CC BY
33УДК [616.314.18-002.4-003.93:612.112]-089-092.9
В. Ф. Куцевляк, д. мед. н., В. И. Куцевляк, д. мед. н., Е. А. Омельченко,к. биол. н., А. С. Забирник,
И. В. Цыганова
Харьковская медицинская академия последипломного образования
НАПРАВЛЕННАЯ РЕГЕНЕРАЦИЯ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ОТРОСТКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТВОЛОВИХ КЛЕТОК ЖИРОВОЙ ТКАНИ НА КОЛЛАПАНОВОЙ ПОДЛОЖКЕ
У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
В результате проведенного исследования изучены особенности динамики регенерации костных дефектов нижней челюсти на 16 кроликах породы Шиншилла. Вводили аутологичные стволовые клетки, полученные из жировой ткани в сочетании с коллапаном, в зону дырчатого дефекта объемом 3х3 мм в количестве 100 тысяч, 500 тысяч, 1 миллиона. Установлено, что направленная регенерация костных дефектов нижней челюсти экспериментальных животных с введением 500 тысяч стволовых клеток, полученных из жировой ткани, протекает наиболее благоприятно, без очагового некроза и зон секвестрирования, по сравнению с введением 100 тысяч и 1 миллиона тех же стволовых клеток. Следовательно, для восстановления дефектов костной ткани целесообразно использовать не более 500 тысяч полученных из жировой ткани.
Ключевые слова: направленная регенерация, аутологичные стволовые клетки жировой ткани, коллапан.
В. Ф. Куцевляк, д. мед. н., В. I. Куцевляк, д. мед. н., О. А. Омельченко, А. С. Забiрник, I. В. Циганова
Харшвська медична академ1я шслядипломно! освгги
СПРЯМОВАНА РЕГЕНЕРАЦ1Я К1СТКОВИХ ДЕФЕКТ1В АЛЬВЕОЛЯРНОГО В1ДРОСТКА З ВИКОРИСТАННЯМ СТВОЛОВИХ КЛ1ТИН ЖИРОВО1 ТКАНИНИ НА КОЛЛАПАНОВОЙ П1ДКЛАДЦ1 У ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНИХ ТВАРИН
В результатi проведеного дослгдження вивченг особливостг динамжи регенерацИ юсткових дефектгв ни-жньо'1 щелепи на 17 кроликах породи Шиншила. Шсля введення стволових клтин, вилучених з жирово'1 ткани-ни, у поеднант з коллапаном в зону дгрчастого дефекту 3х3 мм в кшькостг 100 тисяч, 500 тисяч, 1 мшьйону. Встановлено, що направлена регенерацгя юсткових дефектгв нижньо'1 щелепи у експериментальних тварин з введенням 500 тисяч стволових клгтин жировоЧ тканини проттае найсприятливШе, без осередкового некрозу та зон секвестрацИ, поргвняно i з введенням 100 тисяч i 1 мшьйона тих же стволових клтин, отже, для вгд-новлення дефектгв тстковоХ тканини доцлно використовувати не бшьш 500 тисяч СК ЖТ.
Ключовi слова: спрямованарегенерацгя, аутологичш стовбуровг клгтини жирово'1 тканини, коллапан.
V. F. Kutsevlyak, V. I. Kutsevlyak, E. A. Omelchenko, A. S. Zabirnyk, I. V. Tsyganova
Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education
DIRECTIONAL REGENERATION OF ALVEOLAR BONE DEFFECTS USING STROMAL CELLS OF ADIPOSE TISSUE WITH KOLLAPAN SUBSTRATE ON EXPERIMENTAL ANIMALS
The study examined features of the dynamics of regeneration of bone defects of the mandible 16 Chinchilla rabbits. Administered autologous stromal cells derived from adipose tissue in combination with kollapan in zone holey defect in an amount 100 thousand, 500 thousand, one million cells. It was established that the regeneration of bone directed mandible experimental animals with administration of 500 thousand stromal cells derived from adipose tissue proceeds more favorably without focal areas of necrosis and sequestering compared to administration of 100,000 and 1 million same stromal cells. Consequently, for restoring bone defect is advisable to use not more than 500,000from adipose tissue.
Key words: directed regeneration, autologous adipose stem cells, Collapan.
Воспалительные заболевания пародонта занимают значительное место в патологии зубоче-люстной системы.
Однако процент неудач при использовании традиционной терапии требует поиска и разра-
ботки новых, более эффективных методик. Одним из новых перспективных направлений коррекции процесса регенерации является трансплантация стволовых клеток (СК) различного происхождения [1-3].
© Куцевляк В. Ф., Куцевляк В. И., Омельченко Е. А., Забирник А. С., Цыганова И. В., 2014.
Ранее, в тканевой инженерии, использовали стромальные клетки костного мозга. Сейчас внимание привлекает жировая ткань, имеющая мезодермальное происхождение, в ней были обнаружены стромальные клетки, обладающие мультипотентными свойствами [5, 6, 8, 9].
По сравнению со стромальными клетками костного мозга (СК КМ) стромальные клетки жировой ткани (СК ЖТ) имеют ряд преимуществ - они более доступны, выделяются в большем количестве, их способность дифференцироваться в остеогенном направлении меньше зависит от возраста донора[4, 7, 10].
Цель исследования. Изучить регенеративные возможности стволовых клеток, выделенных из жировой ткани у экспериментальных животных.
Изучить в эксперименте регенеративные способности костной ткани в зависимости от количества введенных аутологичных КС ЖТ.
Материалы и методы исследования. Изучение процесса заживления костных дефектов размером 3х3мм проведено на 16 кроликах породы Шиншилла. 12 животных составили основную группу, 4 - контрольную. Основная группа была поделена на три подгруппы по 4 кролика. Аутологичные стволовые клетки, полученные из жировой ткани, на коллапановой подложке вводили в зону дырчатого дефекта нижней челюсти кроликов основной группы в количестве соответственно по 100 тысяч, 500 тысяч, 1 миллион. Забой первой половины животных производили на 42, второй - на 90 сутки. Выделяли фрагменты челюстей с зоной регенерата, фиксировали в формалине и заключали в парафиновые блоки. Гистологические препараты готовили из фрагментов нижних челюстей и окрашивали гематоксилин-эозином и по Ван-Гизон.
Результаты собственных исследований. Динамика структуры регенерации кости после введения 100 тысяч аутологичных СК ЖТ с кол-лапаном на 42 сутки прослеживалась следующим образом: после образования дырчатого дефекта и развития регенерата на 42 сутки на гистотопо-граммах нижней челюсти, согласно морфомет-рическим данным, некротические участки занимали 6 %, гематома 8 %, грануляционная ткань 54 %, остеоидная 20 %, мелкопетлистая сеть костных трабекул 12 %.
Микроскопически на 42 сутки зона дефекта расширилась, образуя в кости дефект с относительно ровными краями. Определялись участки деструкции в кортикальной пластинке по нижней поверхности ложа резца, значительная резорбция альвеолярного отростка. На отдельных участках прослеживалась выраженная лакунарная резорб-
ция фрагментов кости, очагово - и диффузно инфильтрированной лейкоцитами.
Участки новообразованной костной ткани выявлены в толще грануляционной ткани, разделяющей поле некроза (рис. 1).
Рис. 1. Формирование новообразованной костной ткани в толще грануляционной ткани на 42 сутки после введения 100 тыс. СК с коллапаном. Окрашивание гематоксилин-эозин х 100.
В межблочных пространствах таких полей определялась хорошо васкуляризованная кле-точно-волокнистая ткань почти без лейкоцитарной инфильтрации.
Таким образом, в структуре регенерата преобладала клеточно-волокнистая ткань с остео-генными потенциями, а участки остеогенеза обнаруживались по периферии регенерата, где сохранилось микроциркуляционное русло.
На 90 сутки на гистотопограммах остатки гематомы и некротических участков занимали 4 % площади регенерата, клеточно-волокнистая ткань 60 %, мелко и крупнопетлистая сеть новообразованных костных трабекул - 36 %.
Микроскопически на 90 сутки в зонах некроза наблюдались узкие поля грануляционной ткани, чередовавшиеся с полями выраженной лейкоцитарной инфильтрации.
Рис. 2. Введение 100 тыс. СК с коллапаном на 90 сутки. Участки лакунарной резорбции с формированием участков новообразованной костной ткани по перио-стальной и эндостальной поверхности. Окрашивание Ван-Гизон х 100.
На отдельных участках, преимущественно вокруг фрагментов из пластинчатой кости определялась лакунарная резорбция с напластованиями новообразованной костной ткани по пери-стальной и эндостальной поверхности и очаговая лейкоцитарная инфильтрация грануляционной ткани, окружающей эти поля (рис. 2).
Таким образом, на 90 сутки в структуре регенерата кости преобладала клеточно-волокнистая ткань с многочисленными капиллярами.
После введения 500 тысяч аутологичных СК с коллапаном на 42 сутки на гистотопограммах определялась зональность структуры регенерата с разделением на поверхностную и глубокую зоны.
В первой преобладала клеточно-волокнистая ткань с многочисленными капиллярами, во второй обнаружена сеть новообразованных костных трабекул с многочисленными остеобластами на поверхности, и множество клеточных элементов и кровеносных сосудов в межтрабекулярных пространствах. В структуре регенерата 1 % - остатки гематомы в поверхностной зоне, 55 % -клеточно-волокнистая ткань, 12 % - остеоидные и 32 % - новообразованные костные трабекулы (рис. 3).
поверхности и очаговой лейкоцитарной инфильтрацией грануляционной ткани вокруг них (рис. 4).
Рис. 4. Введение 500 тыс. СК из жировой ткани с кол-лапаном на 90 стуки. Участки лакунарной резорбции вокруг фрагментов пластинчатой кости с напластованиями новообразованной костной ткани в зоне регенерата. Окрашивание гематоксилин-эозин х 100.
Таким образом, в период с 42 до 90 суток определялось качественное изменение темпов остеогенеза со значительным увеличением новообразованных костных структур.
После введения 1 млн. аутологичных СКЖТ с коллапаном на 42 сутки на гистотопограммах 3 % составляли беспорядочно расположенные участки некроза и грануляционной ткани - 40 %, местами с интенсивно выраженной инфильтрацией, 8 % - клеточно-волокнистая ткань, 10 % -остеоидная и 39 % - новообразованные костные трабекулы. Отмечалось уменьшение площади дефекта, преимущественно в верхних отделах. Периостальная реакция по нижнему краю кортикальной пластинки ложа резца умеренная. Определялась резорбция альвеолярного отростка.
Рис. 3. Формирование клеточных элементов остео-генной направленности в зоне регенерата после введения 500 тыс. СК из жировой ткани с коллапаном на 42-е сутки. Окрашивание гематоксилин-эозин х 100.
Таким образом, в структуре регенерата преобладала клеточно-волокнистая ткань, хорошо васкуляризованная, почти без лейкоцитарной инфильтрации, и зоны остеогенеза в глубоких отделах дефекта.
На 90 сутки на гистотопограммах клеточно-волокнистая ткань составляла в структуре регенерата 8 %, а сеть остеоидных и новообразованных костных трабекул 92 %, причем 9 % из них крупно-петлистые. По периферии сети костных трабе-кул обнаруживалось формирование новообразований кортикального слоя, занимающего 7 %.
Микроскопически местами вокруг фрагментов из пластинчатой кости определялась лаку-нарная резорбция с пластами новообразованной костной ткани по перистальной и эндостальной
Рис. 5. Введение 1млн. СК из жировой ткани с колла-паном на 42 сутки. Формирование клеточных элементов с интенсивно оксифильной гомогенной цитоплазмой в зоне регенерата. Окрашивание Ван-Гизон х100.
Микроскопически обнаруживалась сформированная грануляционная ткань с узкими полями лейкоцитарной инфильтрации. На отдельных участках определялись фрагменты компактной костной ткани, в которой наряду с четко окрашенными остеоцитами обнаруживались пустые
камеры. Поверхность костных фрагментов с большим количеством лакун резорбции во многих участках сращена с новообразованными костными балочками, которые местами формируют поля, либо переходят в участки остеогенной грануляционной ткани. В ней выявлено значительное количество клеток с ассиметрично расположенным ядром и интенсивно оксифильной гомогенной итоплазмой, что позволяет их отнести к преостеобластам (рис. 5).
На 90 сутки на гистотопограммах регенерат состоял из полей грануляционной ткани - 42 % и новообразованной костной ткани - 48 %, 10 % -участки некроза и секвестры, четко ограниченные грануляционной тканью, в отдельных местах инфильтрированной лейкоцитами в виде узких зон. На фоне множества новообразованных костных балочек, чаще спаянных с поверхностью фрагментов, наблюдались участки компактной костной ткани с отдельными безостеоцитными зонами, местами лакунами резорбции (рис. 6).
Рис. 6. Введение 1 млн. СК из жировой ткани с кол-лапаном на 90 сутки. Активная пролиферация клеточных элементов периостальной зоны и дифференци-ровка их в остеобласты. Окрашивание Ван-Гизон х100.
Таким образом, на 90 сутки продолжает сохраняться картина остеогенеза, описанная выше (на 42 сутки). В данной группе животных регенерация поврежденной нижней челюсти характеризовалась незначительными процессами некроза и инфильтрации тканей, некротические изменения составляли до 10 % на 90 сутки после введения 1 млн. СК ЖТ в сочетании с коллапаном.
Выводы. Следует отметить, что после введения 500 тысяч СК с коллапаном, объем некротических изменений уменьшился до 1 %, а на 90 сутки практически в структуре регенерата не определялся, при этом превалировала остеоидная и новообразованная костная ткань, которая составила 85 %. Введение СК в количестве 100 тысяч с коллапаном также стимулировало увеличение клеточно-
волокнистой ткани и остеогенеза, однако к 90
суткам в зоне дефекта гематома и некротические ткани занимали 4 %, что подтверждается морфометрическими данными.
Анализ гистотопограмм показывает, что при введении СК ЖТ в сочетании с коллапаном в количестве 500 тысяч, определялись значительные сдвиги в остеогенном компоненте между 42 и 90 сутками, однако грануляционная ткань являлась наиболее активным компонентом регенерата во все сроки его формирования и ограничивала поля лейкоцитарной инфильтрации. При этом ос-теогенный компонент получил преобладающее развитие, однако восстановления целостности кости нижней челюсти на 90 сутки не происходило.
Таким образом, направленная регенерация костных дефектов нижней челюсти экспериментальных животных с введением 500 тысяч СК ЖТ протекает наиболее благоприятно, без очагового некроза и зон секвестрирования, по сравнению с введением 100 тысяч и 1 миллиона тех же стволовых клеток, следовательно, для восстановления дефектов костной ткани объемом целесообразно использовать не более 500 тысяч СК ЖТ.
Список литературы
1. Алексеева И. С. Первый опыт применения комбинированного клеточного трансплантата на основе мульти-потентных стромальных клеток (МСК) из жировой ткани у пациентов с выраженным дефицитом костной ткани в области верхней и нижней челюстей / Волков А. В., Кулаков А.А., Григорьян А.С.[и др.] // Материалы Всеросс. науч. школы-конф. для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования. -М., 2009. - С. 53.
2. Воложин А. А. Мультипотентные клетки жировой ткани: перспективы использования в челюстно-лицевой хирургии / Е.В. Киселева Т.Г, Калашникова // Кафедра - 2007.
- № 6. - С. 20-25.
3. Карпюк В. Б. К изучению свежевыделенных - ау-тологичных стромальных клеток подкожной жировой клетчатки для регенерации биологических тканей / В. Б. Карпюк, М.Д. Перова, М. Г. Шубич // Институт стоматологии. -2009 - № 3 - С. 74-76.
8. Стромальные клетки костного мозга, жировой ткани и кожи человека в ходе экспансии, иммунофенотип и дифференцировочный потенциал мезенхимальных стволовых клеток / А. Ю. Петренко, Ю. А. Петренко, Н. Г. Скоро-богатова [и др.] // Трансплантолопя. - 2008. - Т. 10, №1. -С. 84-86.
4. Савченкова И. П. Дифференцировка мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из костного мозга и подкожножировой клетчатки, в клетки костной ткани / Ростовская М.С., Чупикова Н.И., Шарифул-лина С.З., Тепляшин А. С. // Цитология. - 2008. - №5: -разд.10. - С. 855-860.
5. Сергеев В. С. Иммунологические свойства муль-типотентных мезенхимальных стромальных клеток / В.С. Сергеев // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005 - №. 3 - С. 39-42.
6. Трактуев Д.О. Стромальные клетки жировой ткани
- пластический тип клеток, обладающих высоким терапев-
тическим потенциалом / Д.О. Трактуев, Е.В. Парфенова, В.А. Ткачук, К.Л. Марч // Цитология 2006 - №.2 - С. 83-94.
7. Cao Y. Zhao human adipose tissue- derived stem cells differentiate into endothelial cells in vitro and improve postnatal neovascularization in vivo/ Sun Z, Iiao I., Meng Y., Han G // Biochem biophys res commun. - № 2005. - P. 370-379.
8. Gimble J.M. Adipose-Derived Stem Cells for Regenerative Medicine / KatzAJ., Bunnell B.A. // Circulation Research/^» 2007. - S. 100. - Р.1249-1260.
9. Rubina K. Adipose stromal cells stimulate angiogene-sis via promoting progenitor cell differentiation, secretion of angiogenic factors, and enhancing vessel maturation /Kalinina N., Eflmenko A., Lopatina Т., Melikhova V [et al ] //Tissue Eng Part A. - 2009. - № 15. - S.-8. - P. 2039-2050.
Поступила 01.08.14
УДК.616.31:616.716.4-018.4-092.9-099:546.815
В. Ф. Куцевляк, д. мед. н., Н. П. Бобровская Харьковская медицинская академия последипломного образования
ИЗМЕНЕНИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ В КРОВИ, МОЧЕ, ГОМОГЕНАТАХ КОСТНОЙ ТКАНИ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ И ЗУБАХ КРЫС В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО СОДЕРЖАНИЯ СВИНЦА
В работе экспериментальным методом атомно-абсорбционного анализа определена концентрация ацетата свинца в крови, моче, гомогенатах костной ткани нижней челюсти и зубах лабораторных животных. Установлено, что в течение месяца затравки 1 % раствором ацетата свинца значительно достоверно увеличивается концентрация его в опытной группе животных по сравнению с контролем.
Ключевые слова: хроническая свинцовая интоксикация, ацетат свинца, гомогенат костей нижней челюсти и тканей зубов, кровь, моча.
В. Ф.Куцевляк,, Н. П. Бобровська
Харшвська медична академ1я шслядипломно! освгги
ЗМ1НИ ЛАБОРАТОРНИХ ПОКАЗНИК1В У КРОВ1, СЕЧ1, ГОМОГЕНАТАХ К1СТКОВО1 ТКАНИНИ НИЖНЬО1 ЩЕЛЕПИ ТА ЗУБАХ ЩУР1В В УМОВАХ П1ДВИЩЕНОГО ВМ1СТУ
СВИНЦЮ
У роботi експериментальним методом атомно-абсорбцшного анализу визначена концентрацiя ацетату свинцю в кровi, сечi, гомогенатах юстково'1 тканини нижньо'1 щелепи та зубах лабораторних тварин. Встано-влено, що на протязi мкяцю згодовування 1 % розчину ацетату свинцю значно достовiрно збыьшуеться кон-центращя його в пiддослiднiй групi тварин порiвняно з контролем.
Ключовi слова: хротчна свинцева iнтоксикацiя, ацетат свинцю, гомогенат юсток нижньо'1 щелепи та тканин зубiв, кров, сеча.
V. F. Kutsevlyak, N. P. Bobrovska Kharkiv Medical Academy of Post-graduate Education
CHANGES IN LABORATORY PARAMETERS IN BLOOD, URINE, HOMOGENATES OF BONE OF THE LOWER JAW AND TEETH OF RATS IN HIGH LEAD
CONTENT
The ability to accumulate in biological objects and included in the food chain, the toxic effect of even small doses of lead on human and animal necessitate in-depth evaluation of lead dangers to human health and the study of its action on the organs and tissues. The aim of this study was experimental research of degree of accumulation of lead in the hard tissue of teeth and mandible laboratory animals during the month of chronic lead intoxication and their effects on laboratory parameters of blood and urine.
Material and methods. Experiments were conducted on 20 white rats. It has been experimentally established by atomic absorption analysis, the concentration of acetate of lead in blood, urine, homogenates of bone of the lower jaw and teeth laboratory animals during the month 1% solution of lead acetate feeding significantly increases the concentration of its animals in the experimental group compared with the control group.
© Куцевляк В. Ф., Боровская Н. П., 2014.
