CC BY
39
Оригинальные статьи
23
ВЛИЯНИЕ ЦИКЛИЧЕСКИХ ГИДРОКСАМОВЫХ КИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ CА2+-АТФАЗЫ САРКОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО РЕТИКУЛУМА И ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ ЦИКЛИЧЕСКОГО ГУАНОЗИНМОНОФОСФАТА
Л.В. Татьяненко, И.В. Выстороп, О.В. Доброхотова, И.Ю. Пихтелева, А.И. Котельников
ФГБУ«Институт проблем химической физики» РАН; Россия, 142432, Московская область, Ногинский район,
г. Черноголовка, пр-т академика Семенова,1
Контакты: Лилия Васильевна Татьяненко [email protected]
Цель исследования — изучение действия циклических гидроксамовых кислот (ЦГК) I—VIна функцию ферментов Са2+-АТФа-зы саркоплазматического ретикулума (Са2+-АТФазы СР) и фосфодиэстеразы (ФДЭ) циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ).
Материалы и методы. Измерение активности Са2+-АТФазы и ФДЭ цГМФ.
Результаты. Показано, что ЦГКI—VI в исследованных концентрациях (0,1; 0,01 и 1 мкМ) разобщают гидролитическую и транспортную функции фермента Са2+-АТФазы СР, что предполагает антиметастатический эффект этих соединений. Так, в 0,1 мМ концентрации ЦГК тормозят активный транспорт Са2+ через мембрану саркоплазматического ретикулума (СР) на 40 ± 4 % (ЦГК-I), 50 ± 5% (ЦГК-II), 53 ± 5% (ЦГК-III), 70 ± 8% (ЦГК-V), 75 ± 8% (ЦГК-VI) и ингибируют гидролиз аденозинтрифосфата (АТФ) на 20 ± 2; 0; 0; 45 ± 5; 47 ± 3 % соответственно. ЦГК-III, ЦГК-V и ЦГК-VI ингибируют активный транспорт Са2+ на 46 ± 5; 47 ± 5 и 60 ± 6 % и не ингибируют или ингибируют на 23 ± 2 и 27 ± 3 % гидролиз АТФ при 0,01 мМ концентрации. ЦГК-V обратимо и неконкурентно тормозит гидролитическую функцию Са2+-АТФазы СР с К = 0,4 мМ. Все исследованные ЦГК в 0,1 мМ концентрации тормозят активность ФДЭ цГМФ менее чем на 20 %. Выводы. Полученные данные позволяют прогнозировать антиметастатическую активность соединений ЦГК-II, ЦГК-III, ЦГК-V, ЦГК-VI и рекомендовать их для углубленного изучения на животных в качестве перспективных лекарственных препаратов антиметастатического действия.
Ключевые слова: Са2+-АТФаза саркоплазматического ретикулума, фосфодиэстераза циклического гуанозинмонофосфата, циклические гидроксамовые кислоты
DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-3-23-27
THE EFFECT OF CYCLIC HYDROXAMIC ACIDS ON ACTIVITY OF CА2+-ATPASE OF SARCOPLASMIC RETICULUM AND CYCLIC GUANOSINE MONOPHOSPHODIESTERASE
L. V. Tat'yanenko, I. V. Vystorop, O. V. Dobrokhotova, I. Yu. Pikhteleva, A.I. Kotelnikov
Institute of Problems of Chemical Physics RAS; Academician Semenov avenue 1, Chernogolovka, Moscow region, 142432, Russia
Objective. The aim of the study was to research effect of new cyclic hydroxamic acids (CHA) I—VI on activity of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum and cyclic guanosine monophosphodiesterase.
Materials and methods. Activity of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum and cyclic guanosine monophosphodiesterase has been evaluated.
Results. It has been shown that at studied concentration (0.1 mM; 0.01 and 1 mM), CHA I—VI separate hydrolytic and transporting functions of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Therefore, the antimetastatic effect of these compounds is assumed. Thus, at concentration of 0.1 mM, CHA inhibit active transport of calcium through the sarcoplasmic reticulum membrane by 40 ± 4 % (CHA-I), 50 ± 5% (CHA-II), 53 ± 5% (CHA-III), 70 ± 8% (CHA-V) and 75 ± 8% (CHA-VI) and inhibit hydrolysis of ATP by 20 ± 2%, 0 %, 0%, 45 ± 5% and 47 ± 3 % respectively. CHA-III, CHA-V and CHA-VI inhibit active transport of Ca2+ by 46 ± 5%, 47 ± 5% and 60 ± 6 %, and not inhibit or inhibit by 23 ± 2 % and 27 ± 3 % respectively, hydrolysis of ATP at concentration of 0.01 mM. CHA-V inhibits reversibly and non-competitively the hydrolytic function of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum with K = 4 x 10-5 M. All studied CHA inhibit activity of cyclic guanosine monophosphodiesterase at concentration of 0.1 mM, by less than 20 %. Conclusion. The data obtained predicts the antimetastatic activity of compounds CHA-II, CHA-III, CHA-V, CHA-VI. We recommend to study of CHA-II, CHA-III, CHA-V, CHA-VI on animal models as promising antimetastatic drugs.
Key words: Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum, cyclic guanosine monophosphodiesterase, cyclic hydroxamic acids
Введение
Гидроксамовые кислоты (RCONHOH) обладают широким спектром биологической активности [1]. Они тормозят рост экспериментальных опухолей [2], ингибируют металлоферменты [3], гистондеацетила-зу [4], вовлечены в различные процессы опухолевой трансформации клеток. Ранее нами было показано, что антиметастатическое действие ряда химических соединений связано с ингибированием транспортной функции фермента Са2+-АТФазы СР, т. е. с нарушением баланса внутри- и внеклеточного содержания ионов Са2+ [5—9], что приводит к уменьшению адгезии метастази-рующих клеток к эндотелию капилляров [10].
Известно, что торможение фосфодиэстеразы (ФДЭ) циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) приводит к накоплению цГМФ, который является вторичным мессенжером, влияющим на вазодилата-торный, антигипертензивный и антиагрегационный эффекты в живых организмах [11].
Целью настоящего исследования является изучение действия циклических гидроксамовых кислот (ЦГК) I—VI на функцию ферментов Са2+-АТФазы саркоплазаматического ретикулума (Са2+-АТФазы СР) и ФДЭ цГМФ.
Материалы и методы
В работе использовали альбумин человека, ими-дазол, цГМФ, нуклеотидазу, аденозинтрифосфат (АТФ) (Sigma, Япония), гистидин, этилендиамин-тетрауксусную кислоту, трихлоруксусную кислоту, сахарозу, соли MgCl2, NaCl, KCl, CaCl2, оксалат натрия, молибдат аммония (MoNH4) («Реахим», Россия) после соответствующей дополнительной очистки. Фермент Са2+-АТФазу СР выделяли из белых мышц задних конечностей кроликов по методу [12], поскольку белые волокна отличаются высокой активностью фосфорилазы, альдолазы, пируваткиназы, лактатдегидрогеназы, глицерофосфатдегидрогеназы и Са2+-АТФазы СР.
Гидролитическую активность Са2+-АТФазы измеряли по методу [12]. Реакционная среда содержала 4 мМ MgCl2, 2,5 мМ имидазола, 100 мМ NaCl, 5 мМ оксалата натрия, 0,04 мг альбумина и 2 мМ АТФ, рН 7,2. Реакцию инициировали добавлением 0,1 мМ CaCl2. Активность Са2+-АТФазы определяли по изменению рН среды. В результате указанной реакции соотношение протонов и фосфат-ионов составляет 1:1. Гидролитическую активность Са2+-АТФазы рассчитывали из тангенса угла наклона касательной к начальному участку кривой, описывающей кинетику накопления фосфат-ионов в результате гидролиза АТФ. Об активном транспорте ионов Ca2+ судили по времени их полного поглощения везикулами СР, что приводит к прекращению реакции гидролиза АТФ. Изменение гидролитической и транспортной
функций Са2+-АТФазы под действием ЦГК изучали в зависимости от концентрации соединений.
Относительную активность фермента рассчитывали по формуле:
I = 100 (А0 - А) / А0,
где I — относительная активность; Ад — удельное содержание фосфат-ионов в контрольной пробе; А — удельное содержание фосфат-ионов в опытной пробе.
Фермент ФДЭ цГМФ выделяли из коры головного мозга крыс линии «Вистар» [13].
Активность ФДЭ цГМФ определяли спектроскопическим методом при X = 735 нм с использованием спектрофотометра «Specord M-40» (Carl Zeiss Jena, Германия) по количеству образовавшегося в процессе ферментативной реакции гуанозинмонофосфата (ГМФ), которое равно количеству фосфат-ионов, выделившихся из ГМФ при добавлении нуклеотидазы [13]. Соединения:
ЦГК-I (1-гидрокси-3- изопропил -7,7,9,9-тетра-метил-1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он),
ЦГК-II (1-гидрокси-3-изобутил-7,7,9,9-тетраме-тил-1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он),
ЦГК-III (1-гидрокси-3-бензил-7,7,9,9-тетраме-тил-1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он),
ЦГК-IV (1-гидрокси-3-изопропил-8-метил-1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он),
ЦГК-V (1-гидрокси-3-изобутил-8- метил -1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он)
ЦГК-VI (1-гидрокси-3-бензил-8-метил-1,4,8-триазаспиро [4.5] декан-2-он)
получены по методике, аналогичной таковой, упомянутой в работах [14, 15], по синтезу ЦГК на основе глицина (R = H) и DL-аланина (R = CH3). Структуры соединений ЦГК I—VI приведены на рис. 1.
Результаты и обсуждение
Действие соединений ЦГК I—VI на гидролитическую и транспортную функции фермента Ca2+-АТФазы СР исследовалось после 5 мин преинкуба-ции препарата с ферментом. Растворы соединений готовили непосредственно перед добавлением в реакционную среду.
Как видно в табл. 1, соединения ЦГК-I, ЦГК-II, ЦГК-III, ЦГК-IV, ЦГК-V, ЦГК-VI в 0,1 мМ концентрации на 40 ± 4; 50 ± 5; 53 ± 5; 0; 70 ± 7; 75 ± 7 % тормозят транспортную функцию Са2+-АТФазы СР и на 20 ± 2; 0; 0; 11± 1; 45 ± 5 и 77 ± 5 % ингибируют гидролиз АТФ соответственно. Они преимущественно тормозят активный транспорт ионов Са2+ через мембрану СР, разобщая гидролитическую и транспортную функции фермента.
Теоретическое соотношение [Са2+]/ [АТФ] (удельной скорости транспорта Са2+ и удельной скорости
Оригинальные статьи 25
R
N H
R = CH (CH3)2 (ЦГК-I) R = CH2CH(CH3)2 (ЦГК-II) R = CH2C6H5 (ЦГК-III)
6
CH
CH
л ■
5 8 NH
10 9 H
^CH CH
R
OH
R = CH (CH3)2 (ЦГК-IV) R = CH2CH(CH3)2 (ЦГК-V) R = CH2C6H5 (ЦГК-VI)
N—CH,
Рис. 1. Молекулярная структура циклическихгидроксамовыхкислот (ЦГК): а — ЦГКI—III; б — ЦГКIV—VI
гидролиза АТФ) равно 2, что соответствует переносу 2 ионов Са2+ через мембрану СР при гидролизе 1 молекулы АТФ. В наших экспериментах это соотношение в норме равно 1,45. Разобщение гидролитической и транспортной функций Са2+-АТФазы СР при действии исследуемых ЦГК показывает, что при гидролизе 1 молекулы АТФ в везикулы СР переносится меньшее количество ионов Са2+, чем в норме (табл. 1, 2). Возникающее при этом изменение соотношения вне- и внутриклеточных ионов Са2+, безусловно, вызывает нарушение агрегации тромбоцитов, их связи с метастазирующими клетками и в конечном итоге предотвращает агрегацию последних к стенкам сосудов [10]. Так, ранее на примере металлокомплек-сов Pt (IV), Pd (II) [6] и ЦГК на основе глицина и DL-аланина было показано, что существует четкая корреляция индекса ингибирования метастазов мела-номы В16 в опытах in vivo с коэффициентом транс-
мембранного переноса ионов Са2+ в везикулы СР [6, 7]. Поэтому можно полагать, что соединения ЦГК-1 (на основе БЬ-валина), ЦГК-11, ЦГК-Ш, ЦГК-У (на основе БЬ-лейцина) и ЦГК-У1 (на основе БЬ-фенилаланина) являются потенциальными препаратами антиметастатического действия.
Углубленное изучение одного из наиболее активных препаратов данного класса, ЦГК-У, показало, что ЦГК-У является обратимым ингибитором функции Са2+-АТФазы СР, так как гидролитическая и транспортная функции фермента после диализа в 100-кратном объеме инкубационной среды в течение 24 ч при 3 °С в значительной степени восстанавливаются (табл. 3).
Константу ингибирования (К) под влиянием ЦГК-У (рис. 2) рассчитывали, используя численные значения максимальных скоростей процесса гидролиза АТФ. Как видно из рис. 2, ЦГК-У неконкурентно тормозит гидролитическую функцию Са2+-АТФазы
Таблица 1. Влияние циклических гидроксамовых кислот на активность Са2+-АТФазы саркоплазаматическогоретикулума
Индекс кислоты Торможение активности Са2+-АТФазы СР ( % от контроля) в зависимости от концентрации кислоты в пробах, мМ
0,1 мМ 0,01 мМ 0,001 мМ
Активный транспорт Са2+ Гидролиз АТФ Активный транспорт Са2+ Гидролиз АТФ Активный транспорт Са2+ Гидролиз АТФ
ЦГК-I 40 ± 4* 20 ± 2 20 ± 2* 10 ± 1 0 0
ЦГК-II 50 ± 5* 0 29 ± 3* 0 11 ± 1 0
ЦГК-III 53 ± 5* 0 46 ± 5* 0 34 ± 3* 0
ЦГК-IV 0 11 ± 1 0 0 0 0
ЦГК-V 70 ± 8* 45 ± 5 47 ± 5* 23 ± 2 33 ± 3 20 ± 2
ЦГК-VI 75 ± 7* 47 ± 5 60 ± 6* 27 ± 3 38 ± 4* 25 ± 2
Примечание. Даны среднеквадратичные ошибки результатов (6—9 опытов). *р < 0,01 активного транспорта Са2+-АТФазы саркоплаз-матического ретикулума (СР) по сравнению с гидролизом аденозинтрифосфата (АТФ).
б
а
Таблица 2. Влияние циклических гидроксамовых кислот на соотношение [Са2+]/[АТФ]
Концентрация кислоты, мМ
Индекс кислоты 0,1 0,01 0,001 0,1 0,01 0,001 0,1 0,01 0,001
Гидролиз АТФ [К]/мг белка, мин Активный транспорт Ca2+ [Ca^/мг белка, мин Отношение [Са2+]/ [АТФ]
ЦГК-I 0,59 0,64 1,2 0,69 0,74 1,7 1,17 1,2 1,42
ЦГК-II 1,2 1,2 1,2 0,88 1,33 1,7 0,73 1,1 1,42
ЦГК-III 1,2 1,2 1,2 0,83 0,98 1,38 0,69 0,82 1,15
ЦГК-IV 1,2 1,25 1,2 1,8 1,74 1,7 1,5 1,4 1,42
ЦГК-V 1,78 1,5 1,3 0,69 1,0 1,23 0,4 0,66 0,95
ЦГК-VI 2,34 2,1 3,0 0,85 1,11 1,7 0,36 0,53 0,6
Примечание. Отношение [Са2+]/[АТФ] в контроле составляет 1,45, п = 6(число опытов с каждой кислотой).
Таблица 3. Влияние ЦГК-V на гидролитическую и транспортную функции Са2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума до и после диализа
Торможение активности Са2+-АТФазы СР (% от контроля)
Индекс кислоты До диализа После диализа
Активный транспорт Са2+ Гидролиз АТФ Активный транспорт Са2+ Гидролиз АТФ
ЦГК-V 75 ± 8* 45 ± 5* 15 ± 3* 0
Примечание. В диализуемые пробы добавляем 0,1 мМ ЦГК-V. Приведены процентные значения 4 опытов по торможению активности Са2+-АТФазы СР с препаратом ЦГК-V (М ± т) %. *р < 0,01 по сравнению с контролем (не содержащим проб кислот).
Ю-3 М АТФ
Рис. 2. Зависимость скорости гидролиза АТФ Са2+-АТФазой саркоплазматического ретикулума от различных концентраций субстрата (1,0; 0,8; 0,6; 0,4 мМ) в координатах Лайнуивера — Берка: 1 — без ЦГК-V; 2 — с ЦГК-V в концентрации 0,1 мМ
Оригинальные статьи
27
СР с К = 0,04 мМ. Это свидетельствует о том, что ЦГК-V не связывается с активным центром фермента [16].
Как показали исследования, все изученные нами ЦГК (I—VI) менее чем на 26 ± 2 % тормозят гидролитическую функцию фермента ФДЭ цГМФ (табл. 4). Этот результат предполагает отсутствие их антиагрегационного, вазодилататорного и анти-гипертензивного действия [11].
Заключение
Полученные данные по влиянию ЦГК I—VI на функцию Са2+-АТФазы СР позволяют прогнозировать антиметастатическую активность ЦГК-II, ЦГК-III, ЦГК-V, ЦГК-VI и рекомендовать их для углубленного изучения на животных в качестве перспективных лекарственных препаратов антиметастатического действия. Полученные данные также показали, что изученные ЦГК слабо влияют на функцию ФДЭ цГМФ и не могут рассматриваться в качестве препаратов антиагрегационного, антигипертензивного и ва-зодилататорного действия.
Работа частично финансирована РФФИ (проект № 13-03-01142).
Таблица 4. Влияние циклических гидроксамовых кислот на активность фосфодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата
Индекс кислоты Торможение активности ФДЭ цГМФ (% от контроля)
Концентрация кислоты, М
0,1 0,01 0,001
ЦГК-I 26 ± 3* 14 ± 2* 0
ЦГК-II 15 ± 2* 8 ± 1 0
ЦГК-III 8 ± 1 5 ± 0,5 0
ЦГК-IV 15 ± 2* 14 ± 1* 0
ЦГК-V 19 ± 2* 16 ± 2* 13 ± 1
ЦГК-VI 16 ± 2* 14 ± 1* 8 ± 1
Примечание. Приведены процентные значения 6 опытов по торможению активности фосфодиэстеразы (ФДЭ) циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) с каждой кислотой (M ± m) %. *р < 0,01 по сравнению с контролем, не содержащим проб кислот. В качестве контроля принимали 100 % активность фермента без добавления изучаемой кислоты.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Marmion C.J., Griffith D., Nolan K.B. Hydroxamic acids — an intriguing family
of enzyme inhibitors and biomedical ligands. Eur J Inorg Chem 2004:3003-16.
2. Eyporlu I.Y., Hahnen Y., Buslei R. et al. Suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) has potent anti-glioma properties in vitro, ex vivo and in vivo. J Neurochem 2005;93(4):992-9. DOI: 10.1111/|.1471-4159.2005.03098.х. PMID: 15857402.
3. Whittaker M., Floyd C.D., Brown P., Gearing A.J. Design and therapeutic application of matrix metalloproteinase inhibitors. Chem Rev 1999;99:2735-76.
4. Miller T.A., Witter D.J., Belvedere S.J. Histone deacetylase inhibitors. J Med Chem 2003;46(24):5097-5116. DOI: 10.1021/jm0303094. PMID: 14613312.
5. Коновалова Н.П., Татьяненко Л. В., Волкова Л.М. и др. Ингибирующий эффект радиосенсибилизатора АК-2123
на экспериментальные метастазы в печени и активный транспорт ионов кальция. Вопросы онкологии 1997;43(3):305-12.
6. Татьяненко Л. В., Коновалова Н.П., Богданов Г.Н. и др. Торможение активного транспорта ионов кальция металло-комплексами Pt(IV) Pd(II). Корреляция этого процесса с антиметастатическим действием препаратов. Журнал биомедицинской химии 2006;52(2):155-169.
7. Татьяненко Л. В., Доброхотова О. В., Коновалова Н.П. и др. Влияние циклических гидроксамовых кислот на основе глицина и DL-аланина на активность гидролаз Са2+-Мg2+-АТФазы саркоплазматического ретикулума и фосфодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата. Химико-фармацевтический журнал 2013;47(5):135-7.
8. Konovalova N.P., Volkova L.M., Tatyanenko L.V. et al. Inhibitory effect of ra-diosensitizen AK-2123 on experimental hepatic metastases and Ca2+-active transport. Neoplasma 1997;44(6):361-5. PMID: 9605008.
9. Konovalova N.P., Volkova L.M., Tatyanenko L.V. et al. Comparative inhibitory effect of radiosensitive AK-2123 and 5-Fu on experimental hepatic metastases sensitization. News letter 1997;4(2):3-6.
10. Fidler J. Critical factor in the biology of human cancer metastasis: twenty-eight G.H. Aclowes memorial awara lecture. Cancer Res 1990;50(19):6130-8. PMID: 1698118.
11. Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарств. М., 2004. C. 360-365.
12. Ритов В.Б., Мельгунов В.М., Комаров П. Г. Интегральные белки мембран саркоплазматического ретикулума ске-
летных мышц кролика и карпа. Доклады АН СССР 1977;233(4):730-3.
13. Татьяненко Л. В., Доброхотова О. В., Богданов Г.Н. и др. Действие амитрипти-лина, имипромина и хлорпромазина на активность фосфодиэстеразы циклического гуанозинмонофосфата. Химико-фармацевтический журнал 2008;52(2):174-9.
14. Выстороп И.В., Коновалова Н.П., Нелюбина Ю.В. и др. Циклические гидроксамовые кислоты на основе альфа-аминокислот. Сообщение 1. Региоселек-тивный синтез, структура, NO-донорная и антиметастатическая активность спиробициклических гидроксамовых кислот на основе глицина и DL-аланина. Известия АН, серия химическая 2010;1:127-34.
15. Выстороп И.В., Коновалова Н.П., Нелюбина Ю.В. и др. Циклические гидроксамовые кислоты на основе альфа-аминокислот. Сообщение 2. Региоселек-тивный синтез, кристаллическая структура и противоопухолевая активность спиропиперидин-имидазолидин-гидроксамовых кислот на основе глицина и DL-аланина. Известия АН, серия химическая 2013;5:1272-81.
16. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. М., 1973. C. 77-84.
