воды.
Рис.2. Молекула цитохрома Р450сат (РОБ), содержащая один активный центр, с которым связана молекула камфоры (6430 атомов).
На 1-ой стадии оксигеназного цикла (цикл а) происходит связывание субстратов с окисленной формой Р450 с образованием фермент-субстратных комплексов. При этом в зависимости от субстратов могут появляться три типа изменений в оптических спектрах: I, II и модифицированный II. [Арчаков А.И., Карузина И.И., (2000)]. В зависимости от гидрофобности кармана, к активному центру гема цитохрома Р-450 подходит и, затем, взаимодействует
определенный лиганд, что регистрируется по соответствующему изменению спектра.
Таким образом, молекулы гемопротеинов это белки, построенные из сотен аминокислот. Чаще подобные структуры состоят из нескольких субьединиц как например молекула гемоглобина или цитохрома а. Отдельные участки белка имеют в-складчатое строение, а другие представляют собой а-спираль.. Но активным центром такой огромной молекулы является гем, состоящий из 36 атомов. Именно его электронная и атомная структуры отражают лигандсвязывающую и электронтранспортную активность всей молекулы. Лишь несколько аминокислот, ковалентно связанных с углеродами, находящимися на периферии протопорфиринового кольца, а также аминокислоты, связанные непосредственно с железом гема имеют определенное влияние на степень функциональной активности гемопротеинов. Остальная же аминокислотная цепь благодаря водородным связям и силам гидрофобного взаимодействия поддерживает уникальную конформацию данной белковой молекулы, которая находится либо в цитоплазме клетки, либо встроена в клеточную мембрану. Изучая электронную и атомную структуру активного центра такой макромолекулы нецелесообразно рассчитывать ее полностью, достаточно остановиться на собственно геме и 4-5 аминокислотах, с ним связанных (или достаточно близко с ним локализованных). В тоже время, расчеты электронной структуры гема без учета его аминокислотного окружения упрощают задачу, но при этом значительно снижают ценность получаемых результатов, поскольку подобные структуры в животных и растительных клетках не существуют.
Изучение процессов электронного и протонного транспорта в дыхательной цепи требует реконструкции отдельных участков, состоящих из молекул ферментов, встроенных в мембрану митоходрии. В этом случае огромное количество аминокислотных остатков, молекул липидов и углеводов формируют собой остов, поддерживающий небольшой участок молекулы
Электронный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ» 1 0 1 0 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2001/091.pdf
цитохрома, где локализован активный центр (не более 70-100 атомов). Но и в этом случае не учитывать конформацию всего фермента невозможно, поскольку именно ей обусловлена доступность лигандов к активному центру гема и его пространственная локализация относительно активного центра следующего фермента в цепи переноса электронов.
Расчеты электронной структуры всей белковой молекулы не только чрезвычайно сложны, но и принципиально неустойчивы из-за некорректного ассимптотического описания поведения электронных волновых функций. В стандартных квантово-химических процедурах считается, что если амплитуда волновой функции становится меньше некой, заранее заданной величины (предположим, 1 0-6), то значение волновой функции автоматически становится равным 0. Очевидно, что для малых и даже средних молекул такое приближение становиться оправданным. Действительно, волновые функции, описывающие молекулярные колебания, в таком случае простираются на несколько атомных единиц за пределы эффективного молекулярного размера и обнуление волновых функций на их концах не оказывает существенного влияния на результат. Иная ситуация возникает в расчетах макромолекул. В этом случае, молекулярные волновые функции, из-за отсутствия симметрии системы, становятся существенно локализованными, как правило, на некоторых атомных центрах, при этом размеры самой молекулы начинают существенно превышать эффективный размер самих волновых функций. Более того, даже самые «маленькие» макромолекулы содержат порядка 100 атомов, что приводит к суммированию ошибки, вызванной обрезанием волновых функций. Таким образом, полный расчет электронной структуры макромолекул должен сопровождаться накоплением ошибки, связанной с некорректным описанием поведения молекулярных волновых функций на ассимптотике.
Проводить квантово-химические расчеты такого класса объектов возможно, используя подход послойного выделения нескольких расчетных зон (методы РМ/ММ и ОМОМ). Гем и его ближайшее аминокислотное окружение, а именно аминокислоты, координированные атомом железа в 5-ом и 6-ом
положении (не более 150 атомов), рассчитываются или в b initio подходе, или одним из вариантов метода DFT. Ковалентно связанные с остатками первого слоя аминокислоты рассчитываются полуэмпирически, а вся остальная молекула - молекулярной механикой (Рис.3). Наиболее ответственный момент -выбор аминокислот ближайшего окружения гема. Мы применяем следующий критерий: если любой из атомов аминокислотного остатка удален от любого из атомов плоскости гема на расстоянее менее 10А, то выделяется весь остаток.
Рис. 3. Для проведения расчета методом ЦИ/ИИ выделен кластер состоящий из 1790 атомов. Ближайшее аминокислотное окружение (500 атомов) рассчитано методом РМ3, а остальная часть кластера - методом молекулярной механики.
Важный момент при работе с молекулами гемоглобина и цитохромов Р-450 - учет аминокислотного "кармана" (Рис.4), через который лиганд проникает к активному центру. Здесь возможно применить только визуальный критерий. Учет кармана имеет ключевое значение для адекватного расчета электронной структуры и динамики атомного остова изучаемых объектов,
поскольку именно он определяет функциональную активность молекулы, а именно - потенциальную возможность вхождения того или иного лиганда.
Рис. 4. Кластер цитохрома Р450сат (2844 атома) с молекулой камфоры в активном центре. Рамкой выделены границы "кармана " сформированного аминокислотными остатками белковой цепи.
ЛИТЕРАТУРА
1. Коттон Ф., Уилксон Дж. Основы неорганической химии//М.Мир, 1979, 677 с.
2. Степанов В.М. Молекулярная биология. Структура и функции белков//М., Высшая школа, 1996, 335 с.
3. Ленинджер А. Биохимия: Молекулярные основы структуры и функции клетки//М., Мир, 1974, 957 с.
4. F.Peter Guengerich Common and Uncommon Cytochrome P450 Reactions Related to Metabolism and Chemical Toxicity// Chem. Res. Toxicol., 2000, published on Web, Page est: 39.7
