CC BY
55
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
ivk
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК Б1Б.348-002-079.4
ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ СЫВОРОТКИ КРОВИ В ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ КИШЕЧНИКА (ЯЗВЕННЫЙ КОЛИТ, БОЛЕЗНЬ КРОНА) И СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА
Е.Н. Колодей1, Н.Н. Миронов1, О.П. Алексеева1, А.А. Игнатьев2, С.В. Насонов2, И.В. Челышев2,
1ГУЗ «Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А. Семашко», 2ООО «Медицинская диагностика», г. Н. Новгород
Алексеева Ольга Поликаоповна - e-mail: [email protected]
Изучена возможность использования высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворотки крови для дифференциальной диагностики заболеваний (воспалительных заболеваний кишечника, синдрома раздраженного толстого кишечника) у 77 пациентов. Группы больных
воспалительными заболеваниями кишечника и синдрома раздраженного кишечника были сопоставимы по возрасту. Обработка хроматограмм производилась при помощи многоуровневого кластерного анализа с формированием трехмерных образов патологических состояний, отличающегося при воспалительных заболеваниях кишечника и синдроме раздраженного
кишечника. Диагностическая чувствительность и точность метода достигала 85-100% и 82-92% соответственно.
Ключевые слова: воспалительные заболевания кишечника, синдром раздраженного кишечника, дифференциальная диагностика, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Capabilities of HPLC of blood serum for differential diagnostics of diseases (inflammatory bowel diseases, irritable large bowel syndrome) was studied among 77 patients. Groups of patients with inflammatory
bowel diseases and irritable bowel syndrome matched according to age. Chromatograms processing was carried out with the help of multilevel cluster analysis with formation of 3-D images of pathological conditions, differing in the course of inflammatory bowel diseases and irritable bowel syndrome. Diagnostic sensibility and accuracy of the method achieved 85-100% and 82-92% accordingly.
Key words: inflammatory bowel diseases, irritable bowel syndrome, differential diagnostics, HPLC.
Введение
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), прежде всего язвенный колит (ЯК) и болезнь Крона (БК), по частоте осложнений, тяжести течения, инвалидизации лиц молодого возраста занимают одно из ведущих мест в структуре болезней желудочно-кишечного тракта. При этом во всем мире, в том числе и в России, отмечается четкая тенденция увеличения распространенности этой патологии среди всех возрастных групп. Диагностика ВЗК и синдрома раздраженного кишечника (СРК) представляет трудности для клиницистов. В 10-15% случаев не удается разграничить эти заболевания.
При исследовании гистологического материала у больных с СРК часто выявляются специфические воспалительные изменения, что затрудняет дифференциальную диагностику с ВЗК [1].
В современной аналитической химии и биохимии широко применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) биохимических сред. Этот метод успешно применяется для дифференциальной диагностики многих заболеваний, в том числе ВЗК [2, 3].
Цель исследования: показать возможность применения высокоэффективной жидкостной хроматографии сыворот-
Гастроэнтерология
ки крови для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника и синдрома раздраженного кишечника.
Материалы и методы
Обследованы 77 пациентов (62 - ВЗК, 15 - СРК). Мужчин
- 42 человека (из них 34 - с ВЗК, 8 - с СРТК), женщин - 35 человек (из них 28 - с ВЗК, 7 - с СРТК). Средний возраст больных с ВЗК - 36,4 года (у мужчин - 31,5 года, у женщин
- 41,3 года). Средний возраст больных с СРК - 32,5 года (у мужчин - 38 лет, у женщин - 27,1 года).
Диагнозы ЯК и БК верифицированы в соответствии с международными и российскими рекомендациями обследования больных. У всех больных диагноз подтвержден эндоскопическим и гистологическим исследованиями.
В исследование включены больные ВЗК средней степени тяжести.
Больные ЯК имели давность заболевания от 6 месяцев до 20 лет, большинство больных (55%) от 1 года до 5 лет. Больные БК имели давность заболевания от 6 месяцев до 15 лет. Тяжесть ЯК оценивалась по международному индексу
Мейо. Значение данного показателя составляло у больных от 6 до 10 баллов [10].
Тяжесть БК оценивалась по стандартному международному индексу активности болезни Крона (CDAI). Величина данного индекса составляла у больных от 220 до 450 ед.
В качестве объекта исследования была выбрана сыворотка крови как наиболее доступный материал, несущий в себе максимально возможную информацию о состоянии органов человека.
Забор крови проводился у пациентов натощак в количестве 5-10 мл. Полученная сыворотка (не менее 2 мл) высушивалась при 250 С до состояния сухой корочки и перемалывалась до состояния гомогенного порошка. Далее бралась навеска порошкообразной сыворотки в количестве 40 мг и проводилась экстракция 85% метанолом в течение 45 мин. После осаждения крупно- и среднемолекулярных белков проводилось центрифугирование смеси при ускорении 12 000 об./мин., с последующим отбором надосадочной жидкости. Полученный таким образом экстракт сыворотки крови подвергался хроматографическому исследованию.
При анализе использовалась стандартная методика исследования на хроматографе « Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», г. Новосибирск). Современные жидкостные хроматографы на микроволнах типа « Милихром А-02» представляют собой аналитический комплекс функционально объединенных устройств, обеспечивающих разделение жидких смесей, детектирование, идентификацию и количественный учет компонентов смеси. Контрольная программа встроенного в спектрофотометр компьютера не допускает неправильных и несовместимых параметров, обеспечивая автоматический набор пробы, спектрофотометрическое детектирование, объективность и высокую точность анализов. С использованием специальной диагностической системы STADIA 4,52 на основе многоуровнего кластерного анализа формировались трехмерные образы заболевания [5].
Результаты и их обсуждение
Исследование состояло в построении ВЭЖХ спектральных образов болезни, которые статистически достоверно разграничивали группы больных (мужчин и женщин) ВЗК, СРК. Жидкостно-хроматографические спектральные образы
сыворотки крови больных ВЗК, СРК представлены на рисунках 1 - женщины и 2 - мужчины. Спектральные образы сыворотки крови больных ВЗК (белые точки) и СРК (черные точки) имеют свои специфические характеристики и не пересекаются.
В результате выполненных исследований показана возможность использования технологии построения и анализа жидкостно-хроматографических спектральных образов сыворотки крови для дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника и СРК. Чувствительность и точность диагностики составили 79-100% и 82-92% соответственно.
РИС. 1.
Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови групп больных ВЗК (белые точки), СРК (черные точки) -женщины.
РИС. 2.
Жидкостно-хроматографические спектральные образы сыворотки крови групп больных ВЗК (белые точки), СРК (черные точки) -мужчины.
На рисунках видно практически полное расхождение диагностических образов ВЗК и СРК.
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
ГАСТРОЭНТЕРОЛОГИЯ
Гастроэнтерология
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
Результаты статистического анализа приведенные в таблице 1 и 2, показывают полное разграничение показателей ВЭЖГ у больных ВЗК и СРК с чувствительностью 85% у женщин и 100% у мужчин и уровнем вероятности по критерию хи-квадрат 99,81.
ТАБЛИЦА 1.
Результаты статистического анализа для дифференциальной диагностики между группами больных язвенным колитом, синдрома раздраженного кишечника при помощи ВЭЖХ сыворотки крови у женщин
Характер процесса СРК ВЗК
Кол-во больных 7 28
Истинная диагностика 6 23
Гиподиагностика 1 6
Чувствительность диагностики (%) 85 81
Диагностическая точность (%) 82
Доверительная вероятность (%) 95
Критерий хи-квадрат 39,98
Уровень вероятности(%) 99,81
ТАБЛИЦА 2.
Результаты статистического анализа для дифференциальной диагностики между группами больных язвенным колитом, синдрома раздраженного кишечника при помощи ВЭЖХ сыворотки крови у мужчин
Характер процесса СРК ВЗК
Кол-во больных 8 34
Истинная диагностика 8 30
Гиподиагностика 0 4
Чувствительность диагностики (%) 100 89
Диагностическая точность (%) 92
Доверительная вероятность (%) 95
Критерий хи-квадрат 39,98
Уровень вероятности (%) 99,81
Проводя обсуждение результатов исследования необходимо подчеркнуть, что патогенетические механизмы ВЗК и СРК не идентичны. Существуют особенности иммунологических сдвигов, изменения в функции макрофагов, выделе-^ нии специфических медиаторов воспаления, выработке аутоантител и др. [1].
Применение иммуногистохимических методов исследования позволило обнаружить при ЯК увеличение количества иммуноглобулин-С-содержащих клеток в слизистой оболочке толстого кишечника, при этом продукция Сд-С-1 субкласса увеличивается в ответ на пептидные антигены. При ВЗК увеличено содержание интерлейкина-10. При СРК повышено содержание интерлейкина 4 и 13. Доказана экспрессия рецепторов Т1_К4 при СРК, которая поддерживает
дисрегуляцию иммунного ответа на внутрипросветную микрофлору больных СРК [7].
Почти все зарегистрированные на хроматограмме пики являются олигопептидами, пептидами или низкомолекулярными белками. На этом основании существует реальная возможность построения уникального образа болезни, в том числе ВЗК и СРК, которые будут отличаться по своим временным и частотным характеристикам. Диалектически сам метод ВЭЖХ уникально сочетает элементы анализа, определяемые хроматографическим разложением такого биологического субстрата, как сыворотка крови, на микроструктуры, и элементы синтеза, осуществляемые посредством многоуровнего кластерного анализа с формированием стабильного положения конечного образа в трехмерном пространстве [5].
Заключение
Показана возможность проведения дифференциальной диагностики воспалительных заболеваний кишечника и синдрома раздраженного кишечника с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с компьютерной обработкой хроматографии и построением трехмерного образа болезни. При использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии диагностическая чувствительность метода составила 79-100% и точность
метода - 82-92%. __
ЕЯ
ЛИТЕРАТУРА
1. Белоусова Е.А. Рекомендации по диагностике и лечению болезни Крона. Фарматека. 2009. № 13 (187). С. 38-44 .
2. Loftus E.V.J. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease : Oncidence prevaletnce and environmentae influences. Gastuoenterol. 2004. V. 126. № 6. Р. 1504-1517.
3. Насонов С.Н., Диш А.Ю., Хазанов В.А. Особенность высокоэффективной жидкостной хроматографии анализа гликозида в плазме крови. Актуальные проблемы эксперементальной и клинической фармакологии. Томск: Издательство Томского университета, 2001. С. 61-63.
4. Барам Г.И. Хроматограф Милихром А-02. Определение веществ с применением баз данных ВЭЖХ-УФ. Новосибирск. 2005. 64 с.
5. Насонов С.В. Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 200761453. Программа для обработки спектров и создания экспертных диагностических систем Data Stat. 2007.
6. Белоусова Е.А. Язвенный колит и болезнь Крона. Тверь: Триада, 2002. С. 127.
7. Dlugos A. OP137 the expessionios of foll-like receptoios 4 in colon mocosa is as up-regulated in irritable bower syndrome as it is inflammatory bouver disease. Gastroenterolyjry. 2010. V. 59. Р. 3, 31.
8. Глесдорф Т.Т., Пригожин Н.В. Термодинамическая теория структуры, устойчивости и флуктуации. М.: Мир, 1973. 243 с.
9. Шабалин В.Н. , Шатохина С.Н. Аутогенные ритмы и самоорганизация биожидкостей. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. № 10. С. 364-371.
10. European evidence-based Consensus on the Diagnosis and Management of ulcerative colitis JCC. 2008. V. 2. № 1. Р. 1-92.
