CC BY
198
УДК 577.151.34; 577.151.64
Изучение функциональных и аллостерических сайтов в суперсемействах белков
Д. А. Суплатов12, В. К. Швядас12*
'Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, 119991, Москва, Ленинские горы, 1,стр. 40
2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, факультет биоинженерии и биоинформатики, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 73 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 19.08.2015
РЕФЕРАТ К важнейшим факторам регуляции функциональных свойств белков (ферментов) относится их взаимодействие с различными низкомолекулярными соединениями, а также белок-белковые взаимодействия. К настоящему времени наиболее хорошо изучены молекулярные механизмы действия лигандов, которые связываются в функциональных сайтах белков (активных центрах ферментов), в то время как механизмы аллостерической регуляции или связывания в других центрах изучены недостаточно. Исследования последнего времени показывают, что аллостерия может быть свойством практически всех белков, и для систематического анализа организации и роли различных сайтов, установления взаимосвязи между их структурой, функцией и регуляцией необходимы новые подходы. Современные методы компьютерной биологии, биоинформатики и молекулярного моделирования позволяют вести поиск новых центров связывания регуляторных лигандов, изучать особенности их структурной организации, сходство различных сайтов в гомологичных белках, молекулярные механизмы аллостерии, а также взаимосвязи функции и регуляции. Установление эволюционных взаимосвязей между различными центрами связывания в суперсемействах белков, открытие новых функциональных, аллостерических и регуляторных сайтов с использованием вычислительных подходов должны улучшить наше понимание структурно-функциональных взаимосвязей в белках, предоставить новые возможности для создания лекарственных средств и дизайна более эффективных биокатализаторов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА центры связывания, каталитический сайт, аллостерический сайт, функция, регуляция, структурно-функциональные взаимосвязи, биоинформатика.
СОКРАЩЕНИЯ PDB - Protein Data Bank; РНКП - ДНК-зависимая РНК-полимераза; МД - молекулярная динамика; СПП - специфическая позиция подсемейства.
ВВЕДЕНИЕ
Изучение взаимосвязи структуры и функции белка - одна из актуальных задач современной биохимии, сложность которой заключается в том, что сходство структуры не означает тождественности функций. При общей укладке полипептидной цепи белки могут обладать принципиально разными свойствами [1, 2], в то время как одну и ту же функцию могут выполнять белки с различной структурой [3]. Специфические белок-белковые взаимодействия и распознавание низкомолекулярных соединений лежат в основе функционирования живых систем. Для понимания молекулярных механизмов этих процессов и структурно-функциональных взаимосвязей в белках необходимо изучать структурную орга-
низацию конкретных сайтов, ответственных за эти взаимодействия и связывание различных лигандов (субстратов, ингибиторов, эффекторов) [4]. Анализ карманов и полостей на поверхности глобул, формирующих сайты связывания с уникальными свойствами, и их функциональная классификация должны привести к более глубокому пониманию общих закономерностей функционирования белков, предсказания функции новых ферментов, целенаправленного изменения свойств белков/ферментов дикого типа, а также дизайна лекарственных средств.
В большинстве работ изучение свойств белков фокусируется на анализе их функциональных сайтов -активных центров ферментов, каналов мембранных транспортных белков, ДНК- и белоксвязывающих
Рис. 1. Потенциальные сайты связывания низкомолекулярных эффекторов в структуре бактериальной РНКП. Скопление шариков одного цвета указывает на местонахождение потенциального сайта на поверхности фермента и соответствует центрам а-сфер, которые заполняют пространство соответствующей полости связывания (см. «Приложение»). Рисунок подготовлен с помощью программы PyMol на основании кристаллографической структуры 1YNN из PDB
участков различных регуляторных белков. Однако за последние годы накоплено множество свидетельств явления аллостерии - регуляции функции белков посредством связывания низкомолекулярных эффекторов в регуляторных сайтах, топологически независимых от функциональных сайтов [5]. Эти сведения стимулируют интерес к изучению регуляции функции биологических макромолекул при связывании различных лигандов в аллостерических центрах. Созданы экспериментальные и компьютерные подходы к поиску новых регуляторных центров в структурах белков. Предпринимаются попытки понять взаимосвязь между функциональными и регулятор-ными сайтами и изучить молекулярные механизмы взаимного влияния центров связывания, находящихся на значительном расстоянии друг от друга [6]. Обнаружены низкомолекулярные ингибиторы, селективно связывающиеся в аллостерических сайтах ряда белков, ассоциированных с различными заболеваниями человека [7]. Однако особое внимание к этой теме связано не столько с уникальными особенностями функционирования конкретных белков, сколько с общей ролью этих процессов в регуляции живых систем. Есть основания полагать, что алло-
стерия представляет собой весьма универсальное явление, присущее большинству белков [8]. Интерес вызывает не только фундаментальное значение ал-лостерии, но и возможность практического использования этого явления в биотехнологии и биомедицине. За последнее время показано, что белки и ферменты наряду с весьма хорошо известными функциональными сайтами (активными центрами) и аллостери-ческими сайтами содержат значительное количество практически неизученных участков связывания. На рис. 1 представлена структура ДНК-зависимой РНК-полимеразы - ключевого фермента синтеза РНК во всех живых организмах [9, 10]. Поверхность этого крупного полисубъединичного фермента покрыта большим количеством полостей - потенциальных сайтов связывания. Среди них можно увидеть как активный центр, содержащий каталитические остатки и участок связывания ДНК, так и несколько известных аллостерических сайтов, способных связывать различные низкомолекулярные лиганды [11, 12]. При этом роль остальных участков связывания, а их большинство, остается неизвестной. Насколько важны эти сайты для функционирования фермента? Какие сайты связывания играют физиологическую
роль, а какие можно приспособить для создания белка с новыми практически значимыми свойствами? Как оценить потенциал использования каждого отдельного сайта для регуляции функции?
В данном обзоре обсуждается изучение структурно-функциональных взаимосвязей в белках на основании анализа различных сайтов связывания в их структурах. Рассмотрены экспериментальные и компьютерные подходы к поиску и изучению новых центров связывания регуляторных лигандов, молекулярные механизмы аллостерии, а также взаимосвязь функции и регуляции в белках. Увеличение размеров публичных баз данных открывает доступ к новой информации о геномных последовательностях, структуре и функции большого числа белков. В этой связи новые возможности предоставляют методы биоинформатики, которые позволяют изучать свойства ферментов не по отдельности, а системно, в суперсемействах. Анализ структурной информации и экспериментальных данных о функциональных свойствах отдельных белков в их взаимосвязи с близкими, а также эволюционно удаленными гомологами, должен позволить лучше понять структурно-функциональные взаимосвязи в белках/ферментах и обнаружить новые механизмы регуляции их функциональных свойств.
ЯВЛЕНИЕ АЛЛОСТЕРИИ
Аллостерию принято определять как процесс регуляции функции белка путем связывания эффектора - лиганда или другого белка - в сайте на поверхности структуры, который называют ал-лостерическим центром [6]. В свою очередь, слово «аллостерический» происходит от греческих корней alios (другой) и stereos (твердый) и может быть переведено как «иная форма», чтобы подчеркнуть взаимосвязь конформационных состояний между структурно удаленными сайтами в белках [8]. Известно, что аллостерическая регуляция метаболизма важна для функционирования живых клеток, а аллосте-рические эффекторы могут быть как ингибиторами, так и активаторами функции белков [13].
Исторически под аллостерией понимали кооперативный эффект в полисубъединичных белках, функционирующих на уровне четвертичной структуры. В 1965 году на основании 24 известных на тот момент случаев была сформулирована «согласованная» модель аллостерии, называемая также моделью MWC (по заглавным буквам фамилий авторов Monod-Wyman-Changeux) [14]. Скачкообразное увеличение сродства гемоглобина к кислороду по мере его насыщения, описываемое S-образной кривой, позволило предположить кооперативный эффект. Однако полученная в 1960 году с разрешением 5.5 А
Рис. 2. Трехмерная структура гемоглобина человека. Молекулы гема (оранжевый) показаны в каждой субъединице тетрамера. Рисунок подготовлен с помощью программы РуМо1 на основании структуры 1GZX из PDB
структура гемоглобина показала, что молекулы гема, связывающие кислород, расположены на значительном расстоянии друг от друга в разных субъединицах белка (рис. 2) [15]. Это позволило сделать вывод о том, что в основе организации аллостерических белков лежит симметричное расположение субъединиц, причем существуют по меньшей мере два конфор-мационных состояния каждой субъединицы - R (от англ. relaxed) и Т (от англ. tense), которые, в случае гемоглобина, характеризуются высоким и низким сродством к кислороду соответственно. Переход от одной конформации к другой в результате связывания ли-ганда происходит во всех субъединицах согласованно и таким образом, что олигомерный белок не существует в гибридном состоянии (RT). Эта упрощенная модель позволила кинетически описать наблюдаемое увеличение сродства гемоглобина к кислороду по мере его насыщения [14]. Однако объяснить этот феномен на молекулярном уровне удалось только после проведения ряда структурных исследований [16, 17]. Стало понятно, что присоединение (отщепление) кислорода сопровождается значительными измене-
ниями пространственной организации функционального центра и разрывом (образованием) нескольких солевых мостиков, а возникающее при этом смещение субъединиц друг относительно друга приводит к тому, что эффект от связывания первой молекулы кислорода распространяется на весь тетрамер. Таким образом, присоединение и отщепление одной молекулы кислорода в одной субъединице инициирует соответствующий процесс в остальных субъединицах, что делает гемоглобин эффективным переносчиком кислорода по градиенту давления. Подобные кооперативные эффекты в гомоолигомерных белках/ ферментах - один из наиболее известных примеров аллостерии. В этом случае аллостерическим центром по отношению к активному центру одной субъединицы является активный центр другой субъединицы, при этом связывание второй молекулы субстрата (или его аналога) приводит к аллостерическому влиянию на центр связывания первой молекулы субстрата и может не сопровождаться ее каталитическим превращением. В соответствии с «последовательной», или KNF-моделью (по заглавным буквам фамилий авторов KosЫand-Nemethy-FПmer) [18], субъединицы в рамках мультимера изменяют свою конформацию поочередно, т.е. связывание ли-ганда меняет конформацию и свойства соответствующей субъединицы, что, в свою очередь, способно влиять на ее соседей. Иными словами, связывание лигандов последовательно приводит к изменению конформаций субъединиц. Такая модель описывает отрицательную кооперативность, которая наблюдается, например, в глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназе при связывании кофермента NAD+, когда присоединение кофактора в активном центре одной субъединицы ослабляет его связывание в соседней вследствие перестройки внутри- и межсубъ-единичных контактов [19, 20]. Наблюдаемое свойство способствует поддержанию активности фермента на постоянном уровне вне зависимости от концентрации лиганда в среде. Хотя с целью выработки более общих закономерностей была предпринята попытка объединить модели MWC и KNF [21], дальнейшие исследования показали, что молекулярные механизмы аллостерической регуляции сложны и разнообразны, и ни одна из предложенных моделей не описывает исчерпывающе явление аллостерии.
В настоящее время можно считать общепринятым, что аллостерической регуляции подвержены не только полисубъединичные, но и мономерные белки, а аллостерическими лигандами служат прежде всего низкомолекулярные соединения, которые связываются в регуляторном центре, топографически независимом от функционального центра. Кроме того, к аллостерическим эффектам стали относить
регуляторное влияние, вызываемое белок-белковыми взаимодействиями, фосфорилированием и даже точечными мутациями. Многообразие конкретных примеров аллостерической регуляции белков и ферментов хорошо иллюстрирует ряд недавних статей [5, 7, 22]. Высказано предположение, что аллостерия может быть неотъемлемым свойством практически всех белков [8], исключение могут составить лишь структурные белки, жесткая конформация которых ограничивает их подвижность и возможности регуляции. Действительно, экспериментальные исследования все чаще обнаруживают аллостерию в ферментах, которые раньше не считались алло-стерическими. Фосфофруктокиназа, катализирующая одну из ключевых стадий гликолиза, является примером белка со сложно организованной регуляцией, осуществляемой различными эффекторами. Аллостерия описана в ферментах этого суперсемейства - прокариотических [23] и эукариотических, причем последние имеют значительно большие размеры глобул вследствие дупликаций, вставок и мутаций предкового прокариотического гена, которые способствовали появлению новых аллостерических центров [24]. В то же время свойства фосфофрук-токиназы из миксомицета Dictyostelium discoideum отличаются от свойств ее гомологов, и этот белок не считается аллостерическим. Однако делеция одного С-концевого остатка лейцина приводит к проявлению у мутантного белка аллостерических свойств, присущих другим представителям суперсемейства [25]. В качестве другого примера можно привести пируваткиназу [26]. У млекопитающих известно четыре изоформы этого фермента - L, И, М1 и М2. Все изоформы, за исключением М1, аллостерические и характеризуются положительной гомотропной ко-оперативностью по отношению к субстрату, а также положительной гетеротропной кооперативностью по отношению к фруктозо-1,6-дифосфату. При этом изоформы М1 и М2 образуются в результате альтернативного сплайсинга одного гена и отличаются на 23 аминокислотных остатка, локализованных в области межсубъединичных контактов, а также участвующих в образовании центра связывания фруктозо-1,6-дифосфата. Внесение двух точечных мутаций в структуру изоформы М1, одной - в область меж-субъединичного контакта [27], другой - в область центра связывания фруктозо-1,6-дифосфата [26], приводит к проявлению аллостерических свойств, характерных для других гомологов. Еще одним примером служит миоглобин, паралог1 гемоглобина, существующий в виде трех основных конфор-
1 Паралоги - эволюционно родственные белки, которые произошли вследствие дупликации предкового гена.
мационных состояний с разными каталитическими свойствами, так называемых таксономических под-состояний, внутри которых могут выделяться дополнительные конформационные вариации [28]. Предполагается, что миоглобин способен аллостери-чески контролировать протекание бимолекулярных реакций с двухатомными субстратами (например, N0 и 02) за счет изменения геометрии консервативных полостей, примыкающих к активному центру. Интересно отметить, что во всех этих случаях алло-стерическая регуляция обнаруживалась в белках, у гомологов которых это явление было описано ранее. Эти примеры говорят не только о широкой распространенности аллостерической регуляции, но и об общих механизмах этого явления в рамках суперсемейств белков. Рассмотренные случаи указывают также на возможность тонкой настройки аллостерии за счет нескольких точечных мутаций, но при этом подчеркивают сложную взаимосвязь функции и регуляции.
По современным представлениям структуру белка предлагается рассматривать в рамках сложных статистических ансамблей конформеров, которые, совершая локальные перегруппировки, находятся в постоянном движении [6, 29]. В этом контексте аллостерический эффект обусловлен перераспределением конформационных состояний [8]. Иными словами, связывание аллостерического эффектора приводит к популяционному сдвигу в сторону таких конформационных состояний макромолекулы, которые значительно отличаются функционально от нативного [30]. В свою очередь, в традиционно не-аллостерических белках альтернативные конформа-
ции центров связывания и функционально важные конформационные переходы на сегодняшний день могут быть неизвестны. Но это не означает, что нельзя подобрать лиганд или особые условия среды, способные вызвать конформационный сдвиг и проявить аллостерические свойства в неаллостерических белках. В принципе, практически любое вещество, связавшись на поверхности белка, может вызвать популяционный сдвиг его конформаций, вопрос состоит лишь в эффективности такого сдвига и его влиянии на функцию [8]. Этот вопрос требует дальнейшего изучения на более широкой выборке белков. Однако конформационные изменения, связанные с аллостерической регуляцией, трудно выявить с помощью современных экспериментальных методов. Разработанные в последнее время подходы биоинформатики и компьютерной биологии предоставляют новые возможности для решения этой задачи.
ПОИСК ЦЕНТРОВ СВЯЗЫВАНИЯ В БЕЛКАХ
Предсказание центров связывания в белках на основании информации об их структуре представляет собой новое направление в компьютерной биологии [31]. Для поиска полостей и карманов на поверхности структуры белков предложены разнообразные геометрические подходы, основанные на использовании пространственных критериев (таблица). Поскольку в большинстве случаев программы позволяют выявить несколько потенциальных сайтов, предпринимаются попытки их классифицировать с использованием различных геометрических параметров - размера, глубины и ориентации [32-34], а также различных статистических оценок, учиты-
Интернет-сервисы для предсказания сайтов связывания в структурах белков и их ранжирования по функциональной значимости
Название Адрес в сети Интернет Алгоритм поиска сайтов в структуре Алгоритм ранжирования сайтов
Fpocket [35] http://mobyle.rpbs. univ-paris-diderot.fr/ > Programs > Structure > Pockets > fpocket Геометрический, с использованием диаграмм Вороного и построением а-сфер Статистический, оценивается схожесть с известными сайтами связывания низкомолекулярных веществ
POCASA [33] http://altair.sci.hokudai. ac.jp/g6/service/pocasa/ Геометрический, с прокаткой сферических проб по поверхности белка Геометрический, с учетом положения и размера сайта
pocketZebra [39] http://biokinet.belozersky. msu.ru/pocketzebra Геометрический, с использованием диаграмм Вороного и построением а-сфер Биоинформатический, анализ специфических позиций подсемейств в суперсемействах белков
SiteHound [38] http://scbx.mssm.edu/ sitehound/sitehound-web/ Input.html Энергетический, оценивается энергия взаимодействия аминокислот на поверхности с углеродной или фосфатной пробой Энергетический, оценивается энергия взаимодействия аминокислот на поверхности с углеродной или фосфатной пробой
LIGSITEcsc [41] http://projects.biotec. tu-dresden.de/pocket/ Геометрический, на основе расчета поверхности Коннолли Биоинформатический, анализ консервативных позиций
вающих физико-химические свойства известных центров связывания лигандов [35, 36]. Альтернативу геометрическим методам представляют энергетические подходы, в которых предсказание и ранжирование сайтов основано на расчете энергии связывания небольших органических молекул (проб) на поверхности белка [37, 38]. Все эти подходы, основываясь на структурной информации, способны быстро и эффективно обнаружить полости и карманы потенциальных сайтов связывания, однако не дают представления об их функциональной значимости и структуре комплементарных лигандов.
В процессе эволюции от общего предка одни свойства белков сохраняются, в то время как другие претерпевают изменения в результате естественного отбора, что приводит к формированию функционального разнообразия. Так, гомологичные ферменты одного суперсемейства могут обладать общей структурной организацией и химизмом катализируемой реакции, но отличаться по другим функциональным свойствам (субстратная специфичность, энантио- и региоселективность, тип химического превращения), а также принципам их регуляции. Существенный рост публичных баз данных, содержащих геномную и структурную информацию о белках/ферментах, позволяет проводить масштабный сравнительный анализ в рамках суперсемейств - совокупностей как близких, так и эволюционно удаленных гомологов. Не все позиции в структуре белков одинаково подвержены изменчивости в процессе эволюции, что отражает различия в давлении отбора на остатки с разной функциональной ролью. Этот факт позволяет использовать биоинформатический анализ суперсемейств белков для поиска эволюционных закономерностей, характерных для аминокислотных остатков функциональных и регуляторных центров связывания [39] (таблица). Полностью консервативные позиции играют ключевую роль в функции, общей для всего суперсемейства, например, принимают участие в каталитическом механизме действия ферментов. Нужно отметить, что не всегда каталитические аминокислоты в суперсемействе полностью консервативны, кроме того, известны случаи миграции каталитических аминокислот в структурах гомологичных белков [2, 40]. Так, например, нуклеофил каталитической триады a/ß-гидролаз может быть представлен как серином, так и цисте-ином или аспартатом, а каталитическая кислота может располагаться по меньшей мере в двух альтернативных позициях основной полипептидной цепи. Тем не менее показано, что консервативность остатков в полостях на поверхности белков может служить критерием при аннотации функциональных центров [41-43], и это свойство может быть исполь-
зовано для характеристики широкого круга ферментов [44-46]. Фактически, описание любого нового белка с неизвестной функцией разумно начинать с его сравнительного анализа с ближайшими гомологами и расчета консервативных позиций в колонках множественного выравнивания. Роль наиболее консервативных остатков, обнаруженных при таком анализе, может быть проверена экспериментально посредством внесения точечных мутаций и оценке их влияния на каталитические свойства. Благодаря критерию консервативности предсказание функциональных центров в новом белке с неизвестной функцией возможно даже при отсутствии данных о его трехмерной структуре при условии, что доступна аннотация функциональных центров в его гомологах. На сегодняшний день такая информация о достаточно большом числе белков из различных суперсемейств собрана в публичных базах данных (см. следующую главу). Таким образом, комплексное использование геометрических структурных подходов и биоинформатического анализа делает поиск функциональных центров в белках более эффективным.
Сравнительное исследование белков позволило сделать вывод о том, что аллостерические сайты характеризуются меньшим содержанием консервативных позиций и более высоким содержанием вариабельных позиций [47]. Показано также, что мутагенез вариабельных позиций в аллостерических центрах приводит к изменению аллостерического эффекта, в то время как замена консервативных позиций в этих же центрах в основном приводит к потере каталитической функции. Эти результаты говорят о малой пригодности критерия консервативности при поиске регуляторных центров и свидетельствуют о важной роли вариабельных позиций в связывании аллостерических лигандов и регуляции функциональных свойств в суперсемействах белков. В этом отношении особый интерес представляют специфические позиции подсемейств (СПП) - консервативные внутри функциональных подсемейств, но различающиеся между ними [48, 49]. Присутствие СПП характерно как для каталитических, так и ал-лостерических сайтов и может быть эффективным критерием идентификации функциональных и ре-гуляторных центров в структурах белков [39]. Поиск статистически значимых СПП может помочь понять разницу в строении участков связывания в родственных белках. Так, например, ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНКП) является ключевым ферментом транскрипции, который присутствует во всех живых системах. Каталитическая основа бактериального фермента состоит из субъединиц a2ßß'ro и характеризуется высокой степенью сходства по структуре и функции с гомологами всех известных орга-
низмов. Подтверждено, что бактериальная РНКП служит мишенью для противомикробных средств [12]. Рифампицин - антибиотик «первого эшелона» при туберкулезе - селективно ингибирует транскрипцию в Mycobacterium tuberculosis за счет взаимодействия с аллостерическим центром, расположенным в ß-субъединице фермента. Взаимодействие ингибитора с бактериальным ферментом напрямую блокирует элонгацию в патогене, не затрагивая при этом родственный фермент человека [50]. Биоинформатический анализ суперсемейства РНКП показывает, что селективность связывания рифам-пицина с ферментом бактерий обусловлена наличием специфических позиций подсемейств в соответствующем участке связывания, которые отличаются у прокариот и человека (рис. 3). Этот пример свидетельствует о том, что изучение роли СПП в формировании сайтов связывания регуляторных лигандов позволяет лучше понять молекулярные механизмы специфического узнавания аллостерических эффекторов и закономерности функциональной регуляции в семействах белков.
ПУБЛИЧНЫЕ БАЗЫ ДАННЫХ
Возможность быстрого получения информации из открытых источников в сети Интернет является важным фактором развития современной науки. В этом контексте особое место занимают публичные базы данных.
База данных каталитических сайтов Catalytic Site Atlas (CSA) - один из основных источников информации о ферментах [51]. В основе CSA лежат экспериментальные данные о 1000 каталитически активных белков с разными свойствами, а методы поиска сходства по геномным последовательностям применяются для того, чтобы с высокой степенью значимости аннотировать каталитические остатки в других белках на основании критерия консервативности. В результате использования методов биоинформатики база данных CSA содержит данные об активных центрах нескольких десятков тысяч белков с известной структурой.
Объем знаний об аллостерических белках не столь значителен, что, по всей видимости, связано с недостатком структурной информации и сложностями при определении аллостерических сайтов. Однако и в этой области достигнут значительный прогресс. Если 50 лет назад (когда была предложена первая модель кооперативности) были известны 24 алло-стерических белка, то сегодня насчитываются сотни таких примеров. Недавнее создание публичной базы данных аллостерических центров Allosteric Database (ASD) стало первой попыткой обобщить массив соответствующей опубликованной информации [52].
На сегодняшний день база ASD насчитывает почти 2000 сайтов, однако далеко не все сведения подкреплены кристаллографической информацией о структуре белка в комплексе с эффектором, а некоторые аннотации и вовсе неоднозначны. Тем не менее можно ожидать, что систематизация экспериментального материала о структуре и функции аллостерических центров будет продолжаться, в том числе и в рамках других публичных баз данных.
ВЗАИМОСВЯЗЬ ФУНКЦИИ И РЕГУЛЯЦИИ
Не вызывает сомнений тот факт, что конформаци-онные изменения в структуре белка, обусловленные связыванием лиганда в аллостерическом центре, в конечном итоге приводят к изменению функциональных свойств. Однако не много известно о конкретных молекулярных механизмах этого явления. Как объяснить кооперативность, наблюдаемую при связывании различных лигандов, и как предсказать взаимодействие между сайтами в белках, в которых аллостерия еще не описана? В последние годы предпринято несколько попыток понять взаимосвязь функции и регуляции [6]. В основе этих подходов лежат компьютерные методы поиска корреляций -структурных или эволюционных - между событиями, происходящими при связывании лигандов в топологически независимых центрах на поверхности белков. Рассмотрим несколько таких примеров.
Структурные изменения, возникающие при связывании лиганда, непосредственно связаны с кон-формационной подвижностью белковой глобулы. Молекулярная динамика зарекомендовала себя как эффективный метод изучения структурных изменений в белках [53, 54], в том числе согласованных флуктуаций атомов, происходящих в результате коллективного движения [55]. Так, расчет матриц ко-вариаций флуктуации атомов вдоль МД-траекторий был использован для изучения молекулярных механизмов аллостерической регуляции белка-супрес-сора опухолевого роста Хиппеля-Линдау (pVHL) [56]. pVHL в свободном состоянии нестабилен и существует в виде так называемой «расплавленной глобулы». Белок стабилизируется при взаимодействии с элонгинами С и В, которые вместе образуют лигандраспознающий компонент для связывания фактора транскрипции HIF в составе ферментного комплекса убиквитинлигазы Е3 (рис. 4). С использованием МД показано, что интерфейс между двумя доменами а и ß в pVHL представляет собой наименее стабильный участок белка. Были отобраны такие аминокислотные остатки, подвижность которых вдоль МД-траекторий в наибольшей степени коррелирует с движением остатков из нестабильной междоменной области pVHL. Молекулярное моделирова-
Рис. 3. Связывание рифампицина (RFP) в аллостерическом сайте Р-субъединицы бактериальной РНКП. Показаны специфические позиции подсемейств (розовый), определенные с помощью биоинформатического анализа 271 РНКП из различных источников, и приведены соответствующие фрагменты выравнивания аминокислотных последовательностей. Интерактивная версия доступна в сети Интернет (см. «Приложение»). Рисунок подготовлен с помощью программы PyMol на основании структуры 1YNN из PDB
ние показало, что замена аминокислот в отобранных позициях на гомологичные остатки в аминокислотной последовательности более стабильного pVHL из Caenorhabditis е1еда^ приводит к значительной стабилизации pVHL из человека как в свободном состоянии, так и в составе комплекса. При этом мутации остатков в областях, топологически независимых от центров связывания элонгина С и фактора транскрипции Н№, приводят к стабилизации комплекса pVHL-элонгин С и снижению энергии связывания в pVHL. Авторы работы [56] делают вывод, что стабильность и эффективность связывания в pVHL могут регулироваться аллостерически с помощью лекарственных средств, мимикрирующих эффект внесенных мутаций.
Другой пример свидетельствует о пользе поиска эволюционных корреляций с использованием статистического анализа геномных последовательностей [57, 58]. Подход основан на предположении, что если два сайта в структуре белка функционально связаны, то соответствующие аминокислотные остатки в гомологичных белках должны коэволюционировать в процессе развития от общего предка и эта корреляция может быть выявлена с помощью статистического сравнения аминокислотных последовательностей. В таком случае корреляция встречаемости аминокислот в двух сайтах в структурах родственных белков может означать существование функциональной зависимости между ними. Описанный подход применили для анализа мембранного белка FecA - представителя семейства ТопВ-зависимых транспортных белков, функция которого заключается в перекачке железа через внешнюю мембрану грамотрица-тельных бактерий [59]. Ключевая стадия переноса железа - взаимодействие белка ТопВ, создающего протонный градиент, с консервативным ^концевым ТопВ-связывающим мотивом транспортного белка. Предполагалось, что это взаимодействие, протекающее на периплазматической стороне мембраны, вызывает конформационные изменения, которые приводят к связыванию сидерофора1 на противоположной поверхности мембраны со стороны внеклеточного пространства и последующему импорту железа, однако конкретные механизмы этой аллосте-рической коммуникации между двумя центрами связывания, расположенными в разных компартментах на значительном расстоянии друг от друга, оставались неизвестными. Статистический анализ последовательностей ТопВ-зависимых транспортных белков обнаружил рассеянную, но связную сеть коррелирующих остатков, которая обеспечивает функцио-
1 Сидерофор - низкомолекулярное соединение с высоким сродством к ионам железа (например, цитрат железа).
Рис. 4. Комплекс фактора транскрипции Н^ (пурпурный) - белка-супрессора опухолевого роста Хиппеля-Линдау VHL (желтый) - элонгина С (зеленый) - элон-гина В (синий). Домен а белка VHL взаимодействует с элонгином С, в то время как домен в связывает HIF. Показаны аминокислотные остатки, движение которых в процессе МД-траекторий в наибольшей степени коррелирует с остатками из междоменной области pVHL. Рисунок подготовлен с помощью программы РуМо1 на основании структуры ^М8 из PDB для иллюстрации результатов из [56]
нальную коммуникацию между периплазматическим и внеклеточным сайтами связывания в FecA (рис. 5), а направленный мутагенез обнаруженных остатков, ни один из которых не участвует непосредственно в образовании центров связывания ТопВ и сидеро-фора, привел к нарушению транспортной функции FecA.
Основываясь на известных к этому моменту результатах, можно сделать вывод, что поиск эволюционных и структурных корреляций может служить важным инструментом изучения молекулярных механизмов аллостерической регуляции в белках.
ЦЕНТРЫ СВЯЗЫВАНИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ И БИОМЕДИЦИНЕ
Сайты связывания субстратов/лигандов в ферментах/белках активно изучаются с целью создания новых биокатализаторов для промышленного использования (см., например, обзор [60]), а также ингибиторов, используемых в качестве лекарственных средств человека [61, 62]. В каждом случае применяют свои методы, однако в основе большинства успешных исследований лежит общий принцип, который можно назвать «стохастический анализ». Для дизай-
Рис. 5. Структура транспортного белка FecA внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Периплаз-матическое пространство (Р) отделено от внеклеточного пространства (Е) схематическим изображением мембраны. Ионы железа в составе цитрата железа (оранжевый) показаны в центре связывания сидерофо-ра. Показаны коррелирующие остатки (пурпурный), участвующие в образовании сети взаимодействий, которая обеспечивает функциональную коммуникацию между периплазматическим и внеклеточным сайтами связывания в FecA. Рисунок подготовлен с помощью программы РуМо1 на основании структуры 1КМР из PDB для иллюстрации результатов из [59]
на белков с новыми свойствами предложены так называемые подходы «направленной эволюции» [63, 64]. Эти методы сочетают в себе случайный мутагенез структуры белка, сопряженный с последующим скринингом для отбора наиболее предпочтительных фенотипов. Мутации вносят в структуру или определенную часть структуры белка произвольным образом, после чего эффект замен оценивают экспериментально и отбирают те из них, которые приводят к улучшению нужного свойства. В последние годы стохастические подходы стали более быстрыми и эффективными за счет использования различных методов статистического анализа и компьютерной биологии [65, 66]. Однако они по-прежнему требуют значительных ресурсов, экспериментального исследования больших библиотек мутантов, разработки эффективных методов скрининга и при этом способны изучить лишь очень небольшую часть возможных изменений в структуре белка. Эффективное
применение методов случайной эволюции затруднено высокой вероятностью отрицательных мутаций и низкой вероятностью проявления функционально полезных фенотипов. Аналогичным образом дизайн новых лекарственных средств в большинстве случаев основан на слепом экспериментальном скрининге огромных библиотек низкомолекулярных соединений в качестве потенциальных ингибиторов белка-мишени [67, 68]. Хотя структуру такого случайно обнаруженного ингибитора далее можно оптимизировать с использованием экспериментальных и компьютерных подходов, это в целом чрезвычайно трудоемкий и малоэффективный подход. Так, компания GlaxoSmithKline за период с 1995 по 2001 год провела 70 высокопроизводительных экспериментальных скрининговых исследований (стоимостью около $1 млн каждый) белков-мишеней, отобранных из различных болезнетворных бактерий, с использованием собственных коллекций потенциальных ингибиторов, содержащих 260000-530000 соединений. По результатам шестилетних исследований для дальнейших испытаний отобрали всего пять ли-дерных компонентов с подтвержденными эффектами [69]. Обзор опубликованных данных показывает, что в период с 1996 по 2004 год подобные исследования проводились по крайней мере 34 различными компаниями на 60 мишенях и в целом считаются неудачными [70]. Высокие затраты на экспериментальные исследования в сочетании с низкой результативностью эмпирического поиска предопределили значительное падение интереса к этой методологии.
Несмотря на кажущуюся универсальность стохастических подходов, они, как правило, направлены на изучение функциональных центров. В большинстве случаев с целью изменения каталитических свойств случайные мутации вносят в структуру активного центра фермента [71]. Аналогично, большинство разрабатываемых лекарственных средств связываются с функциональными центрами белков (см., например, [72]). Примеров практического использования аллостерических сайтов значительно меньше. Так, показано, что введение единственной мутации в структуру глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы приводит к разрушению солевого мостика вблизи активного центра и потере коопе-ративности при связывании NAD+ [73]. При этом полученный препарат фермента характеризуется двукратным увеличением удельной активности. Известны лекарственные средства, которые взаимодействуют с регуляторными сайтами белков. Так, рифампицины и миксопиранины связываются в полостях субъединиц в и в' РНКП, топологически независимых от активного центра, и прямо блокируют работу фермента [12]. Связывание ингибитора до-
рамапимода в аллостерическом центре p38 MAP-киназы человека и сопутствующие этому процессу конформационные перестройки приводят к блокировке связывания АТР [74]. Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 эфавиренц, невирапин и де-лавирдин связываются в аллостерическом сайте на значительном расстоянии от активного центра [75]. Обобщая имеющийся опыт, следует отметить, что благодаря более высокой вариабельности в рамках суперсемейства аллостерические сайты можно считать не менее привлекательными мишенями для селективного ингибирования, чем каталитические [76].
Низкая эффективность стохастических методов стимулирует развитие компьютерных подходов к дизайну эффективных биокатализаторов и поиску селективных ингибиторов ферментов. Показано, что биоинформатический анализ эволюционных взаимосвязей в функционально разнообразных суперсемействах позволяет обнаруживать не только ключевые «горячие точки» в структурах ферментов, но и конкретные аминокислотные замены, внесение которых позволяет получать мутанты с улучшенными свойствами [54, 77-79]. Применение вычислительных подходов к дизайну белков подробно рассмотрено в недавних обзорах [80-82]. Секвенирование полных геномов основных бактериальных патогенов, в том числе M. tuberculosis [83], положило начало применению компьютерной геномики в медицине. Использование геномных подходов позволяет не только составить список всех потенциальных белков-мишеней в конкретном организме, но и выявить наиболее перспективные объекты для последующего экспериментального исследования [84]. Важным преимуществом такого постгеномного анализа принято считать возможность выбора мишени, которая встречается во многих, либо, наоборот, всего в нескольких бактериальных геномах. Предполагалось, что таким путем можно создавать как лекарственные средства с широким спектром действия, так и высокоспецифичные ингибиторы определенных патогенов. Кроме того, сравнительный анализ геномов бактерий и животных позволяет исключать из списка возможных мишеней такие белки, гомологи которых есть в организме человека, что может позволить избежать ситуаций, когда созданный прототип токсичен не только для бактерий, но и для человека [85]. Однако, обобщая, следует отметить, что используемые до последнего времени постгеномные методы весьма поверхностно подходили к выбору мишеней, на которые действуют лекарственные средства. Так, например, предпочтительными мишенями при поиске новых антибиотиков считали белки, консервативные у бактерий и отсутствующие в организме челове-
ка. При этом не учитывали особенности структурной организации этих белков, в том числе строение конкретных участков связывания потенциальных ингибиторов. Исключение из списка потенциальных мишеней белков патогенных микроорганизмов, гомологи которых есть у человека (в попытке избежать токсичности ингибитора), в целом следует признать малообоснованным. Важнейшие метаболические пути, как правило, консервативны, и ключевые ферменты этих путей содержатся как в патогенных бактериях, так и в организме человека. В качестве примера можно привести уже упоминавшийся противотуберкулезный препарат рифампицин, который ингибирует репликацию бактерий, селективно связываясь с в-субъединицей РНКП, гомолог которой есть и в организме человека [50].
Подводя итог, можно отметить общую тенденцию отказа от малоэффективных стохастических подходов в пользу более рациональных и фокусированных стратегий. В этом контексте роль методов биоинформатики и молекулярного моделирования в биотехнологии и биомедицине продолжает неуклонно возрастать. Разработка новых подходов к систематическому анализу различных центров связывания в больших суперсемействах белков должна помочь, с одной стороны, установить взаимосвязь между структурой, функцией и регуляцией белков/ферментов, и, с другой стороны, обнаружить участки связывания новых субстратов, а также ингибиторов/ эффекторов с ранее неизвестным механизмом действия.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Белок-белковые взаимодействия, а также взаимодействие белков (ферментов) с различными низкомолекулярными соединениями являются важнейшими факторами регуляции их функциональных свойств. В настоящее время наиболее хорошо изучены молекулярные механизмы действия лигандов, связывающихся в функциональных сайтах белков (активных центрах ферментов), в то время как механизмы аллостерического ингибирования или связывания в других малоизвестных сайтах в структурах белков изучены недостаточно. В этом контексте большой интерес представляют не только взаимодействие между функциональным и аллостерическим центрами, но также поиск и характеристика новых сайтов связывания, их роль в функционировании белка. Несмотря на первые шаги в сторону большего понимания взаимосвязи структуры, функции и регуляции, этот вопрос еще далек от разрешения и требует дальнейшего изучения. Анализ опубликованных данных позволяет сделать вывод о том, что роль методов биоинформатики и молекулярного
моделирования в изучении роли различных участков связывания в функционировании белка, в том числе аллостерических эффектов, будет неуклонно расти. Установление эволюционных взаимосвязей между различными сайтами связывания в рамках суперсемейств белков, открытие новых функциональных, аллостерических и регуляторных сайтов с использованием вычислительных подходов должны улучшить наше понимание структурно-функциональных взаимосвязей в белках и предоставить новые возможности как для создания новых лекарственных средств, так и для дизайна более эффективных биокатализаторов. •
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (грант № 15-14-00069).
ПРИЛОЖЕНИЕ
Выравнивание белков суперсемейства РНКП
Структура бактериальной РНКП (код структуры в PDB: 1YNN) была использована в качестве затравки. Для реконструкции выборки эволюционно удаленных РНКП различных организмов (бактерий, животных, человека и т.д.) использовали поиск по структурному сходству в базе данных PDB с помощью алгоритма superpose пакета CCP4 [86]. При парном структурном сравнении допускалось не менее 30% совпадений элементов вторичной структуры в каждом белке. Для каждого обнаруженного удаленного гомолога реконструировали эволюционно близкие белки с использованием алгоритма BLAST и базы данных Swiss-Prot [87]. Получившиеся выборки фильтровали для удаления избыточных (повторя-
ющихся) последовательностей на уровне 95% парной идентичности, а также слишком непохожих белков со сходством менее 0.5 бит в колонке [88] по отношению к соответствующему гомологу с известной структурой. Структуры белков выравнивали с помощью алгоритма Matt [89], выравнивание последовательностей - с использованием программы T-coffee [90]. Полученное выравнивание удаленных гомологов использовали в качестве основы для выравнивания близких гомологов. Полученное структурно-опосредованное множественное выравнивание суперсемейства РНКП содержит 271 последовательность белков.
Поиск потенциальных сайтов связывания
Идентификацию карманов и полостей на поверхности структуры РНКП (код структуры в PDB: 1YNN), потенциально способных связывать низкомолекулярные лиганды, выполняли с помощью алгоритма Fpocket [35].
Биоинформатический анализ
Поиск СПП и специфических сайтов связывания в суперсемействе РНКП выполняли с использованием алгоритмов Zebra [91] и pocketZebra [39].
Структурный анализ
Визуализацию и анализ структурной информации о белках выполняли с использованием программы PyMol (Schrodinger LLC).
Доступ
Интерактивный доступ к результатам биоинформа-тического анализа суперсемейства ферментов ДНК-зависимых РНК-полимераз предоставлен через интернет-сервис http://biokinet.belozersky.msu.ru/ pocketzebra (в разделе «Примеры»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Thornton J.M., Todd A.E., Milburn D., Borkakoti N., Orengo C.A. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2000. V. 7. P. 991-994.
2. Todd A.E., Orengo C.A., Thornton J.M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 1999. V. 3. № 5. P. 548-556.
3. Martin A.C., Orengo C.A., Hutchinson E.G., Jones S., Karmi-rantzou M., Laskowski R.A., Mitchell J., Taroni C., Thornton J.M. // Structure. 1998. V. 6. № 7. P. 875-884.
4. Jones S., Thornton J.M. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2004. V. 8. № 1. P. 3-7.
5. Laskowski R.A., Gerick F., Thornton J.M. // FEBS Lett. 2009. V. 583. № 11. P. 1692-1698.
6. Goodey N.M., Benkovic S.J. // Nat. Chem. Biol. 2008. V. 4. № 8. P. 474-482.
7. Hardy J.A., Wells J.A. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2004. V. 14. № 6. P. 706-715.
8. Gunasekaran K., Ma B., Nussinov R. // Proteins. 2004. V. 57. № 3. P. 433-443.
9. Campbell E.A., Pavlova O., Zenkin N., Leon F., Irschik H., Jansen R., Severinov K., Darst S.A. // EMBO J. 2005. V. 24. № 4. P. 674-682.
10. Esyunina D., Klimuk E., Severinov K., Kulbachinskiy A. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 7. P. 2017-2022.
11. Sousa R. // Cell. 2008. V. 135. № 2. P. 205-207.
12. Darst S.A. // Trends Biochem. Sci. 2004. V. 29. № 4. P. 159162.
13. Monod J., Changeux J.P., Jacob F. // J. Mol. Biol. 1963. V. 6. № 4. P. 306-329.
14. Monod J., Wyman J., Changeux J.P. // J. Mol. Biol. 1965. V. 12. № 1. P. 88-118.
15. Perutz M.F., Rossmann M.G., Cullis A.F., Muirhead H., Will G. // Nature. 1960. V. 185. P. 416-422.
16. Perutz M.F., Wilkinson A.J., Paoli M., Dodson G.G. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1998. V. 27. № 1. P. 1-34.
17. Eaton W.A., Henry E.R., Hofrichter J., Mozzarelli A. // Nat. Struct. Mol. Biol. 1999. V. 6. № 4. P. 351-358.
18. Koshland D.E., Nemethy G., Filmer D. // Biochemistry. 1966. V. 5. № 1. P. 365-385.
19. Conway A., Koshland D.E. // Biochemistry. 1968. V. 7. № 11. P. 4011-4023.
20. Makshakova O.N., Semenyuk P.I., Kuravsky M.L., Ermakova E.A., Zuev Y.F., Muronetz V.I. // J. Struct. Biol. 2015. V. 190.
№ 2. P. 224-235.
21. Eigen M. // Nobel Symp. 1967. V. 5. P. 333-369.
22. Arkin M.R., Wells J.A. // Nat. Rev. Drug Discov. 2004. V. 3. № 4. P. 301-317.
23. Schirmer T., Evans P.R. // Nature. 1990. V. 343. № 6254. P. 140-145.
24. Poorman R.A., Randolph A., Kemp R.G., Heinrikson R.L. // Nature. 1984. V. 309. № 5967. P. 467-469.
25. Santamaría B., Estévez A.M., Martínez-Costa O.H., Aragón J.J. // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 2. P. 1210-1216.
26. Ikeda Y., Taniguchi N., Noguchi T. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 13. P. 9150-9156.
27. Ikeda Y., Tanaka T., Noguchi T. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 33. P. 20495-20501.
28. Frauenfelder H., McMahon B.H., Austin R.H., Chu K., Groves J.T. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 5. P. 2370-2374.
29. Hilser V.J., Thompson E.B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 20. P. 8311-8315.
30. Chennubhotla C., Yang Z., Bahar I. // Mol. Biosyst. 2008. V. 4. № 4. P. 287-292.
31. Henrich S., Salo-Ahen O.M., Huang B., Rippmann F.F., Cruciani G., Wade R.C. // J. Mol. Recognit. 2010. V. 23. № 2. P. 209-219.
32. Weisel M., Proschak E., Schneider G. // Chem. Cent J. 2007. V. 1. № 7. P. 1-17.
33. Yu J., Zhou Y., Tanaka I., Yao M. // Bioinformatics. 2010. V. 26. № 1. P. 46-52.
34. Yaffe E., Fishelovitch D., Wolfson H.J., Halperin D., Nussinov R. // Nucl. Acids Res. 2008. V. 36. Suppl 2. P. W210-W215.
35. Le Guilloux V., Schmidtke P., Tuffery P. // BMC Bioinformatics. 2009. V. 10. № 1. P. 168.
36. Volkamer A., Kuhn D., Grombacher T., Rippmann F., Rarey M. // J. Chem. Information Modeling. 2012. V. 52. № 2. P. 360-372.
37. Laurie A.T.R., Jackson R.M. // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 9. P. 1908-1916.
38. Hernandez M., Ghersi D., Sanchez R. // Nucl. Acids Res. 2009. V. 37. Suppl 2. P. W413-W416.
39. Suplatov D., Kirilin E., Arbatsky M., Takhaveev V., Svedas V. // Nucl. Acids Res. 2014. V. 42. № W1. P. W344-W349.
40. Todd A.E., Orengo C.A., Thornton J.M. // J. Mol. Biol. 2001. V. 307. № 4. P. 1113-1143.
41. Huang B., Schroeder M. // BMC Struct. Biol. 2006. V. 6. № 1. P. 19.
42. Glaser F., Morris R.J., Najmanovich R.J., Laskowski R.A., Thornton J.M. // Proteins. 2006. V. 62. № 2. P. 479-488.
43. Kalinina O.V., Gelfand M.S., Russell R.B. // BMC Bioinformatics. 2009. V. 10. № 1. P. 174.
44. Varfolomeev S.D., Gurevich K.G., Poroykov V.V., Sobolev
B.N., Fomenko A.E. // Dokl. Biochem. Biophys. 2001. V. 379. № 1. P. 252-254.
45. Халуллин И.Г., Суплатов Д.А., Шалаева Д.Н., Оцука М., Асано Я., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2010. Т. 2. № 2.
C. 70-74.
46. Суплатов Д.А., Аржаник В.К., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2011. Т. 3. № 1. С. 99-105.
47. Yang J.S., Seo S.W., Jang S., Jung G.Y., Kim S. // PLoS Com-put. Biol. 2012. V. 8. № 7. P. e1002612-e1002612.
48. Kalinina O.V., Mironov A.A., Gelfand M.S., Rakhmaninova A.B. // Protein Sci. 2004. V. 13. № 2. P. 443-456.
49. Suplatov D., Shalaeva D., Kirilin E., Arzhanik V., Svedas V. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2014. V. 32. № 1. P. 75-87.
50. Campbell E.A., Korzheva N., Mustaev A., Murakami K., Nair S., Goldfarb A., Darst S.A. // Cell. 2001. V. 104. № 6. P. 901-912.
51. Porter C.T., Bartlett G.J., Thornton J.M. // Nucl. Acids Res. 2004. V. 32. Suppl 1. P. D129-D133.
52. Huang Z., Zhu L., Cao Y., Wu G., Liu X., Chen Y., Wang Q., Shi T., Zhao Y., Wang Y., et al. // Nucl. Acids Res. 2011. V. 39. Suppl 1. P. D663-D669.
53. Seifert A., Tatzel S., Schmid R.D., Pleiss J. // Proteins. 2006. V. 64. № 1. P. 147-155.
54. Suplatov D., Panin N., Kirilin E., Shcherbakova T., Kudry-avtsev P., Svedas V. // PloS One. 2014. V. 9. № 6. P. e100643.
55. Ichiye T., Karplus M. // Proteins. 1991. V. 11. № 3. P. 205-217.
56. Liu J., Nussinov R. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V. 105. № 3. P. 901-906.
57. Dima R.I., Thirumalai D. // Protein Sci. 2006. V. 15. № 2. P. 258-268.
58. Reynolds K.A., McLaughlin R.N., Ranganathan R. // Cell. 2011. V. 147. № 7. P. 1564-1575.
59. Ferguson A.D., Amezcua C.A., Halabi N.M., Chelliah Y., Rosen M.K., Ranganathan R., Deisenhofer J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. № 2. P. 513-518.
60. Bornscheuer U.T., Huisman G.W., Kazlauskas R.J., Lutz S., Moore J.C., Robins K. // Nature. 2012. V. 485. № 7397. P. 185-194.
61. Imming P., Sinning C., Meyer A. // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. № 10. P. 821-834.
62. Overington J.P., Al-Lazikani B., Hopkins A.L. // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. № 12. P. 993-996.
63. Arnold F.H. // Acc. Chem. Res. 1998. V. 31. № 3. P. 125-131.
64. Reetz M.T. // Enzyme Catalysis in Organic Synthesis. / Third Ed. 2012. P. 119-190.
65. Reetz M.T., Carballeira J. D. // Nat. Protocols. 2007. V. 2. № 4. P. 891-903.
66. Kazlauskas R.J., Bornscheuer U.T. // Nat. Chem. Biol. 2009. V. 5. № 8. P. 526-529.
67. Knowles J., Gromo G. // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. V. 2. № 1. P. 63-69.
68. Roses A.D., Burns D.K., Chissoe S., Middleton L., Jean P.S. // Drug Discov. Today. 2005. V. 10. № 3. P. 177-189.
69. Payne D.J., Gwynn M.N., Holmes D.J., Pompliano D.L. // Nat. Rev. Drug Discov. 2007. V. 6. № 1. P. 29-40.
70. Chan P.F., Holmes D.J., Payne D.J. // Drug Discov. Today: Therapeutic Strategies. 2004. V. 1. № 4. P. 519-527.
71. Reetz M.T., Bocola M., Carballeira J.D., Zha D., Vogel A. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2005. V. 44. № 27. P. 4192-4196.
72. Нилов Д.К., Прохорова Е.А., Швядас В.К. // Acta Naturae. 2015. Т. 7. № 2. С. 62-68.
73. Kuravsky M.L., Barinova K.V., Asryants R.A., Schmalhausen E.V., Muronetz V.I. // Biochimie. 2015. V. 115. P. 28-34.
74. Pargellis C., Tong L., Churchill L., Cirillo P.F., Gilmore T., Graham A.G., Grob P.M., Hickey E.R., Moss N., Pav S., et al. // Nat. Struct. Mol. Biol. 2002. V. 9. № 4. P. 268-272.
75. Esnouf R., Ren J., Ross C., Jones Y., Stammers D., Stuart D. // Nat. Struct. Mol. Biol. 1995. V. 2. № 4. P. 303-308.
76. Conn P. J., Christopoulos A., Lindsley C.W. // Nat. Rev. Drug Discov. 2009. V. 8. № 1. P. 41-54.
77. Vazquez-Figueroa E., Chaparro-Riggers J., Bommarius A.S. // ChemBioChem. 2007. V. 8. № 18. P. 2295-2301.
78. Jochens H., Aerts D., Bornscheuer U.T. // Protein Eng. Des. Sel. 2010. V. 23. № 12. P. 903-909.
79. Suplatov D.A., Besenmatter W., Svedas V.K., Svendsen A. // Protein Eng. Des. Sel. 2012. V. 25. № 11. P. 689-697.
80. Pleiss J. // Curr. Opin. Biotechnol. 2011. V. 22. № 5. P. 611-617.
81. Damborsky J., Brezovsky J. // Curr. Opin. Chem. Biol. 2014. V. 19. P. 8-16.
82. Suplatov D., Voevodin V., Svedas V. // Biotechnology J. 2015. V. 10. № 3. P. 344-355.
83. Cole S., Brosch R., Parkhill J., Garnier T., Churcher C., Harris D., Gordon S.V., Eiglmeier K., Gas S., Barry C.E., et al. // Nature. 1998. V. 393. № 6685. P. 537-544.
84. Galperin M.Y., Koonin E.V. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. V. 10. № 6. P. 571-578.
85. Moir D.T., Shaw K.J., Hare R.S., Vovis G.F. // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. V. 43. № 3. P. 439-446.
86. Krissinel E., Henrick K. // Acta Crystallogr. D Biol. Crystal-logr. 2004. V. 60. № 12. P. 2256-2268.
87. Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. // Nucl. Acids Res. 1997. V. 25. № 17. P. 3389-3402.
88. Fischer J.D., Mayer C.E., Söding J. // Bioinformatics. 2008. V. 24. № 5. P. 613-620.
89. Menke M., Berger B., Cowen L. // PLoS Comput Biol. 2008. V. 4. № 1. P. e10.
90. Notredame C., Higgins D.G., Heringa J. // J. Mol. Biol. 2000. V. 302. № 1. P. 205-217.
91. Suplatov D., Kirilin E., Takhaveev V., Svedas V. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2014. V. 32. № 11. P. 1752-1758.
