CC BY
54
оригинальные исследования
© коллектив авторов, 2013 Удк 616.13-004.6-07:616.155.3-008.1
протеинсинтезирующая функция нейтрофилов и липидвысвобождающая способность лейкоцитов у Больных атеросклерозом
В.Ю. Мишланов, П.Я. Сандаков, A.B. Ронзин, В.Е. Владимирский, Л.И. Сыромятникова, Т.А. Половинкина, н.н. Середенко, о.В. Харузина, С. Л. Мишланова
ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера» Минздрава России, 614990 Пермь
В супернатантах лейкоцитарных культур, обогащенных нейтрофилами, определяли концентрацию альфа-дефензи-нов, липопротеида(а), С-реактивного белка, предшественника мозгового натрийуретического пептида, фактора VII свертывания крови и фактора Виллебранда с целью оценки интенсивности их синтеза у больных со стенокардией напряжения и атеросклерозом нижних конечностей. Выполнена оценка нагрузочного теста с фактором некроза опухоли a in vitro. Одновременно проведено изучение сывороточных концентраций цитокинов и проатерогенных белков. Установлено, что у больных ишемической болезнью сердца имеет место нарушение белоксинтезирующей функции нейтрофилов, проявляющееся в снижении синтеза альфа-дефензинов, увеличении синтеза аполипопротеина A, предшественника мозгового натрийуретического пептида, С-реактивного белка и фактора Виллебранда. Установлена патогенетическая роль фактора некроза опухоли а. Выявлено увеличение концентрации интерлейкина-8 в сыворотке крови.
Кл юче вые слова: нейтрофилы; альфа-дефензины; цитокины.
PROTEIN-SYNTHESIZING FUNCTION OF NEUTROPHILS AND LIPID-RELEASING ABILITY OF LEUKOCYTES IN PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS
V.Yu. Mishlanov, P.Ya. sandakov, A.V. Ronzin, V.E. Vladimirsky, L.I. Syromyatnikova, T.A. Polovinkina, N.N. Seredenko, O.V. Kharuzina, S.L. Mishlanova
E.A. Vagner Perm State Medical Academy, Russia
Concentrations of defensins-alpha, lipoprotein(a), C-reactive protein, proBNP, VII- coagulation factor and von Wilebrandt factor were measured in supernatants of 3-day leukocyte cultures enriched with neutrophils in order to estimate their synthesis in patients with stable angina and atherosclerosis of lower extremities. In addition, in vitro tumor necrosis factor—alpha test was performed. Simultaneously, concentrations of serum interleukine-6, -8, defensins-alpha, C-reactive protein, proBNP, VII-coagulation factor were determined. Neutrophil protein synthesis was impaired in the patients with stable angina. The same was true of defensins-alpha synthesis whereas production of lipoproteins, pro-BNP, C-reactive proteins, IL-8, and von Wilebrandt factor increased. Pathogenetic role of TNF-alpha was demonstrated.
Key words: neutrophils; defensins-alpha; citokines.
Атеросклероз как платформа для развития многих сердечно-сосудистых заболеваний является областью повышенного внимания ученых и врачей разных специальностей. Наиболее распространенными методами лабораторного контроля заболевания являются определение концентрации общего холестерина и липидного спектра сыворотки крови [1]. В биологических жидкостях холестерин всегда ассоциирован с молекулами белков и жирных кислот, поэтому вопрос о значимости того или иного звена этого треугольника остается до сих пор нерешенным [2]. В 2000 г. впервые были опубликованы результаты изучения нарушения функциональной активности нейтрофилов, позволившие высказать мнение о наличии у этих активных участников воспалительного процесса новой функции — ли-пидвысвобождающей способности. Указанная функция реализуется посредством синтеза ряда белков и пептидов, способных к образованию связи с молекулой холестерина, формированию белково-липидных комплексов (БЛК) [3]. В дальнейшем были определены основные белки, принимающие участие в реализации названной функции, первым из которых был назван аполипопротеин A (апоA) [4]. В настоящее время про-
блема синтеза нейтрофилами проатерогенных белков активно обсуждается в научной литературе [5]. Внимание ученых привлекли альфа-дефензины — противо-микробные пептиды, синтезируемые нейтрофилами и эпителиальными клетками человека. Продолжающаяся научная дискуссия может привести к уточнению роли тех или иных, известных и ранее неизвестных молекул белков и пептидов, принимающих участие в формировании атеросклеротических бляшек. С точки зрения поиска новых лекарственных препаратов интерес представляют механизмы регуляции этой функции нейтро-филов.
Цель исследования заключалась в изучении белок-синтезирующей функции и липидвысвобождающей способности лейкоцитов (ЛВСЛ) у больных ишемиче-ской болезнью сердца (ИБС) и облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей (ОАНК).
Материал и методы
Обследовано 65 больных ОАНК, 57 больных ИБС и 20 практически здоровых лиц. Группы больных и здоровых лиц были сопоставимы по возрасту (от 40 до 77 лет); во всех группах преобладали мужчины (94%
Таблица 1. Показатели ЛВСЛ (в мкмоль/л) и концентрация белков и пептидов (в нг/мл) в супернатантах культур лейкоцитов (М ± а)
Показатель Здоровые лица Больные Р1 Р 2 Р3
ИБС ОАНК
ЛВСЛ 0,12 ± 0,024 0,16 ± 0,081 0,17 ± 0,135 0,040 0,1099 0,7636
HDA1-3 115,9 ± 83,81 62,1 ± 46,52 136,9 ± 86,14 0,044 0,438 0,004
АпоА 35,7 ± 11,75 48,1 ± 10,22 56,6 ± 7,84 0,051 0,0001 0,010
VII-F 2,8 ± 4,70 2,5 ± 2,97 0,1 ± 0,37 0,150 0,0326 0,045
СРБ 1,9 ± 2,08 5,1 ± 3,40 6,6 ± 6,43 0,004 0,001 0,120
ФВ 0,032 ± 0,016 0,040 ± 0,008 0,051 ± 0,016 0,047 0,075 0,150
proBNP 0,002 ± 0,0033 0,198 ± 0,319 0,003 ± 0,0041 0,043 0,12 0,026
Примечание. Здесь и в табл. 2: р1 — достоверность различий показателей у здоровых лиц и больных ИБС, р2 — достоверность различий показателей у здоровых лиц и больных ОАНК, р3 — достоверность различий показателей у больных ИБС и ОАНК.
больных ОАНК, 86% больных ИБС). У 66,1% больных ОАНК имелись сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы — ИБС и/или артериальная гипертензия. У 76,9% больных хроническая артериальная недостаточность соответствовала стадии 11Б, у 13,9% — III и IV стадиям, у 9,2% — I стадии. Больные ИБС имели стенокардию напряжения II—III функционального класса; в 95,4% случаев имело место сочетание ИБС с артериальной гипертензией II стадии. Больные получали антигипертензивную терапию — ингибиторы ангиотензинпревращающего фермента и ß-адреноблокаторы (лозартан в дозе 10—20 мг/сут и/ или бисопролол в дозе 5—10 мг/сут или карведилол в дозе 12,5 мг/сут). Хроническая сердечная недостаточность у 94,5% больных ИБС характеризовалась II—III функциональным классом. Больные обследованы в кардиологическом отделении МАУЗ ГКБ № 4 и Федеральном центре сердечно-сосудистой хирургии (Пермь).
Специальные методы исследования заключались в определении концентрации в сыворотке крови интер-лейкинов (ИЛ) 6 и 8 с помощью тест-наборов фирмы «Вектор-Бест-Урал» (Новосибирск), фактора некроза опухоли а (ФНОа) — с помощью тест-набора фирмы «Вектор-Бест-Урал» (Новосибирск) в сыворотке крови, концентрации альфа-дефензинов 1-3 — с помощью тест-набора фирмы Hycult Biotech (HDA1-3), аполипопротеина A (апоА) — с помощью набора фирмы «Assa Pro»), С-реактивного белка (СРБ) — с помощью тест-набора фирмы «Вектор-Бест-Урал» (Новосибирск), предшественника мозгового натрийуретиче-ского пептида (proBNP) — с помощью набора фирмы «Biomedica» (Словакия), фактора Виллебранда (ФВ) — с помощью набора фирмы «Technozym». Кроме этого, определяли ЛВСЛ по методу, разработанному А.В. Туевым и соавт. [4], концентрации HDA1-3, СРБ, proBNP, ФВ, VII фактора свертывания крови (VII-F) — с помощью набора фирмы «Assa Pro»), апоА в супернатантах 3-суточных культур нейтрофилов.
Исследование ЛВСЛ проводили в иммунологической лаборатории ЦНИЛ ГБОУ ВПО ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера Минздрава России по авторскому методу А.В. Туева, В.Ю. Мишланова [4]. Для этого из венозной крови больного в стерильных условиях выделяли взвесь лейкоцитов, используя метод отстаивания в центрифужных пробирках смеси венозной крови и раствора полиглюкина в соотношении 5:3. Суспензию лейкоцитов тщательно отмывали от полиглюкина: в первый раз путем осторожного ресуспендирования в изотоническом растворе натрия хлорида с последующим центрифугированием для осаждения клеток, во второй раз отмывку производили в питательной среде
Игла. После отмывки лейкоциты ресуспендировали в питательной среде. Производили количественный подсчет выделенных клеток и готовили взвесь, содержащую 50 000 лейкоцитов в 1 мкл среды. Соотношение лейкоцитов в выделенной суспензии приближалось к таковому в цельной крови в виде значительного преобладания (60—80%) нейтрофилов. После строгого количественного учета 400 мкл суспензии лейкоцитов культивировали при 37°С в течение 3 сут в неполной питательной среде в пенициллиновых флаконах. Через 3 сут в надосадочной жидкости определяли содержание общего холестерина холестериноксидазным методом (тест-набор фирмы «Human»).
Выполнен тест с ФНОа in vitro. Определение показателя ЛВСЛ выполняли в опытном (с добавлением 20 мкл раствора ФНОа в конечной концентрации 0,005 мкг/мл) и контрольном (с добавлением 20 мкл питательной среды) образцах культур лейкоцитов. Опытный и контрольный образцы инкубировали в течение 62 ч при 37°С в термостате. После инкубации взвесь осторожно ресуспендировали с помощью ручного дозатора вместимостью 200 мкл, центрифугировали в течение 5 мин при 400 g. После этого осторожно забирали надосадочную жидкость и определяли в ней концентрацию холестерина холестериноксидазным методом с помощью набора реактивов фирмы «Human». Полученные результаты обозначали как индуцированную ФНОа ЛВСЛ (опытный образец) и спонтанную ЛВСЛ (контрольный образец).
Статистическая обработка материала проведена при помощи программного пакета Statistica 8.0. Характеристика групп дана с использованием значений средней величины и среднего квадратического отклонения (М±о). Сравнение двух независимых выборок осуществляли с использованием критерия t для независимых наблюдений и непараметрического критерия Манна—Уитни. Различия считали достоверными при p < 0,05. Выполняли корреляционный анализ и рассчитывали коэффициент Спирмена.
Результаты и обсуждение
Средний показатель ЛВСЛ у больных ИБС достоверно превышал таковой у здоровых лиц. Повышение показателя более 0,15 ммоль/л выявлено у 40% больных ОАНК.
Определены средние концентрации белков в супернатантах культур лейкоцитов. У практически здоровых лиц отмечен максимальный удельный вес HDA1-3 и апоА. Больные ИБС отличались увеличением продукции нейтрофилами молекул proBNP, СРБ, ФВ, апоА, снижением синтеза HDA1-3.. Больные ОАНК имели увеличение продукции СРБ (табл. 1).
Показатель Здоровые лица Больные Р1 Р 2 Р3
ИБС ОАНК
HDA1-3 0,16 ± 0,135 0,67 ± 0,923 0,43 ± 0,485 0,043 0,046 0,111
ИЛ-6 1,0 ± 0,26 1,5 ± 0,58 1,0 ± 0,19 0,074 0,232 0,048
ИЛ-8 4,7 ± 12,04 13,7 ± 34,31 3,5 ± 5,95 0,034 0,664 0,150
СРБ 10,3 ± 10,31 44,7 ± 42,70 46,9 ± 55,12 0,005 0,005 0,314
VII-F 11,6 ± 4,49 14,2 ± 9,01 8,7 ± 4,34 0,251 0,034 0,009
proBNP 4,1 ± 9,35 43,3 ± 86,98 13,5 ± 39,21 0,052 0,301 0,129
Показатели концентрации биологических веществ в сыворотке крови в обследованных группах больных также различались. Выявлено повышение концентрации HDA1-3, СРБ, ИЛ-8 в сыворотке крови больных ИБС. У больных ОАНК имело место повышение показателей HDA1-3 и СРБ (табл. 2).
Сравнительный анализ результатов культуральных и серологических исследований показал, что HDA1-3 выявляются в культурах клеток в концентрациях, в 100 раз больших, чем в сыворотке крови. Выявлены противоположные изменения: снижение интенсивности синтеза HDA1-3 и повышение их концентрации в сыворотке крови у больных ИБС. Возможной причиной полученного результата является различие источников синтезируемых пептидов. Известно, что HDA1-3 синтезируются эпителиальными клетками кишечника и нейтрофилами [6]. Однако в период циркуляции в крови (около 8 ч) белоксинтезирующая функция нейтро-филов не осуществляется, так как отсутствует необходимый тесный межклеточный контакт, возникающий после миграции нейтрофилов в очаг воспалительной реакции [7], поэтому концентрация HDA1-3 может в сыворотке крови не совпадать с активностью той или иной клеточной популяции. Тем не менее HDA1-3 принимают участие в киллинге фагоцитированных микроорганизмов. Полученные результаты указывают на снижение бактерицидного потенциала нейтрофилов у больных ИБС. Одновременно отмечено изменение спектра синтезируемых нейтрофилами белков и пептидов, участвующих в механизмах воспаления и атероге-неза, увеличение синтеза апоA, СРБ и ФВ.
В проведенном экспериментальном исследовании in vitro установлено, что во всех 9 (100%) экспериментах добавление в культуральную среду ФНОа в дозе 0,005 мкг/мл вызывало повышение показателя ЛВСЛ. Средний показатель ЛВСЛ до внесения препарата составил 0,15 ± 0,051 ммоль/л, после — 0,35 ± 0,237 ммоль/л; различия показателей в группах статистически достоверны (p = 0,027).
У больных ИБС выявлена прямая достоверная ранговая взаимосвязь между ЛВСЛ и концентрацией ФВ в супернатантах лейкоцитарных культур (r = 0,5679, p = 0,0429). У больных ОАНК установлена достоверная прямая ранговая взаимосвязь между ЛВСЛ и уровнем СРБ в супернатантах лейкоцитарных культур (r = 0,5630, p = 0,0289). В общей группе больных ИБС и ОАНК установлена прямая взаимосвязь между ЛВСЛ и уровнем СРБ в супернатантах лейкоцитарных культур (r = 0,4591, p = 0,0140), а также между ЛВСЛ и концентрацией proBNP в сыворотке крови (r = 0,4380, p = 0,0470). У здоровых лиц выявлена достоверная обратная взаимосвязь между концентрацией HDA1-3 и апоA в супернатантах лейкоцитарных культур (r = 0,9005, p = 0,0001), что указывает на взаимоисключающий характер синтеза этих белковых факторов, связывающих молекулы холестерина с образованием БЛК, и
подтверждает мнение о нарушении ЛВСЛ при сердечно-сосудистых заболеваниях.
Проблема нарушения белоксинтезирующей функции нейтрофилов у больных атеросклерозом практически не обсуждалась в научных публикациях и представляется относительно новым взглядом на патогенез атеросклероза и многих сердечно-сосудистых заболеваний. Информация о нарушении синтеза HDA1-3 накапливается с середины 80-х годов XX века, и можно говорить о единичных публикациях, посвященных проблеме сердечнососудистых заболеваний [5]. Интерес представляет тот факт, что многие синтезируемые нетрофилами белки и пептиды обладают способностью связывать молекулы холестерина и образовывать БЛК. Определение таких комплексов может осуществляться как с учетом пептидов и белков, образующих БЛК, так и без учета качественного состава, только по концентрации общего холестерина в супернатантах культур лейкоцитов. Исследования, посвященные изменению ЛВСЛ, проводились нами с конца 90-х годов прошлого столетия. Были получены данные об участии нарушения функциональной активности нейтрофилов у больных нестабильной стенокардией, ишемическим инсультом, другими заболеваниями [3, 4]. Таким образом, новые данные конкретизируют нарушение белоксинтезирующей функции нейтро-филов у больных атеросклерозом разной локализации и открывают перспективы продолжения научного поиска для определения маркеров оценки течения и эффективности терапии сердечно-сосудистых заболеваний.
Выводы
1. Установлено нарушение белоксинтезирующей функции нейтрофилов у больных ИБС: уменьшение содержания альфа-дефензинов и увеличение — про-воспалительных и проатерогенных белков и пептидов в супернатантах лейкоцитарных культур.
2. Больные ишемической болезнью сердца и обли-терирующим атеросклерозом артерий нижних конечностей имеют разный спектр белков, интезируемых нейтрофилами. У больных ишемической болезнью сердца белково-липидные комплексы включают аполи-попротеин А, С-реактивный белок, фактор Виллебран-да, предшественник мозгового натрий уретического пептида. У больных ОАНК белково-липидные комплексы включают аполипопротеин А, С-реактивный белок, фактор Виллебранда.
3. Концентрация проатерогенных белков в сыворотке крови не всегда отражает активность белоксинте-зирующей функции нейтрофилов. Установлено одновременное уменьшение синтеза альфа-дефензинов и повышение их концентрации в сыворотке крови у больных ишемической болезнью сердца.
4. Изменение соотношения синтеза нейтрофилами различных белков и пептидов, связывающих холестерин с образованием белково-липидных комплексов, а также увеличение общей липидвысвобождающей спо-
собности лейкоцитов могут быть важными механизмами патогенеза атеросклероза разной локализации.
5. Цитокины участвуют в регуляции липидвысво-бождающей способности лейкоцитов; установлены повышение сывороточной концентрации интерлейкина-8, а также стимулирующее влияние фактора некроза опухолей а in vitro и его активное участие в механизмах син-
теза провоспалительных и проатерогенных белков ней-трофилами у больных ишемической болезнью сердца.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 11-04-96021 и субсидии Правительства Пермского края, соглашение № С-26/631 от 19.12.2012.
Сведения об авторах:
Пермская государственная медицинская академия им. Е.А. Вагнера
Кафедра пропедевтики внутренних болезней
Мишланов Виталий Юрьевич — д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой; e-mail: [email protected]
Владимирский Владимир Евгеньевич — канд. мед. наук, доцент кафедры.
Сыромятникова Людмила Илариевна — д-р мед. наук, доцент кафедры.
Половинкина Татьяна Александровна — аспирант кафедры.
Середенко Наталья Николаевна — аспирант кафедры.
Харузина Ольга Владимировна — аспирант кафедры.
Кафедра общей хирургии
Сандаков Павел Яковлевич — д-р мед.наук, проф., проф. кафедры. Кафедра иностранных языков
Мишланова Светлана Леонидовна — д-р филол. наук, проф., проф. кафедры. Городская клиническая больница № 4, Пермь
Ронзин Андрей Владимирович — канд. мед. наук, главный врач.
ЛИТЕРАТУРА
1. Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза. Российские рекомендации, V пересмотр. Российский кардиологический журнал. 2012; 4(96): Приложение.
2. Титов В.Н. Жирные кислоты, липиды (транспортные формы жирных кислот) и аполипопротеины (липидпереносящие макромолекулы) — единая функциональная система. Клиническая лабораторная диагностика. 2007; 1: 3—9.
3. Патент РФ № 2194995 от 20.12.2002 на изобретение А.В. Туева, В.Ю. Мишланова. Способ диагностики прогрессирующей стенокардии у больных ишемической болезнью сердца. Приоритет установлен 23.04.00.
4. Мишланов В.Ю., Туев А.В., Шутов А.А. и др. Метод липидвысвобождающей способности лейкоцитов в диагностике механизмов атерогенеза у больных ишемической болезнью сердца и атеротромботическим вариантом мозгового инсульта. Клиническая лабораторная диагностика. 2006; 5: 9—12.
5. Higazi A.A., Nassar T., Ganz T., Rader D.J., Udassin R., Bdeir K.
et al. The alpha-defensins stimulate proteoglycan-dependent catab-olism of low-density lipoprotein by vascular cells: a new class of inflammatory apolipoprotein and a possible contributor to athero-genesis. Blood. 2000; 96(4): 1393—8.
6. Wehkamp J., Fellermann K., Herrlinger K.R., Bevins C.L., Stange E.F. Mechanisms of disease: defensins in gastrointestinal diseases. Nature Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2005; 2(9): 406—15.
7. Hattar K., Franz K., Ludwig M. et al. Interactions between neutrophils and NSCLC cells in vitro effects on neutrophil inflamma-
tory mediator generation and tumour cell proliferation. J. Clin. Oncol. 2009; suppl.: abstr. e22148.
REFERENCES
1. Lipid metabolism management for atherosclerosis prophylaxis and treatment. Russian recommendation, V edition. Ros. Cardiol. J. 2012; 4(96). Suppl.
2. Titov V.N. Lipid acids, lipids (lipid acids transport forms) and apoli-poproteins (lipid caring molecules) — one functional system. Clinical laboratory diagnosis. 2007; 1: 3—9.
3. Invention of Russian Federation № 2194995, 20.12.2002. «The method of progressive stenocardia diagnosis in the heart coronary disease patients» (Tuev A.V., Mishlanov V.Ju.).
4. Mishlanov V.Ju., Tuev A.V., Shutov A.A. et al. Method lipid-releas-ing leukocytes ability in the diagnosis of mechanisms atherosclerosis in patients with coronary heart disease and variant atherothrombotic stroke. Clinical laboratory diagnosis. 2006; 5: 9—12.
5. Higazi A.A., Nassar T., Ganz T., Rader D.J., Udassin R., Bdeir K. et al. The alpha-defensins stimulate proteoglycan-dependent catab-olism of low-density lipoprotein by vascular cells: a new class of inflammatory apolipoprotein and a possible contributor to atherogen-esis. Blood. 2000; 96(4): 1393—8.
6. Wehkamp J., Fellermann K., Herrlinger K.R., Bevins C.L., Stange E.F. Mechanisms of disease: defensins in gastrointestinal diseases. Nature Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2005; 2(9): 406—15.
7. Hattar K., Franz K., Ludwig M. et al. Interactions between neutrophils and NSCLC cells in vitro effects on neutrophil inflammatory mediator generation and tumour cell proliferation. J. Clin. Oncol. 2009; Suppl.: abstr. e22148.
Поступила 29.09.13
