CC BY
26
УДК 619:579
ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ НА АНТИЛАКТОФЕРРИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова О.Л.
Оренбургский государственный аграрный университет
Ключевые слова: микроорганизм, млекопитающие, тромбоциты,
кровь.
Key words: microorganisms, mammals, platelets, blood.
Одним из факторов естественной резистентности организма млекопитающих является железосвязывающий белок - лактоферрин, выполняющий ряд важных гомеостатических функций: абсорбция железа в желудочно-кишечном тракте новорожденных и взрослых, регуляция гемопоэза, стимуляция фагоцитоза, активизация системы комплемента [5]. Лактоферрин оказывает антимикробное действие в отношении широкого круга бактерий, грибов, вирусов и простейших [7]. Однако, в настоящее время известно, что микроорганизмы способны подавлять многие факторы естественной резистентности организма хозяина, в том числе и лактоферрин, что обеспечивает длительное переживание инфекционного агента в макроорганизме [1]. Поэтому изыскание биологически активных веществ, ингибирующих персистентный потенциал патогенных и условно-патогенных микроорганизмов является актуальным.
Одним из компонентов системы врождённого иммунитета организма, без которого невозможно выживание в среде, изобилующей потенциально патогенными микроорганизмами, являются противомикробные пептиды [2]. Среди них особое место занимают низкомолекулярные белки с выраженными катионными свойствами, в том числе тромбоцитарный катионный белок (ТКБ). Обладая антимикробной активностью, эти соединения характеризуются относительно низкой токсичностью по отношению к собственным клеткам макроорганизма, что позволяет их рассматривать в будущем в качестве дополнения и замены конвенциальным антибиотикам микробного происхождения [6]. Однако до настоящего времени малоизученным остаётся вопрос о влиянии тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на персистентные свойства бактерий. Решение данного вопроса, на наш взгляд, позволило бы выявить новые механизмы регуляции персистентых свойств бактерий в системе «паразит-хозяин».
В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение влияния тромбодефенсинов некоторых видов животных на антилактоферриновую активность (АЛфА) микроорганизмов.
Материалы и методы. Тромбоциты получали из цитратной крови клинически здоровых кур-несушек, лошадей и крупного рогатого скота. Обогащенную тромбоцитами плазму отделяли центрифугированием при 250 g в течение 30 минут. Супернатант снова центрифугировали при 1000 g 30 минут. Осаждённые тромбоциты отмывали трижды средой 199 (с добавлением 3,8% цитрата натрия в соотношении 1:10). Тромбоцитарную массу ресуспендировали в 10%-ной уксусной кислоте в соотношении 1:10 и выдерживали при -150С в течение 24 часов. После дефростации полученный экстракт центрифугировали при 1000 g в течение 40 минут. Супернатант, содержащий кислоторастворимые белки тромбоцитов, использовали для изучения влияния на АЛфА бактерий.
Эффект воздействия различных концентраций ТКБ на антилактоферриновую активность определяли на музейных культурах: Escherichia coli К12, Candida albicans. Изучение регуляции фактора персистенции тромбодефенсинами осуществляли в два этапа. На первом этапе проводили выделение клонов путём рассева суточной культуры на плотную питательную среду и выбирали клон с наиболее высоким уровнем АЛфА. На втором этапе проводили изучение влияния разведений ТКБ на АЛфА микроорганизмов путём соинкубирования. Для определения АЛфА использовали иммуноферментный анализ, признак выражали в нг/мл [4]. Статистическую обработку полученного материала проводили общепринятыми методами, с использованием критерия Стьюдента [3].
Результаты исследований. При анализе полученных результатов была выявлена высокая исходная гетерогенность популяции Escherichia coli К12 и Candida albicans по АЛфА, с разбросом значений для E. coli от 124,4 до 277,5 нг/мл и для C. albicans от 60 до 269,1 нг/мл, при среднем уровне признака 181±13,75 нг/мл и 177,9±21,59, соответственно.
Изучение влияния препаратов ТКБ на АЛфА E. coli показало снижение способности к инактивации лактоферрина у изученных микроорганизмов (рис. 1).
Максимальное подавление признака выявлено при культивировании бактерий с тромбоцитарным катионным белком лошади и крупного рогатого скота в разведении 1/8, при этом АЛфА составила 32,4±11,56 и 37,3±18,72 нг/мл, соответственно, против 111,3±5,58 нг/мл в контроле (р<0,01). Культивирование E. coli в присутствии ТКБ птицы в разведении 1/8 сопровождалось достоверным снижением АЛфА в 2,08 раза по сравнению с контролем (р<0,05).
Контроль ТКБ лошади ТКБ птицы ТКБ к.р.с.
□ 1 к 8 ■ 1 к 32
Разведение ТКБ
1. Изменение АЛфА E. coli под воздействием разведений кислотного экстракта из тромбоцитов
В меньшей степени рассматриваемый признак изменялся при культивировании бактерий с ТКБ сельскохозяйственных животных в разведении 1/32. АЛфА E. coli после культивирования с ТКБ лошади в разведении 1/32 снижалась на 55,3% (р<0,05); птицы - на 31,2% (р<0,05); крупного рогатого скота - на 44,0% (р<0,01).
Своеобразно изменялась антилактоферриновая активность C. albicans под влиянием испытуемых разведений препаратов из тромбоцитов животных. Кислотный экстракт тромбоцитов сельскохозяйственных животных оказывал преимущественно ингибирующее влияние на АЛфА грибов C. albicans. Однако в 33,3% случаев отмечено увеличение рассматриваемого показателя.
Изменения значений антилактоферриновой активности C. albicans были в пределах ошибки средней арифметической, а поэтому различия между величинами оказались недостоверными.
Заключение. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о модифицирующем влиянии тромбодефенсинов на антилактоферриновую активность микроорганизмов. Статистически значимое снижение уровня изучаемого признака у E. coli под действием ТКБ выявлено в 100% случаев. В 66,7% случаев ТКБ сельскохозяйственных животных ингибировал способность C. albicans инактивировать лактоферрин.
В дальнейшем планируется получение чистого препарата, поскольку по прогнозам аналитиков антимикробные пептиды эндогенного происхождения в 21 веке займут подавляющий сегмент мирового рынка антимикробных препаратов. Терапия, основанная на применении тромбодефенсинов, является привлекательной альтернативой антибиотикотерапии ещё и потому, что установлено ингибирующее
влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов на АЛфА микроорганизмов, определяющую выживание патогена в организме.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Бухарин, О. В. Персистенция патогенных бактерий / О. В. Бухарин // М.: Медицина; Екатеринбург: УрО РАН. -1999. - 370 с. 2. Кокряков, В.Н. Очерки о врождённом иммунитете / В.Н. Кокряков. - СПб.: Наука, 2006. - 261 с. 3. Лакин, Г. Ф. Биометрия / Г. Ф. Лакин // М.: Высшая школа, 1990. - 288 с. 4. Новый метод определения антилактоферриновой активности микроорганизмов / И. В. Валышева, А. В. Валышев, О. Л. Карташова и др.// Журн. микробиол. - 2003. - № 4. - С. 64-67. 5. Brock, J. Lactoferrin: a multifunctional immunoregulatory protein? / J. Brock // Immunol. Today. - 1995. - №16(9). - Р. 417-419. 6. Jenssen, H. Peptide antimicrobial agents / H. Jenssen, P. Hamill, R.E.W. Hancock // Clinical Microbiology Reviews. - 2006. - Vol. 19, No 3. - P. 491-511. 7. Levay, P.F. Lactoferrin: a general review / P.F. Levay, M.Viljoen // Haematologica. -1995. - №80(3). - Р. 252-267.
ВЛИЯНИЕ ТРОМБОДЕФЕНСИНОВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ НА
АНТИЛАКТОФЕРРИНОВУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова О.Л.
Резюме
В работе приведены результаты исследований влияния тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на
антилактоферриновую активность микроорганизмов. Выявлено снижение персистентных свойств E. coli и C. albicans под действием антимикробных пептидов из тромбоцитов животных.
SOME ANIMAL SPECIES TROMBODEFENSINES INFLUENCE ON ANTILACTOFERRINE ACTIVITY OF MICROORGANISMS
Sychyeva M.V., Sheida Ye.V., Kartashova O.L Summary
In the work are presented results of researches of influence agricultural animals thrombodefensins on the antilactoferrin activity of microorganisms. The decrease of persistence properties E. coli and C. albicans are descoved under the influence of the antimicrobial peptides from thrombocytes of animals.
