CC BY
22«Ыновацй в стоматологи», № 1, 2014
1. диабета и прменение витаминов и микроэлементов для их лечения и профилактики / М. И. Бала-болкин // Реф. сборник "Новости науки и техники". -Серия "Медицина". - вып. "Клин. Эндокринология". -2006. - № 6. - С. 1-7.
2. Прозапальна дш лшополкахариду на слизо-ву оболонку порожнини рота щурiв / Левицький А.П., Дем'яненко С.О., Макаренко O.A. [та ш.] // Одеський медичний журнал. - 2010. - № 2 (118). - С. 9-11.
3. Ступак Е. П. Развитие дисбиоза и воспаления в десне крыс с аллоксановым диабетом / Е. П. Ступак, А. К. Николишин, О.А. Макаренко, И. А. Се-ливанская // Вюник стоматологи. - 2012. - № 6 (спецвыпуск). - С. 127.
4. Ульянов А. М. Инсулярная система животных при хроническом дефиците гепарина / А. М. Ульянов, Ю. А. Тарасов // Вопросы медицинской химии. - 2000. - Т. 46, № 2. - С. 149-154.
5. Стальная И. Д. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты. В кн.: "Современные методы в биохимии" / И. Д.
Стальная, Т. Г. Гаришвили - М.: Медицина, 1977. -С. 66-68.
6. Биохимические маркеры воспаления тканей ротовой полости: Метод, рекомендации / Левицкий А.П., Деньга О.В., Макаренко O.A. [и др.]. -Одесса, 2010. - 16 с.
7. Гирин С. В. Модификация метода определения активности каталазы в биологических субстратах / С. В. Гирин // Лабораторная диагностика. - 1999.
- № 4. - С. 45-46.
8. Левицкий А. П. Лизоцим вместо антибиотиков / А. П. Левицкий - Одесса: КП ОГТ, 2005. -74 с.
9. Ступак Е. П. Влияние пробиотиков на биохимические маркеры воспаления и антиоксидантной защиты в десне крыс с экспериментальным диабетом 2 типа / Е. П. Ступак // Укр. стомат. альмонах. - 2012.
- № 4. - С. 10-14.
УДК 611.018.4+616.716.4
З. Ш. Какабадзе1'3, д. мед. н., Г. Т. Менабде2, д. мед. н., М. З. Какабадзе1, И. Д. Амиранашвили2, д. мед. н., А. Н. Мачавариани2, К. М. Мазмишвили2, Т. М. Грдзелидзе2, К. С. Шанава1, К. Ш. Чуткерашвили1, Е.Р. Беришвили13, д. мед. н.
1 Кафедра клинической анатомии Тбилисского Государственного медицинского университета 2Научно-исследовательский медицинский институт Государственного университета им. Ильи 3Отделение трансплантации клеток и тканей Грузинского национального Института медицинских исследований
г. Тбилиси, Грузия
ВОЗМОЖНОСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ДЕЦЕЛЮЛЯРИЗИРОВАННОГО, ЛИОФИЛИЗИРОВАННОГО И РЕЦЕЛЮЛЯРИЗИРОВАННОГО КОСТНОГО МАТРИКСА ДЛЯ ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
У КРЫС
Представленная работа касается возможности применения децелюляризированного, лиофилизированного и рецелюляризированного костного матрикса для хирургического лечения обширных костных дефектов.
Эксперимент проведен на крысах линии Lewis. В качестве костного матрикса для заполнения дефекта кости нижней челюсти использовали алло-трансплантат, полученный от крыс-доноров. После децелюляриза-ции и лиофилизации рецелюляризацию костного матрикса проводили стволовыми клетками костного мозга.
Проведенные исследования показали, что через 1 месяц после трансплантации костный дефект был полностью закрыт вновь образованной костной тканью.
Ключевые слова: децелюляризация, рецелюляризация, костная ткань.
© Какабадзе З. Ш, Менабде Г.Т., Какабадзе М. З., Амиранашвили И. Д., Мачавариани А. Н., Мазмишвили К. М., Грдзелидзе Т. М., Шанава К. С., Чуткерашвили К. Ш., Беришвили Е.Р., 2014.
«Ыноваци в стоматологи», № 1, 2014
З. Ш. Какабадзе, Г.Т. Менабде, М. З. Какабадзе, I. Д. Ам1ранашв1л1, А. Н. Мачавар1ан1, К. М. Мазм1швЫ1, Т. М. Грдзел1дзе, К. С. Шанава, К. Ш. ЧуткерашвыцС. Р. Бершвл
Кафедра клшчно! анатоми Тбшського Державного медичного ушверситету Науково-дослщного медичний шститут Державного ушверситету iM. Iллi Вщдшення трансплантацш клiток i тканин Грузинського Нацюнального iнституту медичних дослiджень, м. T6mci, Грузiя
МОЖЛИВ1СТЬ ЗАСТОСУВАННЯ ДЕЦЕЛЮЛЯР1З1РОВАННОГО, Л1ОФ1Л1З1РОВАННОГО I РЕЦЕЛЮЛЯР1З1РОВАННОГО К1СТКОВОГО МАТРИКСУ ДЛЯ ЗАМ1ЩЕННЯ ДЕФЕКТ1В НИЖНЬО1 ЩЕЛЕПИ У ЩУР1В В ЕКСПЕРИМЕНТ1
Представлена робота стосуеться можливостi застосування децелюлярЫрованного, люфшЫрованного i рецелюлярЫрованного юсткового матриксу для хiрургiчного л^вання обширних юсткових дефектiв.
Експеримент проведений на щурах лти Lewis. Як юстковий матрикс для заповнення дефекту юстки ни-жньо'1 щелепи використовували алло-трансплантат, отриманий вiд щурiв-донорiв. Шсля децелюляргзаци i лю-фШзаци рецелюляргзацт юсткового матриксу проводили стволовими клтинами юсткового мозку.
Проведет до^дження показали, що через 1 мкяць тсля трансплантаци юстковий дефект був повтстю закритий знов утвореною юстковою тканиною.
Ключов1 слова: децелюляриза^я, рецелюляриза^я, юсткова тканина.
Z. Sh. Kakabadze, G. T. Menabde, M. Z. Kakabadze, I. D. Amiranashvili, A. N. Machavariani, K. M. Mazmiashvili, T. М. Grdzelidze, К. S. Shanava, К. Sh. Chutkerashvili, Е. R. Berishvili
Department of Clinical Anatomy Tbilisi State Medical University Scientific Research Institute of Medicine, Ilia State University Division of Cell Transplantation and Tissue Engeeniering, Georgian National Institute of Medical Research
Tbilishi, Georgie
REPLACEMENT OF LOWER JAW DEFECTS IN RATS BY DECELULARIZED, LYOPHILIZED AND RECELULARIZED BONE SCAFFOLD
This work concerns to the possibility of application of decelularized, lyophilized and recelularized bone scaffold for large defects replacement offlat facial bones and bones of the skull as well. The studies were performed on Lewis inbred rats. The bone matrix was obtained from donor rats. After decelularisation and lyophilization bone matrix was recelularized with bone marrow derived stem cells. Post operative studies have shown, that the lower jaw bone defect was completely filled with the newly formed bone tissue with large number of full-fledged blood vessels by the end of three weeks. At later time points (one month), the bone defect was completely obscured by the newly formed bone tissue. Thus we can conclude that the healing of bone injuries, characteristics and rate of regenerative process is directly related to osteoinductive and osteoconductive potency of biological material used in the experiment. The decelularized, lyophilized bone scaffold recelularized with bone marrow stem cells maight serve as a biomaterial.
The aim of the study is to determine the possibility of the application of decellulased, frozen-dried and recellulased bone matrix from allotissue of lower jaw as the material for the replacement of defects in jaw.
The experimental studies have shown, that the healing of bone wound, peculiarities and the speed of the formation and the maturation of bone regenerate is connected directly to the osteoinductive and osteoconductive potential of the biomaterial, used in the experiment.
The initial studies have shown, that decellulased, frozen-dried and recellulased bone matrix can be used for the surgical treatment of extensive defects of not only flat bones offacial skeleton, but also the bones of calvarium in whole.
Key words: detselyulyarization, Retselyulyarization, biomaterial.
Пластическое замещение дефектов нижней челюсти является одной из важных проблем реконструктивной челюстно-лицевой хирургии [1, 2]. В последнее десятилетие для замещения дефектов нижней челюсти используются различные синтетические материалы, алло- и ксе-нотрансплантаты [3-6]. Широкое применение получили аутотрансплантации мягкотканно-
костных комплексов, содержащих ребро, гребень подвздошной кости, малоберцовую кость, фрагменты лучевой кости и наружного края лопатки
[7, 8].
Цель исследования. Определить возможность использования в качестве материала для замещения дефектов челюсти децелюляризиро-ванного, лиофилизированного и рецелюляризи-
«Ыноваци в стом
рованного костного матрикса из аллоткани нижней челюсти.
Материал и методы. Эксперимент проведен на 30 белых лабораторных крысах обоего пола линии Lewis, массой 250-300 г. Для получения костного матрикса и стволовых клеток костного мозга животных-доноров умерщвляли методом введения летальных доз тиопентала натрия.
Донорский материал костного матрикса получали методом резекции нижней челюсти с эк-зартикуляцией, используя технику анатомического препарирования. Стволовые клетки костного мозга выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных костей крыс. Полученную суспензию клеток культивировали до 1-го пассирования в среде DMEM, содержащей 20 % фе-тальной телячьей сыворотки (Sigma), затем культуру переносили на среду DMEM, содержащую 10 % фетальную телячью сыворотку (Sigma). На третьем пассаже культуру стволовых клеток костного мозга пассировали на децелюляризиро-ванный лиофилизированный костный матрикс. Через 24 часа среду меняли на остеогенную (среда DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой (Sigma), 0,01мкМ 1,25-дегидроксивитамина D3 (Sigma), 50мкМ аскорбат-2 фосфата (Sigma), 10мМВ глицерофосфата (Sigma)). Клетки культивировали в течение 15 дней со сменой раствора через каждые 3 суток. Дифференцировку клеток оценивали по гистологической окраске на активность щелочной фосфатазы (NBT/BciP Stock Solution-Roche Diagnostics) и по окраске на кальцификацию внеклеточного матрикса (Aliza rin RedS, Sigma).
Животным-реципиентам под общим ингаляционным эфирным наркозом моделировали костный дефект нижней челюсти. Скальпелем производили разрез кожи длиной 1,5-2 см по нижнему краю нижней челюсти. Тупым способом при помощи распатора отслаивали жевательную мышцу и обнажали поверхность кости нижней челюсти в области ее угла. Стоматологическим бором создавали дефект кости диаметром 4 мм, сообщающийся с полостью рта.
Созданный костный дефект восстанавливали децелюляризированным, лиофилизированным и рецелюляризированным костным матриксом.
Децелюляризация нижней челюсти. После тщательного отделения всех тканей от кости нижней челюсти донора, приступали к процессу децелюляризации. Кость промывали 20 мл 0,9 % физиологического раствора и замораживали при температуре -800С в течение 24 часов. Замороженный материал оттаивали при 40С в течение 68 часов. Далее объект помещали в специальный флакон, наполненный раствором PBS (Sigma).
юлоги», № 1, 2014
Флакон фиксировали к шейкеру и мешали в течение 24 часов. Далее раствор PBS последовательно заменяли растворами: 0,1 % раствор SDS, 1 % раствор SDS , 3% раствор SDS и 5 % раствор SDS (Sigma). Не останавливая шейкер, промывание объекта проводили в течение 96 часов. Далее материал промывали 1% раствором Тритон Х-100 (Sigma) в течение 24 часов для удаления остатков SDS. Децелюляризированную кость промывали PBS в течение 5 часов, после чего стерилизовали в 0,1 % растворе надуксусной кислоты (Sigma) в PBS в течение 3 часов. Далее объект промывали с PBS и хранили в стерильном PBS, содержащим антибиотики, при 4°С.
Децелюляризацию оценивали с помощью гистологических методов (окрашивание гематоксилин-эозином), а также на наличие ДНК.
Лиофилизация нижней челюсти. Лиофили-зация децелюляризированной нижней челюсти проводилась на сушилке "QUARCO" Q-Technologies Group GMBH и состояла из 2-х этапов: глубокая заморозка объекта до -500С и раз-морозка объекта в условиях ваакума.
Максимальный срок наблюдения за животными составил 3 месяца. В течение всего срока проводились рентгенологические, морфологические и лабораторные методы исследования. Животные выводились из эксперимента в различные сроки после операции - на 1, 3, 9, 15, 30, 60 и 90 сутки. Объектом исследования служили фрагменты нижней челюсти с искусственно созданным дефектом и трансплантированным костным матриксом.
Фрагменты челюсти фиксировали в 4 % растворе параформальдегида на фосфатном буфере (рН 7,4) не менее 24 часов. После фиксации их декальцинировали в растворе «Биодек R» (BioOptica Milano, Италия) в течение 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Срезы толщиной 5-7мкм окрашивали гематоксилином и эозином по Ван Гизо-ну и изучали под световым микроскопом Opton (Германия) при увеличении до 800-1200. Проводили гистохимические и иммуно-гистохимические методы исследования.
Результаты исследования и их обсуждение. При проведении эксперимента из 30 животных выжили 29 (96,6 %). Одна крыса погибла на 2-е сутки после операции, что было связано с технической погрешностью операции. Остальные животные хорошо перенесли операцию и послеоперационный период. Функциональные результаты лечения оценивались по следующим критериям: открывание рта, жевание и глотание.
Рентгенологические методы показали, что дефект нижней челюсти уже практически не оп-
«1нноваци в стоматологи», № 1, 2014
ределялся к концу первого месяца.
Проведенные гистоморфологические исследования показали, что в первые сутки в области искусственно созданного дефекта развивается воспаление, экссудация, миграция лейкоцитов, что влечет за собой отек тканей.
Начиная со 2-х суток, вместе с процессом разрушения, некроза погибших элементов наблюдается начало процесса восстановления, регенерации. Уже на 8-10 сутки на некоторых участках дефекта кости присутствовали фрагменты рыхлой волокнистой соединительной ткани и грануляции, сформированные отдельные островки молодой костной ткани.
К концу 3-ей недели дефект был полностью закрыт молодой костной тканью с большим числом полнокровных кровеносных сосудов.
К концу 1 -го месяца костный дефект был полностью закрыт вновь образованной костной тканью.
Таким образом, экспериментальные исследования показали, что заживление костной раны, особенности и скорость образования и созревания костного регенерата напрямую связана с ос-теоиндуктивным и остеокондуктивным потенциалом использованного в эксперименте биоматериала.
Проведенные начальные исследования на этом этапе показали, что децелюляризирован-ный, лиофилизированный и рецелюляризирован-ный костный матрикс может быть применен для хирургического лечения обширных дефектов не только плоских костей лицевого скелета, но и костей свода черепа в целом.
Список литературы
1. Wong R. C. Effect of replacement of mandibular defects with a modular endoprosthesis on bone mineral density in a monkey model / Wong R. C., Lee S., Tide-man H. [et al.] // Int. J. Oral Maxillofac. Surg. - 2011. -Vol. 40, N. 6. - P. 633-639.
2. Mazzoleni G. Reconstruction of the TM alJ and ramus in otomandibular dysplasia, by grafting of TMJ and homologous bone branch / Mazzoleni G., Cicognini A., Rizzo R. [et al.] // Rev. Stomatol. Chir. Maxillofac. -2010. - Vol. 111, N. 2. - P. 94-97.
3. Fulop M. Role of fibula in replacement of mandible / Fulop M., Branzaniuc K., Kasler M. // Magy Onkol. - 2009. - Vol. 53, N. 3. - P. 259-262.
4. Deleyiannis F.W. Reconstruction of the through-and-through anterior mandibulectomy defect: indications and limitations of the double-skin paddle fibular free flap / Deleyiannis F.W., Rogers C., Ferris R.L. [et al.] // J. Laryngoscope. - 2008. - Vol. 118, N. 8. - P. 1329-1334.
5. Adamopoulos O. Nanostructured bioceramics for maxillofacial applications / O. Adamopoulos, T. Papadopoulos // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2007. - Vol. 18, N. 8. - P. 1587-1597.
6. Warnke P. H. The mechanical integrity of in vivo engineered heterotopic bone / Warnke P. H., Springer I. N., Acil Y. [et al.] // Biomaterials. - 2006. - Vol. 27., N. 7. - P. 1081-1087.
7. The bone formation in vitro and mandibular defect repair using PLGA porous scaffolds / Ren T., Ren J., Jia X., Pan K. // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2005. - Vol. 15; 74, N. 4. - P. 562-569.
8. Henkel K. O. Repair of bone defects by applying biomatrices with and without autologous osteoblasts / Henkel K. O., Gerber T., Dorfling P. [et al.] // J. Craniomaxillofac. Surg. - 2005. - Vol. 33, N. 1. - P. 4549.
