CC BY
90
УДК 634.836:531.19
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА ПРОЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИ ДЕТЕРМИНИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ ОКРАСКИ КОЖИЦЫ И СОКА ЯГОД ВИНОГРАДА НА УРОВНЕ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ IN VITRO
Зленко В.А. - к. б. н.
Институт винограда и вина «Магарач» УААН Котиков И.В. - ст. науч. сотр.
Г осударственный Никитский ботанический сад Трошин Л.П. - д. б. н., профессор1 Кубанский государственный аграрный университет
Корреляция между синтезом антоцианов в ягодах различных сортов винограда и в их каллусных тканях in vitro зависит от состава культуральной среды. Генотипы винограда различаются по способности к синтезу антоцианов в каллусных тканях, культивируемых при освещении интенсивностью 2000 лк на модифицированной твердой среде Schenk, Hildebrandt (1972) в зависимости от концентрации в ней регуляторов роста НУК (NAA) и БАП (BAP). В варианте среды с высоким содержанием БАП (8 мг/л) и 2 мг/л НУК у сорта Антей магарачский образовался зеленый каллус, а у Муската черного
- красный. Наоборот, добавление в эту среду высокой концентрации НУК (10 мг/л) и
0,5 мг/л БАП индуцировало развитие красного каллуса у Антея магарачского и серого -у Муската черного. Вариант этой среды с 2 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП вызывал формирование красного каллуса у обоих сортов. Повышение рН этого варианта среды до 7,0 (до автоклавирования) увеличивало синтез антоцианов в каллусах названных сортов. У сеянца Магарач 100-74-1-7 максимальное накопление антоцианов в каллусе наблюдалось в варианте этой среды с 2 мг/л НУК и низкой концентрацией БАП (0,05 мг/л).
1 Результаты исследований получены во время работы авторов в Институте винограда и вина «Магарач».
Выведение сортов винограда занимает 10-25 лет, на протяжении которых создают обширный гибридный фонд и в процессе его изучения выделяют по сочетаемости необходимых градаций признаков и свойств единичные сеянцы. Для ускорения селекционного процесса необходимо совершенствовать методы его проведения. Одним из подходов к решению этой проблемы может стать ранняя диагностика хозяйственно-ценностных признаков на ювенильной стадии задолго до вступления сеянцев в пору плодоношения.
Все клетки растительного организма обладают потенциальной способностью к биосинтезу фенольных соединений, образующихся из продуктов первичного метаболизма [1]. Вследствие тотипотентности растительных клеток, изменение внешних условий может вызвать вторичную дифференциацию, в частности, превращение меристематических клеток в паренхиматические [2]. Последние бедны цитоплазмой, имеют мелкие ядра, большие вакуоли и пластиды, наполненные запасными веществами. Характер содержимого паренхиматических клеток тесно связан с выполняемыми ими функциями - синтезом и накоплением различных запасных веществ. Преобладание в каллусной ткани клеток паренхимного типа способствует синтезу и формированию вторичных веществ [3]. Антоциано-пласты содержались в вакуолях клеток кожицы ягод, а также ее культуры in vitro [4].
Суспензия клеток винограда использовалась для определения предшественников синтеза антоцианов. Установлено, что фенилаланин, меченный
13
изотопом С, включается в синтез антоцианов на уровне 65 % [5]. Накоплению антоцианов в клетках суспензионной культуры Vitis spp. предшествовало повышение в них уровня фенилаланина, из которого синтезируются антоцианы [6]. Добавление в среду фенилаланина увеличивало синтез ан-тоцианов [7].
Внесение в среду 0,1-10 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) вызывало дедифференциацию клеток Haplopappus gracilis, уменьшение их размеров с одновременным прекращением синтеза антоцианов [8]. По модельной системе установлено, что синтез антоцианов в суспензионной культуре моркови индуцируется переносом клеток из среды, содержащей 2,4-Д, в среду без нее [9].
В роли индукторов синтеза в клетках вторичных веществ могут выступать различные контролируемые факторы: добавление в среду ауксинов, гиббереллинов, цитокининов и др., температура культивирования, условия аэрации среды и т. д. [3]. Цитокинины и их предшественники в определенных концентрациях способствуют синтезу антоцианов [2]. Каллусы из усиков винограда сорта Кардинал, выращенные на питательных средах, содержащих кинетин, гиббереллин и аденин в определенных соотношениях, приобретают пигментацию от красного до фиолетового цвета [10].
Обработка абсцизовой кислотой гроздей винограда в начале созревания (10 % проявления окраски ягод) на 3-4 недели ускоряла процесс созревания ягод и синтеза в них антоцианов [11]. При воздействии эндогенной абсцизовой кислотой на ягоды винограда в их эпидермальных клетках увеличивалось образование и размер антоцианопластов без изменения размера клеток [12].
В культуре каллусной ткани Parthenocissus tricuspidata Planch. при уменьшении концентрации азота синтезировались антоцианы [13]. Снижение уровня накопления иона NO3- и увеличение содержания сахарозы в среде ускоряли синтез антоцианов в клетках суспензионной культуры винограда. Максимальный синтез антоцианов отмечался при 2,5 mM NO3- и 8 % сахарозы. Ионы NO3- ингибируют аккумулирование антоцианов с помощью тонопласт АТФ-азы [14]. В суспензионной культуре сорта винограда Gamay Freaux синтез антоцианов наблюдался на пятый день культивирования и был увеличен соответственно на 32 и 46 % в среде среднего
(0,25 тМ) и низкого (0,008 тМ) уровней содержания неорганического фосфата [15].
В отличие от сорбитола и манитола, высокие концентрации сахарозы, глюкозы и фруктозы в суспензионной культуре винограда стимулировали синтез антоцианов. По мнению авторов, увеличение синтеза антоцианов связано не с повышением осмотического потенциала в культуральной среде, а с включением сахаров (сахарозы, глюкозы и фруктозы) в метаболические процессы [16].
Если повторные деления клеток тормозятся, и нарастание клеточной массы прекращается за счет факторов, лимитирующих условия культивирования, в клетках наблюдается повышенный синтез антоцианов [17]. В суспензионной культуре УШб Брр. антоцианы аккумулируются на стационарной фазе, когда клеточные деления уже прекращаются. Ингибирование синтеза ДНК афидиколином или добавление свежей жидкой среды без фосфата тормозит процесс клеточного деления и приводит к синтезу антоцианов [7].
Синтез антоцианов зависит от состава света и температуры. Освещение с преобладанием зеленых и синих участков спектра способствовало появлению антоцианов в каллусной ткани винограда. Обработка кусочков каллусной ткани корня моркови холодной водой (+ 4оС) перед высадкой ее на питательную среду также приводила к синтезу антоцианов [2].
На основании литературных данных можно сделать вывод о том, что синтез антоцианов в каллусной ткани зависит от состава питательной среды, освещения и температуры. Образование и накопление антоцианов увеличивается в стационарной фазе роста.
На среде, способствующей синтезу антоцианов, выделенные клоновой селекцией две клеточные линии сорта Оатау синтезировали в 4 раза больше антоцианов, чем исходные клетки. Качественный состав антоциа-
нов менялся в процессе культивирования и зависел от условий выращивания культуры [18].
В каллусной ткани петунии содержались те же антоцианы (петунидин и мальвидин), что и в венчиках исходных растений [19]. Состав культуральной среды влияет на количественный состав антоцианов и их предшественников в клетках винограда in vitro. Относительно контрольных клеток, на средах с невысокой концентрацией неорганического фосфата аккумулировалось больше ацилированных цианидин- и теонидин-глюкозидов [15]. Пролиферирующие каллусные клетки винограда сорта Spatburgunder, культивируемые in vitro, синтезировали продельфинидин [20].
Вещества антоцианового комплекса, углеводы и ароматические вещества накапливаются в ягодах винограда по мере их созревания. Максимум формирования этих веществ наблюдается на стадии физиологической зрелости винограда, когда мякоть ягод состоит из паренхиматических клеток с большими вакуолями, где содержатся углеводы, антоцианы и ароматические вещества [21]. В культуре ткани при определенных условиях можно вызывать образование каллусной ткани паренхиматического типа [2]. Нами была выдвинута гипотеза о возможности получения каллусной ткани in vitro паренхиматического типа, приближающейся по своему строению к мякоти ягоды на стадии физиологической зрелости.
Разработан способ ранней диагностики окраски кожицы и сока ягод у сеянцев (в первые месяцы их развития) на уровне каллусной ткани, выращенной in vitro. У сортов с белой кожицей и соком ягод, образующимся из эксплантов листьев, черешков листьев и междоузлий, формируется каллус белого цвета. У сортов с окрашенной кожицей, но с бесцветным соком красный каллус будет только при его культивировании с интенсивностью освещения 2000 лк, а у сортов с окрашенными кожицей и соком ягоды -как в темноте, так и при освещении [22, 23].
У винограда генотипическая специфичность сорта или сеянца по содержанию и порядку синтеза веществ - компонентов антоцианового комплекса (диглюкозидов, в частности) может быть установлена на уровне каллусной ткани. Выявленная корреляция между содержанием и порядком синтеза антоцианов в кожице ягод и каллусе, развившемся из эксплантатов (междоузлий, листьев, черешков листьев), позволяет селекционерам проводить раннюю диагностику этих признаков в будущем урожае сеянцев винограда в первые месяцы их развития [24].
Г енотипы винограда различаются по ответной реакции каллусной ткани, культивируемой in vitro, на концентрации регуляторов роста в питательной среде (табл. 1).
Таблица 1. Различия двух сортов винограда по развитию и окраске каллусных тканей in vitro на вариантах сред с различными концентрациями регуляторов роста НУК, 2,4-Д и
БАП 1
№ п/п Концентрации регуляторов роста в среде2, мг/л Антей магарачский Мускат черный
количество каллуса, 3 см окраска каллуса количество каллуса, 3 см окраска каллуса
1 НУК-0,2; БАП-0,5 0,5 ± 0,2 Зеленый 0,2 ±0,1 Зеленый и красный
2 НУК-0,2; БАП-2 2,5 ± 0,8 Зеленый 0,9 ±0,6 Зеленый
3 НУК-0,2; БАП-8 1,0 ± 0,5 Зеленый 0,4 ±0,3 Зеленый и красный
4 НУК-2; БАП-0,5 0,5 ± 0,3 Розовый 0,3 ±0,2 Красный
5 НУК-2; БАП-0,5 рН = 7 0,9 ± 0,5 Красный 0,4 ±0,4 Красный
6 НУК-2; БАП-2 1,3 ± 0,4 Красный и зеленый 0,9 ±0,7 Зеленый и красный
7 НУК-2; БАП-8 1,1 ± 0,6 Зеленый 0,1 ±0,1 Красный
8 НУК-10; БАП-0,5 1,1 ± 0,5 Красный 0,7 ±0,4 Серый
9 НУК-10; БАП-2 0,2 ± 0,2 Серый 0,7 ±0,3 Серый и красный
10 НУК-10; БАП-8 0,6 ± 0,3 Серый 0,1 ±0,1 Красный
11 2,4-Д-0,2; БАП-0,5 1,8 ± 0,7 Серый 0,3 ±0,2 Красный
12 2,4-Д-0,2; БАП-8 0,5 ± 0,3 Серый 0,4 ±0,2 Зеленый и серый
13 2,4-Д-2; БАП-0,5 0,5 ± 0,2 Серый 0,4 ±0,2 Серый
14 2,4-Д-2; БАП-2 1,5 ± 0,6 Красный 0,01 ±0,0 Серый
15 2,4-Д-2; БАП-8 0,3 ± 0,3 Серый 0,2 ±0,1 Серый
Первичные экспланты - черешки листьев, 30 дней культивирования в темноте и затем 28 дней при освещении интенсивностью 2000 лк белыми люминесцентными лампами, 15 повторностей, Р < 0,05.
2 Среда [25] с повышенной концентрацией сахарозы (60 г/л), 7,5 г/л 011x0 агара, рН = 5,6 (кроме варианта среды № 5).
Низкая концентрация (0,2 мг/л) ауксина а -нафтилуксусной кислоты (НУК) с 0,5 и 2 мг/л 6-бензиламинопурина (БАП) не способствовала синтезу красящих веществ в каллусах винограда сортов Антей магарачский и Мускат черный. Добавление в среду высокой концентрации НУК (10 мг/л) с 0,5 мг/л БАП вызывало развитие красного каллуса Антея магарачского и серого - Муската черного, наоборот, содержание в среде 8 мг/л БАП с добавлением 2 мг/л НУК приводило к образованию красного каллуса у Муската черного и зеленого - Антея магарачского. На среде, содержащей другой ауксин - 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) низкой концентрации (0,2 мг/л) с 0,5 мг/л БАП, развивались красный каллус у сорта Мускат черный и серый - Антея магарачского. Только один вариант концентрации регуляторов роста - 2 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП - индуцировал син-
тез антоцианов в каллусах двух сортов винограда без их окрашивания в зеленый цвет. Высокое значение рН = 7 среды улучшало образование красящих веществ в каллусе этих сортов (см. табл. 1). Для синтеза антоцианов в каллусной ткани гибридной формы Магарач 100-74-1-5 оптимальным был вариант среды, содержащий 2 мг/л НУК и 0,05 мг/л БАП (табл. 2). Повышение концентрации этих регуляторов роста в вариантах среды снижало синтез красящих веществ в каллусных тканях.
Таблица 2. Влияние регуляторов роста а -нафтилуксусной кислоты (НУК) и 6-бензиламинопурина (БАП) на развитие и окраску каллусной ткани in vitro, образовавшейся 1 из эксплантов черешков листьев гибридной формы винограда Магарач 100-74-1-5
№ п/п Концентрации НУК и БАП в среде 2, мг/л Количество каллуса, см3 Степень окраски каллусной ткани, балл
1 НУК-2,0; БАП-0,05 1,5 ± 0,4 2,6 ±0,3
2 НУК-2,0; БАП-0,2 2,1 ± 0,6 1,4 ±0,3
3 НУК-2,0; БАП-0,5 2,0 ± 0,5 0,9 ±0,2
4 НУК-4,0; БАП-0,05 1,3 ± 0,3 1,8 ±0,3
5 НУК-4,0; БАП-0,2 1,4 ± 0,3 0,9 ±0,2
30 дней культивирования в темноте и затем 28 дней при освещении интенсивно -стью 2000 лк белыми люминесцентными лампами, 15 повторностей, Р < 0,05.
2 Среда [25] с повышенной концентрацией сахарозы (60 г/л), 7,5 г/л Difco агара, рН = 5,6.
Что касается возможности диагностирования содержания ароматических веществ в ягодах винограда на уровне каллусной ткани in vitro, то в клетках суспензии из тканей черешков листьев сорта Конкорд ароматические вещества, характерные для сортов Vitis labrusca L., не найдены, а предшественники b -дамасценона присутствовали в меньшей концентра-
ции, чем в каллусе на твердой среде, причем только на стационарной фазе роста суспензии. Интенсивное освещение и увеличенная концентрация сахарозы в культуральной среде повышали уровень содержания предшественников b -дамасценона в каллусной ткани, полученной из черешков листьев сорта Конкорд [26 ].
Таким образом, синтез красящих веществ в каллусной ткани на специальной среде при определенных условиях (без освещения или с освещением) позволяет проводить раннюю диагностику содержания антоцианов в кожице и соке ягод сеянцев в первый год их развития, задолго до плодоношения [22], при этом можно прогнозировать качественный состав веществ антоцианового комплекса [24].
Список литературы
1. Запрометов М.Н. Фенольные соединения растений: биосинтез, превращения и функции // Новые направления в физиологии растений. - М.: Наука, 1985. - C. 143-162.
2. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. - М.: Наука, 1964. - 270 с.
3. Калинин Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. - Киев: Наукова думка, 1980. - 488 с.
4. Nakamura M. Anthocyanoplasts in Kyohko grapes // Journal of the Japanese Society for Horticultural Science. - 1993. - V. 62. - P. 353-358.
5. Production of 13C-labelled anthocyanins by Vitis vinifera cell suspensions cultures / S. Krisa, P. Waffo Teguo, A. Decendit, G. Deffieux, J. Vercauteren, J.M. Merillon // Phytochemistry. - 1999. - V. 51. - P. 651-656.
6. Obtaining Vitis vinifera cell cultures producing higher amounts of malvidin-3-0-P-glucoside / S. Krisa, X. Vitrac, A. Decendit, F. Larronde, G. Deffieux, J.M. Merillon // Biotechnology Letters. - 1999. - V. 22. - P. 497-500.
7. Regulatory mechanisms of biosynthesis of betacyanin and anthocyanin in relation to cell division activity in suspension cultures / M. Sakuta, H. Hirano, K. Kakegawa, J. Suda, M. Hirose, R.W.IV Joy, M. Sugiyama, A. Komamine // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. -1994. - V. 38. - P. 167-169.
8. Stkkland K., Sunderland N. Production of anthocyanins, Flavonols and Chloro-genic Acids by Cultured Callus Tissues of Haplopappus gracilis // Annals of Botany. - 1972.
- V. 36. - N° 146. - P. 443-457.
9. Ozeki Y., Komamine A. Induktion of anthocyanin synthesis in relation to embryo-genesis in a carrot suspension culture - a model system for the study of expression and repression of secondary metabolism // Primary and secondary Metab. Plant Cell Cult. - Berlin e. a., 1985. - P. 99-1G6.
1G. Изровска Н., Лилов Д. Участие на гиберелиновата киселина / ГАЗ/ при инду-циране на морфогенез върху тъкани, изолирани от различни органи на лоза // Физиология на растенята. - 1981. - T. 4. - М 1. - С. 23-28.
11. Effects of natural type (S)-(+)-abscisic acid on anthocyanin accumulation and maturity in ‘Kioho’ grapes / K.S. Lee, J.C. Lee, Y.S. Hwang, I.B. Hur // Journal of the Korean Society for Horticultural Science. - 1997. - V. 38. - P. 717-721.
12. Kim S.B. Effect of ABA on the occurrence and development of anthocyanoplasts in ‘Kyoho’ grapes / S.B. Kim, C.H. Lee, D.H. Han // Journal of the Korean Society for Horticultural Science. - 1997. - V. 38. - P. 55-59.
13. Heller R. Sur la formation d’anthocyane dans les tissus de vigne - vierge cultive in vitro par supperssion de l’azote du milieu de culture // C. R. Soc. Biol. - 1948. - V. 142. - P. 768-769.
14. Enhanced anthocyanin production in grape cell cultures / F.J. Hirasuna, M.L. Shuler, V.K. Lackney, R.M. Spanswick // Plant Sciense (Shannon). - 1991. - V. 78. - P. 1G7-12G.
15. Dedaldechamp F. Enhancement of anthocyanin synthesis and dihidroflavonol reductase, DFK, activity in response to phosphate deprivation in grape cell suspensions / F. Dedaldechamp, C. Uhel, J.J. Macheix // Phytochemistry. - 1995. - V. 4G. - P. 1357-136G.
16. Regulation of polyphenol production in Vitis vinifera cell suspension cultures by sugars / F. Laronde, S. Krisa, A. Decendit, C. Cheze, G. Deffieux, J.M. Merillon // Plant Cell Reports. - 1998. - V. 17. - М 12. - P. 946-95G.
17. Enhanced accumulation of anthocyanins in Vitis vinifera cells immobilized in polyurethane foam / J.L. Iborra, J. Guardiola, S. Montaner, M. Canovas, A. Manjon // Enzyme and Microbial Technology. - 1994. - V. 16 - P. 416-419.
18. Cormier F. Anthocyanin production in selected cell lines of grape Vitis vinifera L. / F. Cormier, C.B. Do, Y. Nikolas // In vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. -1994. - V. 3G. - P. 171-173.
19. Synthesis of malvidin and petunidin in pigmented tissue cultures of Petunia hy-brida / C.M. Colijn, L.M.V. Jonsson, A.W. Schram, A.J. Kool // Protoplasma. - 1981. - V. 107. - № 1-2. - P. 63-68.
20. Feucht W. Flavanols in grapevine: in vitro accumulation and defence reactions in shoots / W. Feucht, D. Freutter, E. Christ // Vitis. - 1996. - V. 35 - P. 113-118.
21. Стоев К. Д. Физиологические основы виноградарства. - София: Изд. Болгарской акад. наук, 1973. - Т. 2. - 538 с.
22. А. с. 948339, СССР, МКИ3 A01G 7/00. Способ диагностики окраски кожицы и цвета сока ягод винограда. - Заявка № 3232084/30-15. Заявл. 04.01.81. Опубл. 07.08.82. / П.Я. Голодрига, В.А. Зленко, Т.А. Калуцкая, Л.К. Киреева, Н.П. Дубовенко, Р.Г. Бутенко, Б. А. Левенко. - Бюл. № 29. - 2 с.
23. Haydu Z. Application of in vitro cultures in the Research on grapevine genetics // 4-th international symposium on grapevine breeding. - Verone /Italie/ 13-18 Avril, 1985. - P. 25.
24. Голодрига П.Я. Прогнозирование некоторых компонентов качества урожая сортов и сеянцев винограда по каллусной ткани / П.Я. Голодрига, М. А. Костик, В. А. Зленко // Физиология и биохимия культурных растений. - 1986. - № 5. - С. 510-515.
25. Schenk R.U., Hildebrandt A.C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dycotyledonous plant cell cultures // Can. J. Bot. - 1972. - V. 50. -P. 199-204.
26. Shure K.B., Acree T.E. Production of P-damascenone precursors in cell cultures of Vitis labruscana cv. Concord grapes // Plant Cell Reports. - 1994. - V. 13. - P. 477-480.
