CC BY
62
УДК 630.28:547.464
ВЛИЯНИЕ ТЕРМИЧЕСКОЙ ОБРАБОТКИ НА СОСТАВ ЛЕТУЧИХ КОМПОНЕНТОВ БЕЛЫХ ГРИБОВ (BOLETUS EDULIS)
© Т.А. Мишарина1, С.М. Мухутдинова2, Г.Г. Жарикова2, М.Б. Теренина1, Н.И. Крикунова1
1 Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, ул. Косыгина, 4,
Москва, 119334 (Россия) E-mail: [email protected] 2Российская экономическая академия им. Г. В. Плеханова, Стремянный переулок, 36, Москва, 115998, (Россия) E-mail: [email protected]
Методами капиллярной газовой хроматографии и хромато-масс-спектрометрии изучен состав компонентов запаха вареных и консервированных белых грибов (Boletus edulis). Найдено, что ненасыщенные спирты и кетоны с числом атомов углерода 8 определяли аромат сырых грибов и участвовали в формировании аромата вареных грибов. Содержание этих соединений, а также соотношение спиртов и кетонов зависело от длительности термической обработки грибов. Летучие алифатические и гетероциклические продукты реакции Майара в совокупности с изомерными октенолами и октенонами формировали аромат вареных и консервированных белых грибов.
Ключевые слова: белые грибы (Boletus edulis), термообработка, летучие соединения, капиллярная газожидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия.
Введение
Аромат пищевых продуктов формируют летучие органические соединения, которые присутствуют в исходных ингредиентах, а также образуются в результате различных химических реакций, происходящих при технологической обработке продуктов. Самым вкусным из дикорастущих в России грибов является белый гриб (Boletus edulis). Вареные и тем более сушеные белые грибы отличаются необыкновенно приятным и сильным ароматом и вкусом, поэтому считаются деликатесным продуктом. В результате исследований в различных видах грибов найдено около 150 летучих веществ, принадлежащих к различным классам органических соединений [1-4]. Основными соединениями, формирующими аромат сырых грибов, являются алифатические спирты и кетоны с числом атомов углерода 8: 1-октен-3-ол, 2-октен-1-ол, 3-октанол, 1-октанол, 1-октен-3-он и 3-октанон [1, 3, 5]. Качественный и количественный состав летучих веществ существенно зависит от вида грибов, от условий их культивирования и даже от части грибов [1, 3, 6, 7]. Так, например, содержание летучих веществ в шляпках грибов (Tricholoma matsutake Sing.) больше, чем в ножках [8], в геминофоре шампиньона Agaricus campestris и белых грибов Boletus edulis найдено больше летучих веществ, чем в шляпке [1].
При варке, жарке, консервировании или сушке состав летучих веществ изменяется, поэтому аромат приготовленных грибов отличается от аромата сырых. Содержание некоторых веществ уменьшается, и синтезируются новые соединения, состав и концентрация которых зависит от способа и условий обработки грибов [3, 9].
Цель работы - изучить влияние условий термической обработки на состав летучих соединений в белых грибах (B. edulis).
Экспериментальная часть
Характеристика образцов. Белые грибы (Boletus edulis) собраны в лесу (Тверская область) в августе 2007 г. Для исследования отобрали близкие по размеру грибы с диаметром шляпки 6-10 см и длиной ножки 6-8 см. Грибы хранились в течение 1 суток при 5 °С.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Консервирование грибов. Измельченные белые грибы нагрели на водяной бане при перемешивании до выделения сока, добавили 1,0% хлористого натрия, поместили в стеклянные банки, герметично укупорили и автоклавировали в течение 1 ч при температуре 110 °С. После охлаждения грибы хранили в течение 14 сут. при температуре 5-7 °С.
Выделение и концентрирование летучих веществ. Для определения качественного и количественного состава летучих компонентов 250 г измельченных грибов поместили в колбы, добавили 750 мл дистиллированной воды и 1,0 мг (400 мкг на 100 г грибов) н-додекана в качестве внутреннего стандарта. Летучие компоненты извлекали в течение 1,5 ч (вареные и консервированные) и 2,5 ч (вареные) с 20 мл свежеперегнанного диэти-лового эфира методом непрерывной дистилляции-экстракции. Экстракты высушили с 2 г безводного сульфата натрия и сконцентрировали до объема 0,1 мл отгонкой эфира при 40 °С с колонкой Вигре длиной 35 см. Полученные эфирные экстракты анализировали методом газожидкостной хроматографии.
Газохроматографический анализ (ГХ). Для проведения газохроматографических исследований использовали капиллярный газовый хроматограф Кристалл 2000М (Россия) с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB-1 (50 м х 0,32 мм, слой фазы 0,25 мкм). Анализ эфирных экстрактов проводили при программировании температуры колонки в следующем режиме: изотерма 60 °С в течение 5 мин, затем программирование температуры до 250 °С со скоростью 8 °С /мин и в течение 10 мин изотермический режим при этой температуре. Температура инжектора и детектора составляла 250 °С. Скорость газа-носителя гелия через колонку составляла 1,5 мл/мин. Анализировали по 2 мкл эфирных экстрактов. Хроматограммы регистрировали с помощью системы сбора и обработки хроматографических данных Экохром (Гос.регистрация №16616-97, Россия). В аликвоту концентратов летучих веществ добавили 1 мкл смеси н-алканов с числом атомов углерода 6-22 и проанализировали в тех же условиях. По временам удерживания компонентов анализируемых смесей и нормальных алканов рассчитали величины индексов удерживания (ИУ). Из площадей пиков веществ и площади пика внутреннего стандарта на хроматограммах образцов методом простой нормировки рассчитали относительное содержание каждого компонента в изученных образцах и выразили их в мкг на 100 г грибов.
Для определения качества запаха хроматографических зон элюата использовали методику сниффинг-анализа. К концу хроматографической колонки присоединили делитель потока, с помощью которого половина элюата направлялась в детектор, вторая половина через обогреваемый капилляр подавалась для оценки качества запаха соответствующих отдельных компонентов. Такой анализ эфирных экстрактов грибов проводили на капиллярном газовом хроматографе НР 5730А (Хьюлетт Паккард, США) с пламенноионизационным детектором, кварцевой капиллярной колонкой НР-1 (50 м х 0,25 мм, слой фазы 0,3 мкм) при программировании температуры колонки от 60 до 250 °С со скоростью 8 °С /мин. Температура инжектора и детектора составляла 250 °С. В качестве газа-носителя использовали гелий, его скорость через колонку составляла 2 мл/мин. Описание запаха хроматографических зон проводили три тренированных дегустатора.
Хромато-масс-спектрометрический анализ (ГХ-МС). ГХ-МС анализ проводили на приборе НР 5890/5980 (Хьюлетт Паккард, США) с кварцевой капиллярной колонкой НР-1 (25 м х 0,30 мм, d(=0,25 мкм) при программировании температуры от 50 до 250 °С со скоростью 4 °/мин. Температура инжектора и масс-детектора составляла 250 °С. Скорость газа-носителя гелия через колонку - 1,2 мл/мин. Масс-спектры получали в режиме электронного удара при ионизирующем напряжении 70 еУ и скорости сканирования 1 сек на декаду масс в области 40-400 аем. Анализировали по 2 мкл эфирных экстрактов.
Идентификацию компонентов осуществляли путём сравнения величин индексов удерживания и масс-спектров, полученных при анализах образцов грибов, с индексами и спектрами стандартов, определенных нами на этой же колонке, а также взятых из литературных данных [10, 11] и из библиотек масс-спектров NBS и Wiley 275. Ряд веществ идентифицировали по величинам их индексов удерживания и качеству запаха, так как их концентрация была недостаточна для получения интерпретируемых масс-спектров и достоверной идентификации.
Результаты и их обсуждение
Идентифицированные летучие соединения и их содержание в грибах приведены в таблице. Концентраты летучих веществ, выделенных из грибов, содержали более 100 соединений в широком диапазоне концентраций - от 6,43 мг / 100 г до нескольких нанограмм / 100 г. По числу летучих веществ самый богатый состав имели грибы, варившиеся в течение 1,5 ч. В консервированных белых грибах количество летучих веществ было меньше, но концентрация многих соединений была больше, чем в свежих вареных грибах. В трех образцах грибов идентифицировали около 50 соединений, часть веществ, в основном с индексами удерживания (ИУ) больше 1300, осталась неидентифицированной. В зоне хроматограмм с величинами индексов удерживания 1300-2200 были найдены н-алканы от пентадекана до нонадекана и не обнаружено веществ с запахом пищевых продуктов.
Летучие соединения, найденные в свежих вареных и консервированных белых грибах
№ пика ИУ Соединение Описание запаха Концентрация, мкг /100 г
1,5 ч 2,5 ч Консерви- рованные
1 731 3-метилбутанол Запах не узнаваем 48 5 -
2 747 3-метилоксолан-3-он Слабый, едкий 6 - 25
3 774 Гексаналь* Свежей зелени 18 - 27
4 790 Метилпиразин * Слабый, затхлый 16 4 -
5 796 2-меркапто-3-бутанон* Луковый 95 75 -
6 810 Фурфурол Слабый, хлебный 10 3 11
7 817 Тиолан-3-он * Луковый с грибной нотой 40 5 48
8 821 2-гексеналь* Яблочный 8 - 4
9 852 Гексанол-1 * Луковый, мясной 2 - 150
10 869 2-гексен-1-ол Зелени 34 8 9
11 874 Этилизовалериат Слабый 10 - -
12 879 Метиональ* Картофельный 12 7 38
13 884 2,5-диметилпиразин, Ореховый 32 6 -
5-метилфурфурол
14 896 2,3-диметилпиразин Ореховый 18 8 -
15 898 Этилпиразин Жареный тон 10 12 4
16 931 Бензальдегид* Миндальный 152 24 12
17 952 Диметилтрисульфид Грибной, мясной 11 10 3
18 957 1-октен-3-он* Грибной, плесени 646 470 1090
19 962 1,5-октадиен-3-он* Сырых грибов 250 92 670
20 964 1-октен-3-ол* Сырых грибов 1940 16 6430
21 977 Октаналь* Приготовленные грибы 38 12 20
22 981 3-октанол* Вареные грибы 30 22 1203
23 1028 3-октанон* Грибной, маслянистый 164 28 22
24 1034 транс-3-октен-1-ол* Сырых грибов 146 36 216
25 1052 Октанол* Маслянистый 694 125 1604
26 1059 транс-2-октен-1 -ол * Грибной 98 573
27 1074 1 -октен-3-илацетат* Грибного супа 120 92 75
28 1086 Нонаналь* Запах не узнаваем 4 4 12
29 1089 Линалоол Запах не узнаваем - - 8
30 1114 Не идентифицировано Запах не узнаваем - - 23
31 1161 Алкилпиразин Пиразиновый - 14
32 1168 Нонанол* Запах не узнаваем 103 35 19
33 1181 Деканаль* Цитрусовый - - 77
34 1192 2,4-нонадиеналь * Жирный, зелени - - 54
35 1200 Додекан - вн. стандарт 400 400
36 1214 Не идентифицировано Запах не узнаваем 18 10 8
37 1221 2-деценаль* Слабый, зелени 22 38 4
38 1230 у-окталактон* Слабый, жирный 20 26 36
39 1267 н-деканол* Запах не узнаваем 62 66 16
40 1280 Ундеканаль* Слабый, цитрусовый 83 40 12
41 1294 2,4-декадиеналь* Слабый, прогорклый 8 - 10
Примечание: * - идентификация соединений подтверждена ГХ-МС анализом.
Оценка запаха хроматографических зон элюатов показала, что оба вида белых грибов содержали соединения с интенсивным и выраженным запахом сырых, вареных, жареных грибов, грибного супа. Такой запах обусловлен наличием в грибах группы ненасыщенных спиртов, кетонов и сложных эфиров с восемью атомами углерода, которые известны как ключевые одоранты в грибном аромате [1-4]. В зоне летучих веществ с индексами удерживания до 1300, выделенных из консервированных белых грибов, присутствовали все ароматообразующие соединения, в том числе ключевые, обладающие запахом грибов. Такие соединения найдены в области пиков № 7, 18-27, их структура установлена двумя методами - ГХ и ГХ-МС. Следует отметить, что в ряде случаев запах хроматографических зон не соответствовал запаху индивидуальных веществ, приведенных в таблице. Это обусловлено тем, что некоторые соединения элюировались вместе или рядом с основным веществом, дающем хроматографический пик, но их концентрация была намного меньше, чем концентрация основного соединения. Многие одоранты, особенно серо- или азотсодержащие соединения, включая алифатические серосодержащие соединения, меркаптофураны, полисульфиды, тиофены, алкилпи-разины, тиазолы, имеют крайне низкие пороговые концентрации запаха. Это приводит к тому, что при ничтожно ма-
лом содержании, часто меньшем, чем чувствительность инструментального определения, они могут вносить значительный и даже определяющий вклад в запах фракции элюата, изменяя его и добавляя новые оттенки. Кроме того, присутствие таких соединений приводит к размыванию границ запаха, несовпадению интенсивности запаха и пика соединения, появлению на фоне одного запаха других оттенков. Запах многих одорантов изменялся по мере их элюирования, т.е. при изменении их концентрации. Так, в области пика №9 найден только гексанол, имеющий мягкий, слегка жирный запах зелени. Однако запах этой зоны не соответствовал запаху гексанола. Появляющийся луковый запах быстро модифицировался, приобретая ноту приготовленного мяса. Такой аромат имеет 2-метил-З-меркаптофуран [12], его индекс удерживания на неполярной колонке составляет 849-852, т.е. по запаху и параметрам удерживания он мог элюироваться вместе с гексанолом и определять запах этой хроматографической зоны, но его концентрация была слишком мала для ГХ обнаружения. Предшественником этого соединения могли быть тиамин и цистеин, которые содержатся в грибах [13]. В зонах пиков №15-22 могли присутствовать дополнительно к найденным соединениям различные алкилпиразины, имеющие запах жареных продуктов. Совместное элюирование нескольких веществ сопровождалось появлением в этих зонах различных оттенков грибного запаха, хотя найденные соединения (например октаналь) не обладают таким запахом.
В таблице приведено относительное содержание найденных соединений, в том числе ключевых, имеющих грибной аромат: 1-октен-З-он, 1,5-октадиен-З-он, 1-октен-З-ол, З-октен-1-ол, 2-октен-1-ол, 3-октанон и 1-октен-З-илацетат. Основной из них - 1-октен-З-ол (№20, табл.), его содержание было максимальным в консервированных грибах и составляло б,43 мг / 100 г. В вареных грибах содержание 1-октен-З-ола было меньше - около 1,94 мг /100 г для вареных в течение 1,5 ч и только 0,01б мг / 100 г для вареных в течение 2,5 ч. В сырых белых грибах этот спирт был найден в количестве до 15,б0 мг / 100 г [3, 7]. Таким образом, длительная термическая обработка грибов приводила к значительной потере этого спирта. Консервирование грибов проводили в закрытой системе без доступа воздуха, вероятно, поэтому содержание 1-октен-З-ола было высоким в этом образце.
Интенсивным грибным ароматом обладали два других ненасыщенных спирта - З-октен-1-ол и 2-октен-1-ол (№24 и 2б, табл.), их содержание в грибах было меньше, чем 1-октен-З-ола. Условия термической обработки грибов влияли на содержание этих спиртов, так же как и на содержание 1-октен-З-ола. Оба спирта в большей концентрации присутствовали в консервированных грибах, длительная варка грибов приводила к уменьшению их концентрации. Аналогичное влияние условий термообработки установлено и для двух насыщенных спиртов 1-октанола и 3-октанол.
Грибным запахом обладали кетоны 1-октен-З-он и 3-октанон, найденные во всех грибах. Один из кетонов, а именно 1-октен-З-он, является самым главным ключевым соединением во многих грибах, так как имеет очень низкую пороговую концентрацию запаха, которая в воде составляет 0,004-0,01 млн долей [1, 3]. Аналогичная величина для 1-октен-З-ола равна около 0,1 млн долей, т.е. в 10-25 раз больше, но концентрация этого спирта в грибах больше только в 3-7 раз (табл.). Поэтому даже при меньшем содержании вклад кетона в формирование аромата грибов по сравнению со спиртами самый значительный. Увеличение содержания 1-октен-З-она было обнаружено при варке шампиньонов, его максимальное количество найдено после 30 мин варки [1, 3]. Предполагалось, что различия в запахе сырых и вареных шампиньонов обусловлены уменьшением при варке концентрации 1-октен-З-ола и увеличением 1-октен-З-она, который является продуктом окисления 1-октен-З-ола [3, 14]. Следует отметить, что в консервированных грибах соотношение спирта и кетона составляло 7 : 1, тогда как в вареных в течение 1,5 ч грибах это соотношение было 3 : 1, а при варке 2,5 ч содержание кетона было даже в 30 раз больше, чем спирта. Возможно, при длительной термообработке белых грибов, так же как и шампиньонов, происходило окисление 1-октен-З-ола, без доступа воздуха (консервирование) окислительные процессы протекали в меньшей степени. Следует отметить, что самый сильный аромат имели консервированные грибы, слабее - вареные 1,5 ч, и еще слабее - вареные в течение 2,5 ч.
Спирты, альдегиды и кетоны C8 в грибах образуются при окислении содержащихся в грибах линолевой и линоленовой кислот в присутствии ферментов липоксигеназы и гидропероксид лиазы [б, 15]. Кроме того, из этих и других ненасыщенных жирных кислот (в белых грибах доля ненасыщенных кислот около 25% от всех жирных кислот) в результате ферментативного окисления или автоокисления образуются спирты, альдегиды и кетоны с числом атомов углерода б, 7, 9, 10 и 11 [1б]. Некоторые из таких летучих соединений найдены в изученных грибах: гексаналь, 2-гексеналь, гексанол, 2-гексен-1-ол, нонаналь, нонанол, деканаль, 2,4-нонадиеналь, 2-деценаль, деканол, ундеканаль, 2,4-декадиеналь (табл.). Эти соединения, особенно ненасыщенные альдегиды, имеют низкие пороги запаха и являются ароматообразующими.
Важнейшим компонентом аромата приготовленных грибов являлся метиональ. Он способен изменять аромат сырых грибов, обусловленный наличием кетонов и спиртов С8, на аромат приготовленных грибов. Как правило, его содержание в грибах мало, но так как порог запаха его также мал (около 0,2 нг/ л), то вклад в общий аромат
значителен. Метиональ в грибах может образовываться при ферментативном расщеплении метионина [17], а также в ходе реакции Майара [12, 18]. Кроме метионаля, для аромата приготовленных грибов важны также другие продукты реакции Майара, найденные в грибах. Это алкилпиразины, меркаптобутанон, возможно также присутствие меркаптозамещенных фуранов и тиофенов, однако о них можно судить только по результатам органолептической оценки элюата. Вероятно, совместное присутствие этих летучих соединений, метионаля и ненасыщенных спиртов и кетонов, обусловливало аромат термически обработанных грибов.
Выводы
1. Найдено, что аромат вареных грибов формировали летучие соединения, образующиеся в результате ферментативного и окислительного расщепления ненасыщенных жирных кислот, а также в ходе серии каскадных реакций между аминокислотами и сахарами (реакция Майара).
2. Ненасыщенные спирты и кетоны с числом атомов углерода 8 определяли аромат сырых грибов и участвовали в формировании аромата вареных грибов. Содержание этих соединений было максимальным в консервированных белых грибах.
3. Установлено, что увеличение длительности термической обработки в присутствии воздуха приводило к уменьшению содержания ненасыщенных изомерных октенолов и октенонов, а также насыщенных октанолов.
Список литературы
1. Maga J. A. Mushroom flavor // J. Agric. Food Chem. 1981. У. 29. №1. P. 1-4.
2. Fischer K.-H., Grosch W. Volatile compounds of importance in the aroma of mushrooms (Psalliota bispora) // Le-bensm. Wiss. Technol. 1987. У. 20. №3. P. 233-236.
3. Maga J. A. Influence of maturity, storage and heating on the flavor of mushroom (Agaricus bisporus) caps and stems // J. Food Proc.and Preserv. 1981. У. 5. №1. P. 95-101.
4. Maarse H., Vijscher C.A. Volatile Compounds in Food. Qualitative and Quantitative Data . Zeist: TNO-CIVO // Food
Analysis Institute. 1997. У.1. P. 121.
5. Mau J.-L., Chyau C.-C., Li J.-Y., Tseng, Y.-H. Flavor compounds in straw mushrooms Volvariella volvacea harvested at different stages of maturity // J. Agric. Food Chem. 1997. V. 45. №12. P. 4726-4729.
6. Wu S., Zorn H., Krings U., Berger R.G. Characteristic volatile from young and aged fruit bodies of wild Polyporus sul-
furous // J. Agric. Food Chem. 2005. V. 53. №11. P. 4524-4528.
7. Zavirska-Wojtasiak R. Optical purity of (R)-(-)-1-octen-3-ol in the aroma of various species of edible mushrooms // Food Chem. 2004. V. 86. №1. P. 113-118.
8. Cho I.H., Choi H.-K., Kim Y.-S. Difference in the volatile composition of pine-mushrooms (Tricholoma matsutake
Sing.) according to their grades // J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. №13. P. 4820-4825.
9. Cho I.H., Kim S.Y., Choi H.-K., Kim Y.-S. Characterization of aroma-active compounds in raw and cooked pine-mushrooms (Tricholoma matsutake Sing.) // J. Agric. Food Chem. 2006. V. 54. №17. P. 6332-6335.
10. Jennings W., Shibamoto T. Qualitative Analysis of the Flavor and Fragrance Volatiles by Glass Capillary Gas Chromatography. New-York: Acad. Press. 1980. P. 59-85.
11. Davies N.M. Retention indices of monoterpenes and sesquiterpenes // J. Chromatogr. 1990. V. 503. №1. P. 1-24.
12. Мишарина Т.А., Витт С.В., Головня Р.В., Беликов В.М. Применение химической модификации для хроматомасс-спектрометрической идентификации изомерных тиофеновых и фурановых соединений // Журнал аналитической химии. 1986. Т. 41. №10. С. 1876-1880.
13. Esteve M.-J., Farre R., Frigola A., Garcia-Cantabella J.-M. Simultaneous Determination of Thiamin and Riboflavin in Mushrooms by Liquid Chromatography // J.Agric. Food Chem. 2001. V. 49. №3. P. 1450-1454.
14. Picardi S.M., Issenberg P. Volatile constituents of mushrooms (Agaricus bisporus). Changes which occur during heating // J.Agric. Food Chem. 1973. V. 21. №6. P. 959-961.
15. Grosh W. Determination of potent odorants in foods by aroma extract dilution analysis (AEDA) and calculation of odour activity values (OAVs) // Flavour Fragrance J. 1994. V. 9. №1. P. 147-158.
16. Мишарина Т.А., Теренина М.Б., Головня Р.В. Летучие карбонильные соединения и спирты - компоненты запаха гидробионтов. (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. №4. С. 371-381.
17. Ho I.H., Namgung H.-J., Choi H.-K., Kim Y.-S. Volatile and key odorants in the pileus and stipe of pine-mushroom (Tricholona matsutake Sing.) // Food Chem. 2008. V. 106. №1. P. 71-76.
18. Писарницкий А.Ф., Егоров И.А. Роль карбонил-аминной реакции в биологических системах и технологии пищевых производств (Обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 1989. Т. 25. №5. С. 579-594.
Поступило в редакцию 26 декабря 2007 г.
