Введение редиса и огурца в культуру in vitro Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ААДДДГЁД DДДЁNД Ё IAODOД А ЁOЁUOODO in vitro*

Ё.А.Даібіаа, Ё. Д. Ёао^е,

Д. А. I і еоёГ, Д. N. Ёбеабёё f

Т bбaaтba^a і abтaёёa їTёб+a^ёy ёaёёбn ^Tё bёa^ё тaббoa ё бaaёna aёy ёб а ^aaбa^ёy а ёбёubббб in vitro. I бё yoTі їтaтaбa^ Tїbё^aёu^йё nTnoaa nбaaй aёy ёaёёбnTaa^aga Ta Tbaaёu^йб yёnїёa^baб. Aйyaёa TT aёёy^ёa ёT^0a^bбa0ёё 2,4-A ё 6-AA I Ta TaбagT-aa^ёa ёaёёбna. Eaёёбn^ay bёa ти ёб-^!зa anaaT тaбa9бabny ra aёїTёTbёёa б тaббoa ё ra ёёnbuyб б бaaёna, ^agaaёnё^ т to aaбёa^ba nбaaй. I тёб+a т й nbaaёёu^т бanbбйёa ёaё-ёбn^йa ёёТёё тaббoa ё бaaёna.

Современный уровень развития биологии и растениеводства немыслим без использования в качестве исходного посадочного материала растений, подготовленных посредством клеточных технологий. Оздоровление растительного материала с помощью технологий in vitro позволяет резко повысить качество посадочного материала без изменений сортовых характеристик [9].

Клональное микроразмножение растений в культуре in vitro позволяет за короткий срок получать большое количество посадочного материала растений [3]. Коэффициенты микроразмножения достигают 105—107 растений в год, что в несколько тысяч раз больше, чем при использовании традиционных методов вегетативного размножения. Также клональное микроразмножение значительно ускоряет селекционный процесс, сокращая сроки получения товарной продукции до 2—

3 лет вместо 10—12 [2]. Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные, суспензионные культуры или изолированные протопласты [1]. Каллусная ткань представляет собой легкодоступный материал, наиболее часто используемый для клеточной селекции. Обычно работу проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований [8]. Использование каллусной культуры в селекционных целях открывает огромные возможности в создании новых форм растений, несущих ценные признаки, необходимые для человечества [7].

Определяющим фактором получения кал-лусных культур является соотношение экзогенных гормональных препаратов в питательной среде. Примеры формирования кал-лусной ткани и регенерации растений из нее показывают большое разнообразие применяемых концентраций и соотношений регуляторов роста. Не существует общей формулы в отношении концентраций гормонов, пригодных для каллусогенеза каждого вида. При этом специальная среда, разработанная, как правило, эмпирически для индукции дифференциации и органообразования у тканей одного вида, совсем не обязательно будет индуктивной в культуре тканей другого вида. Одна из главных причин такой вариабельности в ответе тканей на внешние гормональные факторы лежит в различной способности тканей синтезировать собственные эндогенные фитогормоны [4].

Имеются данные об использовании кал-лусных культур огурца in vitro с использованием различных вариантов сред для каллусо-генеза [6]. Однако не вполне понятно, насколько оптимальны использованные ранее варианты сред для каллусогенеза у огурца. По редису данные о переводе в культуру in vitro нам не известны.

Цель данной работы состояла во введении редиса (Raphanus sativus L.) и огурца (Cucumis sativus L.) в культуру in vitro. Для ее достижения выполнялись следующие этапы исследования:

1) получение стерильных растений;

2) получение каллусных тканей из различных эксплантов и их поддержание в культуре in vitro;

* Исследование выполнено при поддержке Федерального агентства по образованию (АВЦП «Развитие научного потенциала высшей школы», проект 2.1.1/624).

3) эмпирический подбор состава среды для индукции каллусогенеза;

4) выявление влияния соотношения регуляторов роста на каллусогенез;

5) определение эпигенетических особенностей эксплантов редиса и огурца in vitro.

В качестве объектов исследования были взяты семена огурца и редиса. Сортовые характеристики огурца «единство»: среднеспелый (55 дней), пчелоопыляемый, устойчив к болезням. Производитель: ООО «Агрофирма „Аэлита“». Качество семян проверено и соответствует ГОСТу Р 52171-2005. Редис «красный великан» урожайный, среднеспелый, отличается устойчивостью к неблагоприятным температурным условиям.

Эксперимент включал следующие этапы:

1. Проба на прорастание. В чашки Петри помещали по 15 семян (в трехкратной повторности) и проращивали в течение 7 сут.

2. Стерилизация семян по схеме: 0,1 % KMnO4 (20 мин) ^ 6 % хлорамин (10 мин) ^ 70 % спирт (1 мин) ^ трехкратное промывание стерильной дистиллированной водой в течение 15 мин.

3. Посадка стерильных семян на мостики из фильтровальной бумаги в пробирках со стерильной водой [5] и выращивание стерильных растений в течение 14 дней в лабораторных условиях при температуре 22—25 °С, освещении люминесцентными лампами интенсивностью 2 000 лк, влажности воздуха около 80 %, соотношении периодов.

4. Посадка эксплантов на питательную среду для образования каллусной ткани. В качестве эксплантов брали участки семядольных листьев, стебля (гипокотиля), конуса нарастания и корня. Использовали питательную среду Мурасиге — Скуга (МС) с добав-

лением регуляторов роста 2,4—дихлорфенок-сиуксусной кислоты (2,4—Д) и 6—бензилами-нопурина (6-БАП) в следующих вариантах концентраций:

Первая серия опытов:

1 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП;

2 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП;

3 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП;

4 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП.

Вторая серия опытов:

1 мг / л 2,4-Д и 1 мг / л 6-БАП;

3 мг / л 2,4-Д и 1 мг / л 6-БАП;

4 мг / л 2,4-Д и 1 мг / л 6-БАП;

5 мг / л 2,4-Д и 1 мг / л 6-БАП.

Во второй серии опытов в среду МС дополнительно добавляли мезоинозит (100 мг / л), глицин (1 мг / л), никотиновую кислоту (0,5 мг / л).

5. Индукция каллусогенеза и выращивание каллусной ткани в термостате при температуре 23 °С.

На первом этапе работы с объектом необходимо оценить качество посадочного материала. Определения показали, что всхожесть семян огурца в среднем составила 73,3 %, редиса — 76,0 %. Таким образом, посадочный материал был вполне кондиционным и пригодным для использования. На последующих этапах работы посредством поверхностной стерилизации семян получали стерильные пробирочные растения. Возраст стерильных растений огурца и редиса в пробирках перед эксплантацией на питательную среду составлял 14 дней в первой серии опытов и 30 дней — во второй.

После эксплантации кусочков стерильных растений огурца в первой серии опытов и инкубации чашек Петри с эксплантами в темноте были получены следующие результаты по огурцу (табл. 1).

Таблица 1

Каллусогенез на эксплантах огурца in vitro (первая серия опытов)

2,4-А / 6-ААТ, Уёт'ёаТо Kie-ai КТё-аТ уёт'ёаТоТа п ёаёёопТ 1 Оаао

1а / ё уёп'ёаio!a ё ёп пёпоа 1 оёу ёаёёопа

1 / 0,5 паТуаТёиТйа ёёпоиу 4 1 0а1 ТТ-жаёойё, даЭТёпойё, пЭааТаё УёТОТТпОё

аё'ТёТоёёи 6 3 ОТ жа

ёТЭТуо 4 — ОТ жа

ПаТуаТёиТйа ёёпоиу 4 — —

2 / 0,5 аё'ТёТоёёи 5 1 0а 1 ТТ-жаёойё, даЭТёпойё

ёТЭТуо 4 — —

4 / 0,5 ПаТуаТёиТйа ёёпоиу 2 1 0а 1 ТТ-жаёойё, даЭТёпойё, пЭааТаё УёТоТТпоё

аё'ТёТОёёи 2 2 ОТ жа

ёТЭТуо 1 — —

Лучше всего каллусогенез на эксплантах огурца шел на среде МС, содержащей 1 мг / л

2,4-Д + 0,5 мг / л 6-БАП (4 экспланта с каллусом); на среде МС, содержащей 4 мг / л 2,4-Д + + 0,5 мг / л 6-БАП, на трех эксплантах образовался каллус; на среде 2 мг / л 2,4-Д + 0,5 мг / л 6-БАП образование каллуса произошло всего лишь на одном экспланте (рис. 1). При сравнении различных эксплантов выявлено, что интенсивнее всего каллусогенез проходил на листьях (4 экспланта), затем на гипокотиле (3 экспланта), а на корнях каллус не образовался совсем. На варианте среды 1 мг / л 2,4-Д

и 0,5 мг / л 6-БАП наблюдались полностью обросшие каллусом желтовато-зеленого цвета, зернистой структуры экспланты редиса (рис. 2). Первыми в чашке начали обрастать эксплан-ты листьев, затем все остальные. После 14 дней инкубирования наблюдался усиленный рост каллуса на эксплантах корней. Образовавшийся каллус полностью покрывал весь эксплант. Экспланты стеблей обрастали каллусом медленнее остальных. При проведении работ с эксплантами редиса во всех вариантах среды наблюдали более интенсивный каллусогенез (табл. 2).

Рисунок 1

Каллус на гипокотиле огурца на среде МС с добавлением 2 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП

Таблица 2

Каллусогенез на эксплантах редиса in vitro (первая серия опытов)

2,4-А / 6-ААТ, 1а / ё Уёт'ёаТо К|ё-а1 уёт'ёаТоТа КТё-аТ уёт'ёаТоТа п ёаёёопП Оаао ё ёТТПёпоаТоёу ёаёёоПа

1 / 0,5 ЫаТуаТёиТйа ёёпоиу 3 3 ^аёоТааоТ-даёаТйё, даЭТёпойё, ПЭааТаё УёТоТТпоё

Аё'ТёТоёёи 9 6 ОТ жа

КТЭТуо 7 4 ОТ жа

2 / 0,5 ЫаТуаТёиТйа ёёпоиу 9 8 ЫаЭйё, даЭТёпойё

Аё'ТёТоёёи 4 4 ОаТТТ-жаёойё, даЭ Т ёпой ё

КТЭТуо 7 5 Оа1 ТТ-ёТЭё-наайё, даЭТёпойё

4/ 0,5 ЫаТуаТёиТйа ёёпоиу 11 11 ОаТТТ-паЭйё, ТаёёТдаЭТёПойё, ПЭааТаё УёТоТТпоё

Аё'ТёТоёёи 3 3 ОТ жа

КТЭТуо 8 7 ОТ жа

На среде МС с добавлением 1 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг/л 6-БАП каллусогенез шел не очень интенсивно; наиболее быстрый рост ткани наблюдали на гипокотилях (рис. 2). На варианте среды МС с добавлением 2 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП лучший каллусогенез из всех эксплан-тов наблюдался на семядольных листьях.

Каллус серого цвета, зернистой структуры, плотно покрывающий экспланты (рис. 3). На варианте среды 3 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6- БАП обрастание каллусом отмечено только на начальных этапах, после чего каллус быстро отмирал.

Рисунок 2

Каллусогенез у разных эксплантов редиса на среде МС с добавлением 1 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП

Рисунок 3 Каллусогенез у редиса на среде МС с добавлением 2 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП

По результатам этого этапа работы наилучшее формирование каллуса на эксплантах редиса наблюдалось на варианте среды с внесением 4 мг / л 2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП. Возможно, высокое содержание ауксинов способствовало лучшему каллусогенезу, и данное соотношение концентраций регуляторов роста было оптимальным для формирования каллуса. Среди исследованных эксплантов во всех вариантах среды лучше обрастали корни и листья. Непосредственно на листьях образование каллуса было зафиксировано раньше всех остальных эксплантов. Экспланты корня

обросли каллусом во всех чашках и во всех вариантах среды.

Во 2-й серии опытов по огурцу были получены несколько иные результаты (табл. 3). Обнаружено, что на корнях каллус образовался только в одном варианте среды (1 мг / л

2,4-Д + 1 мг / л 6-БАП). Значит, данная концентрация регуляторов роста является оптимальной для каллусогенеза на корнях. На всех других эксплантах каллус образовывался на всех вариантах среды независимо от ее состава. В среду дополнительно были добавлены глицин, мезоинозит, никотиновая кислота.

Таблица 3

Каллусогенез на эксплантах огурца in vitro (2-я серия опытов)

2,4-A / 6-AAT, la / ё Yen'iearo K t ё-a t yemearoTa ^ё-аТ yemearoTa n eaёёonт i Oaao е eTmenoaToey eaёёona

1 / 1 KT0T8 3 3 Naa0ёT-гвaё0Qё

1 / 3 Ае^^ёи 5 5 Naaoёт-gaёa^Qё

1/4 AёЇTeT0ёёu 11 7 OT ®a

KTare 4 — —

В чашке Петри с концентрацией регуляторов роста 5 мг / л 2,4-Д + 1 мг / л 6-БАП на-

№,

У

Во 2-й серии опытов по редису были получены несколько иные результаты (табл. 4). Каллус лучше образовывался в одном варианте среды (1 мг / л 2,4-Д и 4 мг / л 6-БАП).

блюдался интенсивный каллусогенез с последующим ризогенезом (рис. 4).

Рисунок 4

Каллусогенез (верхнее фото) и органогенез (нижнее фото) у эксплантов огурца на среде МС с добавлением 5 мг / л 2,4-Д + 1 мг / л 6-БАП

Видимо, данная концентрация регуляторов роста является оптимальной для каллусогене-за. В среду дополнительно были добавлены глицин, мезоинозит, никотиновая кислота.

Таблица 4

Каллусогенез на эксплантах редиса in vitro (2-я серия опытов)

АаЭёаТО n9aaQ Yen'iearo K t ё-а! ует'ёаТОТа ^ё-аТ ует'ёаТОТа n еаёёОПП Oaao ё еТтёПОаТоёу еаёёопа

1 / 1 ^ЭТё 4 4 NaaoёT-na9Qё

1 / 3 Аё'иеТОёёи 4 4 ^aёOT-gaёa^Qё

1 / 4 Ёёпоиу 11 8 ^aёOT-gaёa^Qё

1 / б ^ЭТё 4 4 Na9Qe

Таким образом, в проведенной работе отработана методика получения каллусной ткани огурца и редиса, подобран оптимальный состав среды для каллусогенеза на отдельных эксплантах. Выявлено влияние концентраций 2,4-Д и 6-БАП на образование каллуса. Хороший каллусогенез у редиса и огурца наблюдался на средах МС с регуляторами

роста 1 мг / л 2,4-Д и 1мг / л 6-БАП; 4 мг / л

2,4-Д и 0,5 мг / л 6-БАП, с добавлением глицина, никотиновой кислоты и мезоинозита. Каллусная ткань лучше всего образуется на гипокотиле огурца и на листьях редиса независимо от варианта среды. Получены стабильно растущие каллусные линии огурца и редиса.

АЁАЁЁIАВАОЁхАМЁЁЁт'ЁМIЁ

1. Бутенко Р. Г. Изолированные протопласты растений — объект и модель для физиологических исследований / Р. Г. Бутенко // Культура клеток растений. — М. : Наука, 1981. — С. 69—84.

2. Бутенко Р. Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р. Г. Бутенко. — М. : Наука, 1964. — 272 с.

3. Катаева Н. В. Клональное размножение в культуре ткани. Культура клеток растений / Н. В. Катаева, В. А. Аветисов. — М. : Наука, 1981. — С.13—49.

4. Клеточная инженерия / Р. Г. Бутенко, М. В. Гусев, А. Ф. Киркин, Т. Г. Корженевская, Е. Н. Ма-

карова. — М. : Высш. школа, 1987. — 127 с.

5. Лукаткин А. С. Методические указания к лабораторному практикуму по курсу «Цитология и клеточная инженерия» / А. С. Лукаткин. — Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 1995. — 16 с.

6. Лукаткин А. С. Использование каллусных культур огурца для изучения холодового повреждения / А. С. Лукаткин // Изв. АН. Сер. Биологическая. —1999. — № 3. — С. 304—308.

7. Лукаткин А. С. Цитология и клеточная инженерия : учеб. пособие / А. С. Лукаткин, А. Н. Дерябин. — Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 1999. — С. 133—185.

8. Лукаткин А. С. Холодовое повреждение теплолюбивых растений и окислительный стресс / А. С. Лукаткин. — Саранск : Изд-во Мордов. ун-та, 2002. — 208 с.

9. Сельскохозяйственная биотехнология / под ред. В. С. Шевелухи. — 2-е изд., перераб. и доп. — М. : Высш. школа, 2003. — 469 с.

Поступила 22.12.08.

АЁ_Г А! ЁЁА ОА Г I I' I ЮЁВОЁ I Г Гио Ё I ВАА Г Ёд!А Г Г ио ОАвАЁОАвЁЙОЁЁ Vaccinjum туШМи^ Ь.

А СЙЁ I АЁВО ААЁ I ВА0ЁJ А I ВАЁ I ГА ВАЙЮАЁЁЁЁ АА0Ё I ВО I ЙОА Г

В. В. ЙаоебеееГа, А. А. ВааоабТаа

Аиёё ёдо-аТй 4 оаПт'оёуоёё (0 1) Уаесіпіит тугШІїБ 1_. а опёТаёуо АаёТЭао-ёТаТ ЭаёТТа ВА а ёаоТёё УаЭёТа 2007—2008 аа. АТ апао ёдо-аТТио оаТТУТУоёуоё-уо V. тугШІш уаёуаопу аиёТаТои а оЭаауТТ-ёопоаЭТё+ёТаТ! уЭопа. АТёьюТа ёТёё-апоаТ ТпТааё -аЭТёёё ТайёТТааТТТё апоЗа-аёти а оа тТтёуоёуО, ёТоТЭйа Эат'Тёаааёёпи Та ПаааЭТйО ё ПаааЗТ-даїааТйо пёёТТао, Тоёё-а|эйёопу аипТёТё пТ1-ёТоотоф ёЭТТ, ТёдёТё таайаТТШф ё аТёаа аипТёТё аёажТШф. Га |эжТйо пёёТТао ё Та ааЭяёТао ёПпёааТааТТйо ОТёТТа ї0ё аТёаа аипТёТё таайаТТтоё аёа V. тугШІш Топоопоаоао ёёё апоэа+ааопу а ааёТё-нйо пёо-ауо.

В Республике Башкортостан (РБ) произрастает 28 видов растений, нуждающихся в строгом регулировании. Одним из них является Vaccinium myrtШus Ь., широко используемое в народной и научной медицине. В Башкортостане отсутствуют крупные заросли черники. Если таковые и имеются, то они обычно находятся в мало- и труднодоступных местах. Доступные запасы черники удовлетворяют лишь спрос местного населения. В аптечные сети ягоды и лист черники поставляются из других регионов [1].

Vaccinium туПШш Ь. — травянистое листопадное растение семейства брусничных. В плодах и ягодах содержатся сахара (фруктоза, лактоза), Р-активные вещества (катехины и антоцианы), каротины, пектиновые и дубильные вещества; кислоты (молочная, янтарная, яблочная, лимонная, следы щавелевой и хинной); макро- и микроэлементы. Препараты Vaccinium тугШи Ь. благодаря дубильным веществам оказывают вяжущее и кровоостанавливающее действие вещества, используются как противодиабетические в силу со-