CC BY
18
удК 616.12+616.12-005.4+616.12-009.7
влияние фно-а на величину липидвысвобовдающей способности лейкоцитов у больных ишемической
болезнью сердца
Т. В. Бурцева
Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, г. Пермь
Вопросы изучения атерогенеза по-прежнему актуальны. В настоящее время широко обсуждаются воспалительные механизмы возникновения и прогрессирования атеросклеротического поражения. Накоплены данные о роли нейтрофилов в атерогенезе и открыта продуцирующая способность этих клеток (А В. Туев и В. Ю. Мишланов, 2002). Научный интерес представляет изучение влияния провос-палительного цитокина ФНО-а на изменение белоксинтетической функции нейтрофилов, которую мы оцениваем по общей липидвысвобождающей способности лейкоцитов (ЛВСЛ) у больных стабильной стенокардией. дизайн исследования основан на изучении ЛВСЛ в группе больных ИБС в форме стенокардии напряжения III функционального класса. Авторами проведена оценка клинических симптомов, исследовано стимулирующее влияние ФНО-а на ЛВСЛ. В 9 случаях из 9 (100%) добавление в культураль-ную среду ФНО-а в дозе 0,005 пкг/мкл вызывало повышение уровня ЛВСЛ. Средняя величина ЛВСЛ до внесения препарата составила 0,152±0,051 ммоль/л, после — 0,353±0,237 ммоль/л. Полученные результаты указывают на проатерогенное действие эндогенного провоспалительного цитокина ФНО-а у больных ИБС, опосредованное стимуляцией белоксинтетической активности нейтрофилов.
Ключевые слова: атерогенез, стабильная стенокардия, липидвысвобождающая способность лейкоцитов, ФНО-а.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) по-прежнему остаются ведущей причиной смерти во всем мире. В основном это касается болезней, связанных с общим патогенетическим механизмом — атеросклерозом. В литературе имеется много данных об установленной взаимосвязи между процессами атерогенеза и биологическими молекулярными маркерами. Очевидно, что для всех стадий атерогенеза, от момента формирования начальных изменений до развития осложнений, характерно присутствие маркеров воспаления.
В последнее время опубликованы данные о повышенной способности лейкоцитов ве-
нозной крови больных ишемической болезнью сердца (ИБС) к высвобождению белко-во-липидных комплексов в условиях культивирования в неполной питательной среде при условии тесного межклеточного контакта [4]. Этот показатель функции лейкоцитов — липидвысвобождающая способность лейкоцитов (ЛВСЛ) — коррелирует с некоторыми клиническими проявлениями ишеми-ческой болезни сердца и рассматривается авторами как независимый фактор риска развития атеросклероза и маркер активности атеросклеротического процесса при ИБС. В различных работах авторов [1, 3] было показано, что у больных с разными заболеваниями внутренних органов определяются различная величина ЛВСЛ, а также различные
белки, входящие в состав высвобождаемых лейкоцитами белково-липидных комплексов, что обусловлено различиями иммунопатоге-неза этих заболеваний. У больных ИБС имеется свой патогенез и свой иммунопатогенез, которым соответствует та или иная роль отдельных провоспалительных цитокинов в регуляции ЛВСЛ.
Вопросы регуляции функциональной активности нейтрофилов, участие провоспали-тельных цитокинов в механизмах атерогене-за у больных ишемической болезнью сердца остаются по-прежнему актуальными, что и послужило предпосылкой нашего исследования.
Цель исследования — изучение влияния провоспалительного цитокина ФНО-а на величину ЛВСЛ (in vitro) у больных ИБС.
Материалы и методы
ИССЛЕДОВАНИЯ
Мы обследовали 9 больных ИБС в форме стенокардии напряжения III функционального класса, изучали ЛВСЛ венозной крови по методу, описанному А. В. Туевым и В. Ю. Мишлановым (2002 г.).
В исследование включались мужчины в возрасте 46—57 лет, находящиеся на плановом стационарном обследовании и лечении в кардиологическом отделении МУЗ «ГКБ № 4». Диагноз ишемической болезни сердца устанавливали на основании комплексного клинико-инструментального и лабораторного обследования. У 5 пациентов в анамнезе перенесенный инфаркт миокарда (не ранее одного года до начала обследования), 4 пациента имели положительную нагрузочную пробу по результатам тредмил-теста. Вся группа соответствовала III ФК стенокардии напряжения. Все получали стандартную кардиотропную терапию (аспирин, бисопролол или метопролол, ингибитор АПФ). 62
В соответствии с задачами исследования определяли ЛВСЛ по оригинальной методике профессора А. В. Туева и В. Ю. Мишланова (2002 г.). для этого из венозной крови больного в стерильных условиях выделяли лейкоцитарную взвесь, используя метод отстаивания в центрифужных пробирках смеси венозной крови и раствора полиглюкина в соотношении 5 : 3. Суспензию лейкоцитов тщательно отмывали от полиглюкина путем ресуспендирования в физиологическом растворе хлорида натрия 1 раз с последующим центрифугированием для осаждения клеток, 2-й раз отмывку производили в питательной среде Игла. После отмывки лейкоциты ресус-пендировали в питательной среде. Производили количественный подсчет выделенных клеток и готовили взвесь, содержащую 50 000 лейкоцитов в 1 мкл среды. Соотношение лейкоцитов в выделенной суспензии приближалось к таковому в цельной крови, т. е. значительно преобладали нейтрофилы (60—80%). После строгого количественного учета 400 мкл суспензии лейкоцитов культивировали при 37°С в течение 3 суток в неполной питательной среде в пенициллиновых флаконах. Кроме определения ЛВСЛ выявляли влияние ФНО-а на ЛВСЛ. Для этого в культу-ральную среду добавляли раствор ФНО-а в концентрации 0,005 пкг/мкл. Через 3 суток мы определяли в культуральной среде (контрольной и опытной, с добавлением раствора ФНО-а, пробах) содержание общего холестерина в надосадочной жидкости холестерин-оксидазным методом. Для этого с целью повышения чувствительности метода при определении малых концентраций общего холестерина изменяли соотношение исследуемой биологической жидкости (надоса-дочной жидкости культуры лейкоцитов) и рабочего раствора реактивов, указанное в описании метода фирмой-производителем «Human» 1 : 101, до соотношения 1 : 10 и выполняли расчет содержания общего холесте-
рина как соотношение величин оптической плотности опытной пробы и стандартного образца, умноженное на коэффициент 0,517.
Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью интегрированного пакета для статистического анализа Statistica v. 6.0. Оценка достоверности различий между группами наблюдения (р) проводилась на основании непараметрических методов (критерий знаков, критерий Вилкоксона). Достоверность различий устанавливалась при р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Добавление в культуральную среду ФНО-а в дозе 0,005 пкг/мкл вызывало повышение уровня ЛВСЛ в 100% случаев (9 из 9). Средняя величина ЛВСЛ до внесения препарата составила 0,152±0,051 ммоль/л, после — 0,353± ±0,237 ммоль/л (рис.). Различие между группами статистически достоверно (р=0,027).
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что процесс синтеза белково-ли-пидных комплексов нейтрофилами in vitro может быть управляемым с помощью эндогенных модуляторов (цитокинов), в частности ФНО-а, а именно, можно предположить, что провоспалительный цитокин ФНО-а
0,353 Н
0.152
J
ЛВСЛ ЛВСЛ+ФНОЧ!
Рис. Изменение ЛВСЛ у больных ИБС при добавлении ФНО-а (in vitro)
оказывает проатерогенное действие, так как способность лейкоцитов высвобождать бел-ково-липидные комплексы (in vitro) представляет собой важный фактор риска развития атеросклероза.
Ранее в литературе опубликованы данные о стимулирующем влиянии ИЛ-1 и ИЛ-2 на ЛВСЛ у больных ИБС (Мишланов В. Ю., Сидоров Д. В., Обухова О. В., Дубровина В. В., 2003). Следовательно, это еще раз подтверждает участие цитокинов в механизмах атеро-генеза и, соответственно, вовлечение в этот процесс иммунокомпетентных клеток.
В ранее выполненных экспериментальных исследованиях было показано, что бел-ково-липидные комплексы, высвобождаемые лейкоцитами (in vitro) у больных ишемиче-ским инсультом, включают такие белки, как Apo(a) (выделяют его в составе ЛП(а) и СРП, принимающие активное участие в воспалительной реакции сосудов и атерогенезе [1]. Таким образом, можно предположить, что белки (различные в зависимости от иммуно-патогенеза), входящие в состав белково-ли-пидных комплексов, выделяемых нейтрофи-лами под влиянием провоспалительных ци-токинов, и обусловливают развитие того или иного заболевания, подобно тому, как дефицит альфа-1-антитрипсина, ведущий к развитию легочной патологии, обусловлен патологией белка Z, вырабатываемого клетками печени [5].
Механизм активирующего влияния ФНО-а на синтетические процессы в ней-трофилах (in vitro) опосредован взаимодействием с мембранным рецептором и внутриклеточными посредниками с участием нуклеарного фактора NFk-p. Действие ФНО-а на клетки опосредуется специфическими рецепторами. В настоящее время идентифицированы два типа рецепторов ФНО-а. Рецепторы I типа с молекулярной массой 55 кД экспрессируются почти всеми типами клеток и опосредуют главным обра-
зом воспалительные и цитотоксические эффекты ФНО-а. Рецепторы II типа с молекулярной массой 75 кД экспрессируются преимущественно клетками крови, в том числе нейтрофилами, лимфоидными и эпителиальными клетками и участвуют в реализации пролиферативных процессов. Один из генетически обусловленных механизмов синтеза провоспалительных цитокинов также связан с действием ядерного фактора ЭТк-р — белка, который в обычных условиях присутствует в цитоплазме нейтрофилов и мононуклеарных клеток. Под влиянием различных стимулов, в т. ч. ФНО-а, №к-р мигрирует из цитоплазмы в ядро, где связывается со специфическим участком ДНК и активирует транскрипцию «воспалительных» генов. Таким образом, №к-р является фактором, стимулирующим и контролирующим синтез провоспалительных цитоки-нов [2, 5]. По-видимому, этот механизм в большей или меньшей степени имеет место и в процессе атерогенеза.
Выводы
1. ФНО-а стимулирует увеличение ЛВСЛ у больных ИБС предположительно опосредованно через участие рецепторов к ФНО-а и механизмы синтеза белка.
2. Установлена взаимосвязь иммуновос-палительных и атерогенных механизмов, заключающаяся в участии лейкоцитов (нейтро-филов и иммунокомпетентных клеток) в процессе атерогенеза.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Байдина Т. В. Воспалительные механизмы атеросклеротического поражения магистральных артерий головы в развитии ате-ротромботического инсульта и возможности их терапевтической коррекции ста-тинами: автореф. дис. ... д-ра мед. наук/ Т. В. Байдина.— Пермь, 2006.— 42 с.
2. Белоусова Е. А. Биологическая стратегия в лечении воспалительных заболеваний кишечника/Е. А. Белоусова_//Ревматология. Иммунология. Гастроэнтерология.— Фар-матека.— 2006.— № 6.— С. 10—18.
3. Изменение липидвысвобождающей способности лейкоцитов при различных пульмонологических заболеваниях/ В. Ю. Мишланов, И. П. Корюкина, Т. В. Бурцева, Н. Н. Середенко, Н. Б. Ярославцева, Н. С. Морозова//Аллергология и иммунология. XIII Международный конгресс по реабилитации в медицине и иммунореа-билитации. Всемирный форум по астме.— Дубаи, 2008.— Т. 9.— № 1.— С. 27—28.
4. Туев А. В. Экспериментальные предпосылки новой теории атерогенеза/А. В. Туев,
B. Ю. Мишланов//Болезни сердечно-сосудистой системы: теория и практика. Материалы I съезда кардиологов Приволжского и Уральского федеральных округов Российской Федерации.— Пермь, 2003.—
C. 258—265.
5. Хаитов Р. М. Иммунология/Р М. Хаитов, Г. А. Игнатьева, И. Г. Сидорович.— М.: Медицина, 2000.— 431 с.
6. Bals R. Alpha-1-antitrypsin deficiency: pathophysiology, diagnosis and treatment/ R. Bals, T. Kohnlein//Georg Thieme Verlag Stattgart.— New York, 2009.— С. 83.
T. V. Burtseva
effect of tnf-а on lipid-releasing leukocyte ability value in patients with ischemic heart disease
The problems of studying atherogenesis are still important today. At present, inflammatory mechanisms of occurring and progressing of atherosclerotic lesion are widely discussed. Data on the role of neutrophiles in atherogenesis are accumulated and producing ability of these cells
(Tuev A. V., Mishlanov V. Yu., 2002) is revealed. Investigation of antiinflammatory cytokine TNF-a effect on changes in protein-synthetic neutrophile function estimated by general lipid-releasing leukocyte ability (LRLA) in patient with stable stenocardia is of scientific interest. Design of investigation is based on studying LRLA in the group of patients with IHD in the form of functional class III tension stenocardia. The authors evaluated clinical symptoms, investigated stimulating TNF-a effect on LRLA. In nine out of nine cases (100%) addition of TNF-a into cultural medium in the dose of 0,005 pcg/mcl caused increase in LRLA. Mean value of LRLA before introducing the preparation was 0,152±0,051 mmol/l, after - 0,353±
±0,237 mmol/l. The obtained results demonstrated proatherogenic effect of endogenous antiinflammatory cytokine TNF-а in IHD patients that was mediated by stimulation of protein-synthetic neutrophile activity.
Keywords: atherogenesis, stable stenocardia, lipid-releasing leukocyte ability, TNF-а.
Контактная информация: Бурцева Татьяна Владимировна, аспирант кафедры пропедевтики внутренних болезней Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 265-98-03
Материал поступил в редакцию 01.11.2010
