CC BY
80
гиена и санитария
2/2012
26 . Hrudey S. E. // Water Res. - 2009. - Vol. 43, N 8. - P. 2057-
2092 .
27 . HwangB. F., Jaakkola J. J., Guo H. R. // Environ. Hlth. - 2008.
- Vol. 7, N 23 . http://www.ehjournal.net/content/7/1/23 .
28 . Jo W. K., Kwon K. D., Dong J. I., Chung Y. // Sci. Total Environ.
- 2005. - Vol. 339, N 1-3. - P. 143-152.
29 . Kasim K., Levallois P., Johnson K. C. et al. // Am. J. Epidemiol.
- 2006.- Vol . 163, N 2 .- P. 116-126 .
30 . KogevinasM., Villanueva C. M., Font-RiberaL. et al. // Environ.
Hlth Perspect. - 2010. - Vol. 118, N 11. - P. 1531-1537.
31. Legionella 2003: An Update and statement by the association of water technologies (AWT), http://www.legionella.com/images/ awtlegionella2003 . pdf.
32 . Levesque S., Rodrigues M. J., Serodes J. et al. // Water Res. -
2006. - Vol. 40, N 15. - P. 2921-2910.
33 . MelnickR. L., Nyska A., Foster P. M. et al // Toxicology. - 2007.
- Vol . 230, N 2-3 . - P 126-136 .
34. Nieuwenhuijsen M. J., Toledano M. B., Elliott P. // J. Exposure Anal. Environ. Epidemiol. - 2000. - Vol. 10, N 6, pt 1. - P. 586599.
35. NieuwenhuijsenM. J., SmithR., GolfinopoulosS. et al. // J. Water Hlth. - 2009. - Vol. 7, N 2. - P 185-207.
36 . Nuckols J. R., Ashley D. L., Lyu C. et al // Environ. Hlth Perspect.
- 2005. - Vol. 113, N 7. - P. 863-870.
37 . Panyakapo M., Soontornchai S., Paopuree P. // J. Environ. Sci. -
2008 . - Vol . 20, N 3 . - P 372-378 .
38 . RanieriE., Swietlik J. // J. Environ. Engineer. Landscape Manag.
- 2010. - Vol. 18, N 2. - P. 85-91.
39 . RodrguezM. J., Serodes J. B.// Water Res. - 2001. - VOL. 35, N 6. - P. 1572-1588.
40. Semerjian L., Dennis J. // J. Water Hlth. - 2007. - Vol. 5, N 4. - P 511-522.
41. Service Hot Water, In 1995 ASHRAE Handbook, Chapter 45. HVAC Applications, Atlanta: ASHRAE, 1995. http://homeen-ergy.org/archive/hem.dis.anl.gov/eehem/96/960713.html .
42. U.S. EPA. Exposure factors handbook (Final Report) 1997. Vol. 3 - Activity Factors, Chapter 15 - Activity factors. U.S. Environmental protection Agency, Washington, 1997.
43. Whitaker H. J., Nieuwenhuijsen M. J., Best N. G. // Environ. Hlth Perspect. - 2003. - Vol. 111, N 5. - P. 688-694.
44. WHO Legionella and prevention of legionellesis / Ed. by J. Bartram et al. - Geneva: WHO, 2007. http://www. who . int/wa-ter_sanitation_health/emerging/legionella . pdf.
45. Wright J. M., Bateson T. F. // J. Exposure Anal. Environ. Epidemiol. - 2005. - Vol. 15, N 3. - P. 212-216.
46. Xu X., Mariano T. M., Laskin J. D., Weisel C. P. // Toxicol. Applied Pharmacol. - 2002. - Vol. 184, N 1. - P. 19-26.
47. XuX., Weisel C. P. // Environ. Sci. Technol. - 2003. - Vol.37, N
3. - P. 569-576.
48. Xu X., Weisel C. P. // J. Exposure Anal. Environ. Epidemiol. -2005. - Vol. 15, N 1. - P. 6-16.
49. Xu X., Weisel C. P. // J. Exposure Anal. Environ. Epidemiol. -2005. - Vol. 15, N 4. - P. 289-296.
50. Yang Y., Xu X., Georgopoulos P. G. // J. Exposure Sci. Environ. Epidemiol. - 2010. - Vol. 20, N 4. - P. 326-341.
Поступила 07.07.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.777-078
B. B. Парфенова, О. С. Кравченко, O. Н. Павлова, M. Ю. Суслова, Е. Д. Бедошвили
ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ ГИПОХЛОРИТА КАЛЬЦИЯ НА
выживаемость потенциально патогенных микроорганизмов, изолированных из озера Байкал
УРАН Лимнологический институт СО РАН, Иркутск
Проведены исследования, направленные на изучение выживаемости бактерий рода Pseudomonas и Enterососсus, выделенных из озера Байкал, под воздействием различных концентраций гипохлорита кальция, который используется как основное средство для обеззараживания питьевой воды. Экспериментальные исследования показали несовершенство метода хлорирования, так как этот метод не всегда является эффективным в отношении энтерококков.
Ключевые слова: микроорганизмы, бактерии рода Enterococcus и Pseudomonas, хлорирование воды
V V Parfenova, O. S. Kravchenko, O. N. Pavlova, M. Yu. Suslova, E. D. Bedoshvili - IMPACT OF DIFFERENT CALCIUM HYPOCHLORITE CONCENTRATIONS ON THE SURVIVAL OF POTENTIALLY PATHOGENIC MICROORGANISMS ISOLATED FROM BAIKAL LAKE
Limnological Institute, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Irkutsk
The survival rate of bacteria of the genera Pseudomonas and Enterococcus isolatedfrom Baikal Lake, exposed to different concentration of calcium hypochlorite used as a main agent for drinking water disinfection, was studied. Experimental studies have shown that chlorination was imperfect as this method is not always effective against Enterococci
Key words: microorganisms, bacteria of the genera Enterococcus and Pseudomonas, water chlorination.
Парфенова В. В. - доц., канд. биол. наук, рук. отд. микробиологии ([email protected]); Кравченко О. С. - канд. биол. наук, науч. сотр. отд. микробиологии ([email protected]); Павлова О. Н. - канд. биол наук, ст науч. сотр. отд. микробиологии ([email protected] . ru); Суслова М. Ю. - канд. биол наук, науч. сотр. отд. микробиологии ([email protected]); Бедошвили Е. Д. - канд. биол наук, науч. сотр. отд. ультраструктуры клетки ([email protected]).
Озеро Байкал является основным источником пресной питьевой воды в Иркутской области и прилегающих регионах. Формирование качества воды реки Ангары, снабжающей питьевой водой все крупные промышленные города и поселки в регионе, определяется качеством воды o.Байкал. В соответствии с нормативными актами Европейского сообщества, санитарными правилами и норма-
8
ми Российской Федерации при оценке качества воды в качестве индикаторных организмов следует определять не только общие колиформные и термотолерантные ко-лиформные бактерии, споры сульфитредуцирующих клостридий, но и фекальные энтерококки [7, 9].
В санитарно-биологическом аспекте в о. Байкал изучено пространственное распределение, биоразнообразие представителей семейства Enterobacteriaceae и группы неферментирующих бактерий [4, 11]. Систематическое изучение бактерий рода Enterococcus, также относящихся к индикаторной потенциально патогенной группе микроорганизмов, в о. Байкал начато с 2005 г. Проведенные исследования показали приуроченность обнаружения бактерий рода Enterococcus к литоральным районам о. Байкал, где наблюдается локальное антропогенное влияние. Из проб воды исследуемых районов изолированы штаммы: Е. faecium, Е. avium, Е. faecalis, Е. mundtii, Е. hirae, Е. durans, Е. gallinarum [5].
Известно, что для обеспечения соответствия микробиологическим параметрам вода, используемая для питьевого водоснабжения, подвергается различным методам обеззараживания. Наиболее распространенным методом обеззараживания воды является ее хлорирование с использованием свободного хлора и его соединений [1, 2, 8, 10, 16].
Действие хлора на микроорганизмы проявляется особенно сильно в течение первых 30 мин контакта. При этом из патогенных микроорганизмов наиболее чувствительны к хлору возбудители брюшного тифа, дизентерии и холеры. Возбудители паратифа В, энтерококки, а также вирусы являются более резистентными [16]. Согласно данным литературы [14], штаммы Enterococcus faecalis обладают повышенной устойчивостью и фенотипической толерантностью ко многим химическим и/или физическим агентам. Поэтому отсутствие Escherichia coli не обязательно свидетельствует об освобождении воды от санитарно-показательных микроорганизмов в результате ее хлорирования.
Цель работы - в условиях модельного эксперимента оценить влияние различных концентраций гипохлорита кальция на выживаемость грамположительных бактерий рода Enterococcus в сравнении с грамотрица-тельными микроорганизмами рода Pseudomonas, изолированными из о. Байкал.
Материалы и методы
Проведение модельного эксперимента. Изучение устойчивости бактерий родов Enterococcus, Pseudomonas к воздействию гипохлорита кальция в условиях эксперимента проводили в байкальской воде с накопительными культурами. Коллекционные штаммы Enterococcus faecium и Pseudomonas aeruginosa были выделены в 2006 г. из поверхностного слоя воды озера у пос. Култук.
Посевной материал вносили в колбы, содержащие 50 мл питательной среды (селективной среды BHI (Difko) для Е. faecium и мясопептонный бульон для P. aeruginosa). Инкубировали при температуре 37oC в течение суток. После наращивания биомассы клетки центрифугировали (1 тыс. об/мин) и трижды отмывали от среды физиологическим раствором. Эксперимент проводили в стерильной байкальской воде без и при добавлении органических веществ (ОВ) в количестве 187 мг/л. В колбы с водой (объем 100 мл) вносили посевной материал и различное количество гипохлорита
кальция: 2,4; 2; 1,2 и 0,6 мг/л (в пересчете на активный хлор в 100 мл воды 1,2; 1; 0,6 и 0,3 мг/л соответственно). В контрольные колбы гипохлорит кальция не вносили. Определение количественного содержания и характера развития бактерий в колбах проводили отбором аликвот воды по 1 мл через 1, 3, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 120, 180 мин и 1 сут. Эти аликвоты высевали на селективный агар с эскулином, азидом и канамицином (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd) и Pseudomonas Isolation Agar Base (HiMedia Laboratories Pvt. Ltd), культивировали в течение суток при 37oC .
Препараты для сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии готовили из накопительной культуры, клеточной суспензии, отобранной в начале экспериментами из колб с культурами, содержащих различные концентрации гипохлорита кальция, а также через 30 мин от начала экспозиции и через сутки.
Сканирующая электронная микроскопия. Препараты для сканирующей электронной микроскопии готовили по следующей методике: клеточную суспензию фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида и наносили 20 мкл на поликарбонатный фильтр (диаметр пор 0,2 мкм). Фильтры подсушивали на воздухе и далее проводили обезвоживание в серии растворов этанола: 40, 50, 70% -в каждом по 15 мин, а затем 96% - 10 мин. После обезвоживания снова сушили и сразу же напыляли золотом. Полученные препараты просматривали в сканирующем электронном микроскопе (Philips SEM 525М, Япония).
Для трансмиссионной электронной микроскопии клетки фиксировали добавлением глутарового альдегида до конечной концентрации 2,5% (2 ч), отмывали фосфатным буфером рН 7,0 и постфиксировали 1% раствором оксида осмия на фосфатном буфере с 0,2% фер-рицианидом калия 2 ч. Обезвоживание проводилось в серии растворов этанола: 30, 40, 50, 70 и 96%, в каждом по 10 мин, затем дважды по 30 мин в обезвоженном над сульфатом меди ацетоне. Обезвоженный материал пропитывали в смеси эпоксидных смол (Araldite 502 Kit SPI, США) и ацетона в соотношениях 1:1, затем переносили в полипропиленовую капсулу ВеетТМ в свежую смесь эпоксидной смолы с катализатором (250 мкл DMP-30 на 20 мл смолы) и полимеризовали в термостате последовательно при 37oC (12 ч) и 60oC (48 ч). Срезы, полученные на микротоме Ultracut R LElCA Austria алмазным ножом Diatom Diamond Knife, монтировали на палладиевые сетки. Препарат контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу [15], отмывали в 0,02 М NaOH, а затем в дистиллированной воде. Исследование срезов было проведено с помощью трансмиссионного электронного микроскопа Leo 906Е (Zeiss, Германия).
Результаты и обсуждение
В результате модельных экспериментов установлено, что при инкубировании Enterococcus faecium в байкальской воде при концентрациях гипохлорита кальция, начиная с 2 мг/л без добавления ОВ, в течение первых 10 мин происходит гибель микроорганизмов. Однако в стерильной байкальской воде при меньших концентрациях гипохлорита кальция (< 1,2 мг/л) бактерии остаются жизнеспособными и продолжают размножаться даже после 30-минутной обработки, но по истечении 3 ч погибают.
В отличие от бактерий рода Enterococcus гипохлорит кальция в стерильной воде без добавления ОВ оказывает сильный бактерицидный эффект на бактерии рода
9
гиена и санитария
2/2012
Рис. 1. Клетки бактерий рода Pseudomonas в байкальской воде.
а - без добавления гипохлорита кальция; б - поперечный разрез; в - они же при действии минимальной и г - максимальной концентрации гипохлорита кальция. Масштаб: а, в, г - 500 нм; б - 200 нм. Препарат контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу.
Pseudomonas. Внесение в байкальскую воду концентрации гипохлорита кальция больше 1,2 мг/л полностью подавляет рост бактерий рода Pseudomonas. При меньших концентрациях (0,6 мг/л) клетки продолжают размножаться, но погибают в течение часа от начала экспозиции. После 10-минутной обработки количество культивируемых клеток снижается на два порядка, через 60 мин - на три. В результате действия гипохлорита кальция на бактерии рода Pseudomonas клетки претерпевают значительные изменения (рис. 1). Внесенные в байкальскую воду бактерии рода Pseudomonas имеют типичное строение клеточной стенки, характерное для грамотрицательных микроорганизмов: пептидотикановый слой неплотно прилегает к цитоплазматической мембране и имеет толщину лишь 2-3 нм. Он окружен наружной мембраной, имеющей неровную, искривленную форму (см. рис. 1, а, б). При действии минимальной концентрации гипохлорита кальция - 0,6 мг/л в препаратах наблюдаются как целые клетки, так и лизированные (см. рис. 1, в). При действии максимальных концентраций гипохлорита кальция - 2 мг/л, содержимое клетки лизируется, клеточная стенка имеет множественные повреждения (рис. 1, г).
Обратная картина наблюдается при культивировании как бактерий рода Enterococcus, так и Pseudomonas в байкальской воде с различными концентрациями гипохлорита кальция при добавлении ОВ. В начале экспе-
римента в колбы было внесено 5 • 106 КОЕ/мл бактерий рода Pseudomonas. По истечении первых 10 мин количество микроорганизмов незначительно снижалось (2,6 • 105—3,6 • 105 КОЕ/мл), тем не менее численность оставалась в пределах первоначально внесенной дозы клеток. Затем наблюдали плавное нарастание количества бактерий, и уже через сутки в экспериментальных колбах содержалось от 4,3 • 1013 до 6,2 • 1013 КОЕ/мл бактерий. В результате экспозиции бактерий рода Enterococcus в байкальской воде, содержащей внесенное ОВ, в течение первых 60 мин происходит небольшое уменьшение численности клеток, при этом жизнеспособные клетки выявляются даже при действии максимальных концентраций гипохлорита кальция. Выявлено, что в присутствии органических веществ клетки показывают высокий уровень устойчивости к максимальным концентрациям дезинфицирующего вещества даже после 30-минутной обработки. Дальнейшие исследования при помощи сканирующей микроскопии показали, что клетки не изменяют свою морфологию при воздействии на них ни минимальных, ни максимальных концентраций гипохлорита кальция (рис. 2).
На практике с целью уничтожения микроорганизмов хлор или хлорсодержащие соединения вводят с избытком из расчета, чтобы через 30 мин после хлорирования воды содержание остаточного хлора было не менее 0,3
10
Рис. 2. Клетки энтерококков в байкальской воде без добавления гипохлорита кальция (а-в), они же при действии минимальной (г-е) и максимальной (ж-и) концентрации гипохлорита кальция.
Масштаб: а, г, ж - 500 нм; д, е, з, и - 200 нм. Препарат контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу.
мг/л. В результате эксперимента установлено, что при концентрациях гипохлорита кальция, равных 1,2 и 0,6 мг/л, клетки энтерококков остаются жизнеспособными даже после 30-минутной обработки.
Выявленная на клеточном уровне и подтвержденная с помощью сканирующей и трансмиссионной микроскопии устойчивость бактерий рода Enterococcus в присутствии органических веществ к действию гипохлорита кальция особенно нежелательна в аспекте загрязнения и самих водоемов, используемых для получения питьевой воды, и состояния водопроводных сетей. Микроорганизмы, попадая (даже после обработки хлором или хлорсодержащими соединениями) в водопроводные сети начинают снова развиваться в благоприятных для них условиях и становятся потенциальным источником вторичного микробного загрязнения на изношенных участках и при возникновении аварийных ситуаций. При обработке природных вод, содержащих органические вещества и микроорганизмы, наблюдается возникновение биологического обрастания внутри мембранных модулей [3, 6]. В результате применения в качестве дезинфектанта хлора, как правило, происходит частичное
разрушение биопленок, образуются легкоокисляемые органические соединения, что способствует активному вторичному микробному росту [12, 13, 17|.
Таким образом, самый распространенный способ обеззараживания воды - хлорирование не является эффективным в отношении энтерококков, что требует повышенного внимания к их содержанию в питьевой воде и разработке методов, которые будут эффективны по отношению к бактериям рода Enterococcus.
Работа выполнена в ЦКП «Ультрамикроанализ» при финансовой поддержке Фeдepaльного агентства по науке и инновациям, гос. контракт № 02.512.11.2168, и в рамках бюджетного проекта № 01201052127.
Литер атур а
1. Землянская A. Н. // Экологические проблемы промышленных
регионов. - Екатеринбург, 2006. - С. 273-274.
2 . Колесник Ю. Р. // Вода и водоочистные технол. - 2003. - №
4. - С. 57-58.
3 . МенчаМ. Н. // Вестн. Полоцк. гос. ун-та. - 2006. - № 9. - С.
162-168 .
11
гиена и санитария
2/2012
4. Павлова О. Н., Дрюккер В. В., Косториова Т. Я., Никулина И. Г. // Сиб. экол. журн. - 2003. - № 3. - С. 267-272.
5. Парфенова В. В., Кравченко О. С., Павлова О. Н. // Сиб. мед. журн. - 2008. - Т 78, № 3. - С. 78-81.
6 . Нервов А. Г., Андрианов Э. А., Теличенко Э. А. // Рос. хим. журн. Сер.: «Критические технологии. Мембраны». - 2004. - № 1. - С. 3-18.
7. Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов: Метод. указания 4.2.18840004. - M.; 2005.
8 . Селезнев Г. М., Лыков С. М., Буракова Ю. В. и др. // Безопас-
ность труда в промышленности. - 2007. - № 2. - С. 64-67.
9 . Фомин Г. С. Вода. Контроль химической, бактериальной и
радиационной безопасности но международным стандартам. - М., 2002.
10 . Butterfield P. W., Camper A. K., Ellis B. D., Jones W. L. // Water Resource. - 2002. - Vol. 36, N 17. - P. 4391-4405.
11. Drucker V V., Panasyuk E. Yu. // Hydrobiologia. - 2006. - Vol. 568. - P. 267-271.
12 . FlemmingH.-C., Griebe T. // Biofouling of industrial waters and
processes. - Chichester, 2000. - P. 125-141.
13 . Griebe Т., Flemming H.-C. // Desalination. - 1998. - Vol. 118. -
P. 153-156.
14. Laplace J.-M., ThuaultM., Hartke A. et al. // Curr. Microbiol. -
2007. - Vol. 34. - P. 284-289.
15. ReynoldsE. S. // J. Cell Biol. - 1963. - Vol. 17. - P. 208-212.
16 . Sun Fu. Chen Ji-ning, Tong Qing-yuan, Zeng Si-yu. // Chin. J.
Environ. Sci. - 2006. - Vol. 27, N 4. - P. 665-668.
17 . WuertzS., SpaethR., Hinderberger A. et al. // Water Sci. Technol.
- 2001. - Vol. 43, N 6. - P. 25-34.
Поступила 04.04.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 614.77:632.118.3]-074
В. С. Громова, О. А. Пчеленок, Н. М. Козлова
ВЛИЯНИЕ ВОЗРАСТАЮЩИХ УРОВНЕЙ РАДИАЦИОННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЧВЫ
на биохимический состав растений
Государственный университет - учебно-научно-производственный комплекс, Орел
Статья посвящена влиянию радиационного излучения на изменение биохимического состава растений. Объекты исследования - различные виды растений: рапс, фасоль, чечевица. Исследование носит фундаментальный характер. Цель работы - изучение взаимосвязи между изменениями некоторых показателей биохимического и минерального состава растений и уровнями радиационного загрязнения почвы. Методики общепринятые. Основные результаты: радиационное загрязнение темно-серой лесной почвы способствует изменению биохимического состава семян растений даже при уровне цезия-137 (137Cs) в пределах современных временно допустимых уровней (ВДУ) (600 Бк/кг): увеличиваются концентрации солей калия, фосфора, аммиачного азота, катехинов, сахарозы, некоторых аминокислот. При уровне 137Cs в почве, превышающем ВДУ, биохимические изменения в семенах зависят от вида растений: в семенах рапса продолжается процесс дополнительного образования сахарозы и аминокислот, но менее интенсивно, чем при более низкой радиации; в семенах фасоли отмечается достоверная положительная корреляция увеличения количества катехинов.
Ключевые слова: почва, радиационное загрязнение, биохимический состав растений
V S. Gromova, О. А. Pchelenok, N. M. Kozlova - IMPACT OF THE INCREASING LEVELS OF SOIL RADIATION POLLUTION ON THE BIOCHEMICAL COMPOSITION OF PLANTS
State University - Training-Research-Production Complex, Oryol
The study was undertaken to study a relationship between the changes of some parameters of the biochemical and mineral composition of different plants, such as rape, pods, and lentil, and the levels of soil radiation pollution, by using the conventional methods.
Radioactive pollution of dark-greyforest soils was found to cause a change in the biochemical composition of plant seeds even at the level of cesium 137 (137Cs) within the present temporary permissible levels (TPL) (600 Bq/kg): there were elevated concentrations of salts of potassium, phosphorus, ammonia nitrogen, catechols, sucrose, and some amino acids. With the radioactive cesium level exceeding the TPL, biochemical changes in the seeds depended on the species of the plants: in the rape seeds, the additional formation of sucrose and amino acids continued, but less intensively than with its lower radiation; the pod beans were significantly positively correlated with the increasing amounts of catechols.
Key words: soil, radiation pollution, biochemical composition ofplants
Биохимический состав растений является относительно стабильным в изменяющихся, в том числе стрессовых, условиях окружающей среды. В настоящее время постоянным стрессором для растений во многих регионах стало повышенное радиоактивное загрязнение почвы. Действие ионизирующей радиации на растения изучается давно. Написаны обзоры по исследованию радиобиологических эффектов у растений, в том числе возникновение хромосомных аберраций, хлорофильных
Громова В.С. - д-р биол. наук, проф. каф. "Охрана труда и окружающей среды" ([email protected]); Пчеленок О.А. - канд. с.х. наук,доц., зав. каф.; Козлова Н.М. - аспирант каф.
мутаций, изменение р адиочувствительно сти растений и т. п. В основном опыты проводились в лабораторных условиях на определенных органах растений при контролировании набора и интенсивности факторов. До аварии на Чернобыльской АЭС сотрудниками Центрального НИИ агрохимического обслуживания сельского хозяйства и подведомственных агрохимических станций проведена обширная серия исследований, посвященных изучению закономерностей поведения естественных и искусственных радионуклидов в системе почва - растения. Основными источниками поступления радионуклидов в растения считались материнская порода почвы и средства химизации сельского хозяйства [1, 7]. В современных
12
