CC BY
29
Влияние тромбодефенсинов на чувствительность микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл
М.В. Сычёва, к.б.н., Л.Ф. Галиуллина, аспирантка,
О.Л. Карташова, дб.н, профессор, Оренбургский ГАУ
В последние годы отмечаются значительные темпы роста бактериальных инфекций. Расширение спектра возбудителей, многообразие их свойств, рост антибиотикорезистентных штаммов диктуют необходимость поиска новых подходов к лечению бактериальных инфекций [1]. Важным арсеналом совершенствования терапевтических подходов является разработка нового поколения препаратов на основе антимикробных пептидов, среди которых на сегодняшний день особое внимание уделяется низкомолекулярным катионным белкам из тромбоцитов, или тромбо-дефенсинам (ТД) [7]. Результаты исследований последних лет свидетельствуют о способности ТД изменять персистентные характеристики микроорганизмов, влиять на биоплёнкообра-зование [2, 3]. Установлен противомикробный эффект тромбоцитарного катионного белка (ТКБ). Необходимо отметить, что немаловажным является вопрос о влиянии тромбодефенсинов на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам представителей нормальной микрофлоры.
Как известно, одним из представителей резидентной микрофлоры, характеризующихся высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, являются бактерии рода Lactobacillus. Лактобациллы обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их широкое использование в производстве пробиотиков [4]. Изучение влияния тромбоцитарного катионного белка на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам микроорганизмов — представителям нормофлоры, на наш взгляд, позволит по-новому подойти к решению вопроса лечения инфекционных заболеваний и коррекции дисбиозов.
Вышеизложенное предопределило цель настоящего исследования — изучить влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл.
Материалы и методы. Кислоторастворимые белки тромбоцитов крупного рогатого скота, лошади и кур получали методом кислотной экстрак-
ции. Содержание белка в кислотных экстрактах определяли по методу М.М. Брэдфорда (1976) с использованием красителя Coomassie Brilliant Blue G-250 (SIGMA, Германия) [8]. В опыт подобрали антагонистически активные штаммы рода Lactobacillus (L 364 и L 370), выделенные из репродуктивного тракта, и клоны условнопатогенных микроорганизмов (Staphylococcus aureus, Candida albicans). Суточные культуры условно-патогенных микроорганизмов соинку-бировали с тромбодефенсинами в минимальной подавляющей концентрации (МПК) и 1/4 МПК, установленных нами ранее, в течение одного часа при 37 °С. Чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам лактобацилл определяли с помощью чашечного метода (принципа отсроченного антагонизма) [5]. Степень чувствительности к антагонистическим факторам лактобацилл условно-патогенных микроорганизмов выражали с помощью коэффициента, который рассчитывали как отношение диаметра зоны задержки роста условно-патогенного микроорганизма к диаметру зоны роста культуры лактобацилл.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента [6].
Результаты исследований. В результате проведённых исследований было установлено, что антимикробные пептиды из тромбоцитов сельскохозяйственных животных усиливали чувствительность S. aureus и C. albicans к антагонистически активным веществам бактерий рода Lactobacillus.
Максимальное увеличение чувствительности клонов S. aureus к антагонистическим факторам штамма L 370 отмечено после соинкубирования с тромбодефенсинами крупного рогатого скота в МПК, при этом коэффициент антагонистической активности увеличился в 3,3 раза (15,2+6,51 против 4,6+1,43 в контроле; рис.).
Коэффициенты антагонистической активности для штамма L 364 в отношении S. aureus после соинкубирования с тромбодефенсинами крупного рогатого скота в МПК и 1/4 МПК составили, соответственно, 4,8+1,02 и 8,4 +2,31 против 3,72 + 0,58 в контроле, а для штамма L 370 в 1/4 МПК - 7,6+3,8 против 4,6+1,43 в контроле. При воздействии другими препаратами тромбоцитарного катионного белка на S. aureus также регистрировали выраженное изменение признака. Так, у клонов S. aureus при соинку-бировании с ТКБ птицы в 1/4 МПК отмечено
= s ^
Ш
■e-i E
ra
т
н
а
t u • X ф :
« т
J S , S I- . -0-“ і
■6-1 і rn о
контроль
куры
контроль
Рис.
лошадь КРС
L 364
Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл
мпк
лошадь
L 37G
мпк
КРС
мпк
куры
Влияние тромбодефенсинов сельскохозяйственных животных на чувствительность C. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл
Коэффициент антагонистической активности лактобацилл
Тромбодефенсины Контроль L 364 L370
5,5±1,20 6,6±1,53
Лошадь МПК 1/4 МПК 8,4±170 11,7±2,04* 7,8±1,40 12,7±2,22*
Крупный рогатый скот МПК 1/4 МПК 7,5±1,19 12,1±1,65** 5,4±0,63 8,6±1,20
Куры МПК 1/4 МПК 12,8±1,27** 14,0±2,76* 14,9±1,74** 9,8±2,84
Примечание: * — достоверность различий коэффициента антагонистической активности в контроле и после со-инкубирования с кислотным экстрактом тромбоцитов (р<0,05); ** — р<0,01.
увеличение чувствительности к антагонистически активным веществам L 370 в 1,9 раза, а при соинкубировании с кислотным экстрактом из тромбоцитов лошади в той же концентрации изучаемый показатель увеличивался в 2,6 раза. Также у клонов S. aureus было установлено значительное изменение чувствительности к антагонистическим факторам L 364 при соинкубировании с ТКБ птицы в МПК, с увеличением коэффициента антагонистической активности в 2,2 раза. Изменения значений чувствительности клонов S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл были в пределах ошибки средней арифметической, а поэтому различия между величинами оказались недостоверными.
Следует отметить, что тромбодефенсины крупного рогатого скота по сравнению с антимикробными пептидами из тромбоцитов лошади и кур в наибольшей степени увеличивали чувствительность клонов S. aureus к антагонистически активным веществам лактобацилл.
При изучении влияния тромбодефенсинов лошади в МПК на чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл было установлено увеличение изучаемого показателя в среднем на 35,45% (табл.).
В меньшей степени изменялась чувствительность С. albicans к антагонистически активным веществам лактобацилл под действием кислотного экстракта из тромбоцитов крупного
рогатого скота. В среднем изучаемый показатель увеличивался на 18,2% после соинкубирования с тромбодефенсинами в МПК. Более существенное изменение рассматриваемого параметра было отмечено при соинкубировании С. albicans с ТД в 1/4 МПК. Коэффициент антагонистической активности для Lactobacillus 364 составил 12,1+1,65 против 5,5+1,20 в контроле (р<0,01), для Lactobacillus 370 — 8,6+1,20 против 6,6+1,35 в контроле.
Максимальное изменение признака наблюдали при воздействии на микроорганизмы тромбо-дефенсинами кур. Так, под влиянием ТКБ кур в МПК отмечалось увеличение коэффициента антагонистической активности лактобацилл L 364 и L 370 в отношении С. albicans в 2,3 раза. Разница значений по сравнению с контролем в обоих случаях достоверна (р<0,01). Коэффициент антагонистической активности L 364 и L 370 в отношении С. albicans после соинкубирования с кислотным экстрактом из тромбоцитов птицы в 1/4 МПК возрастал по сравнению с контролем в 2,5 (р<0,05) и 1,5 раза соответственно.
Заключение. Таким образом, тромбодефенси-ны сельскохозяйственных животных оказывают стимулирующее влияние на чувствительность условно-патогенных микроорганизмов к антагонистически активным веществам бактерий рода Lactobacillus. Максимальный стимулирующий эффект отмечен в отношении чувствительности S. aureus к антагонистическим факторам лакто-
бацилл L 364 под воздействием тромбоцитарного катионного белка крупного рогатого скота. Однако наиболее выраженным стимулирующим действием на чувствительность С. albicans к факторам межмикробного взаимодействия лактобацилл обладает кислотный экстракт из тромбоцитов птицы.
Известно, что большинство антимикробных пептидов эндогенного происхождения, в том числе и тромбодефенсины, являются мембраноактивными агентами [9]. Полученные нами данные позволяют предположить, что соинкуби-рование с ТД приводит к изменению структуры и функции цитоплазматических мембран, что способствует проникновению в микробную клетку антибиотических веществ, обусловливающих антагонистическую активность лактобацилл в отношении условно-патогенных микроорганизмов.
Литература
1. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Рациональная антимикробная фармакотерапия. М.: Мир, 2008. 1001 с.
2. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова O.JI. и др. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов сельскохозяйственных животных на способность микроорганизмов к образованию биоплёнок // Известия КрасГАУ. 2011. № 1. С, 130-132.
3. Сычёва М.В., Шейда Е.В., Карташова O.JI. Влияние тромбодефенсинов некоторых видов животных на анти-лактоферриновую активность микроорганизмов // Учёные записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. Казань. 2010. С. 256—259.
4. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. К механизму антагонистической активности лактобацилл // Журнал микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. 1989. № 5. С. 3-7.
5. КудлайД.Г.,ЛиходедВ.Г. Бактериоциногения. М.: Медицина, 1966. 203 с.
6. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 288 с.
7. Tang Y.Q. Antimicrobial peptides from human platelets / Q.Y. Tang, M.R. Yeaman, M.E. Selsted // Infection and Immunity. 2002. Vol. 70. № 12. P. 6524-6533.
8. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochev. 1976. Vol. 72. P. 248-254.
9. Matsuzaki K. Molecular basis for membrane selectivity of an antimicrobial peptide, magainin 2 / K. Matsuzaki, K. Sugishita, N. Fujii // Biochemistry. 1995. Vol. 34. No 10. P. 3423-3429.
