CC BY
20
УДК 612.821.6:615.355
ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДА PRO-GLY-PRO НА УСТОЙЧИВОСТЬ КРЫС К ОСТРОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ И ПОСТГИПОКСИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ПОВЕДЕНИЯ
С.Е. Эдеева, К.Е. Багликова, Г.Н. Копылова, Г.Е. Самонина, Б.А. Умарова, З.В. Бакаева, Р.Д. Платонова
(кафедра физиологии человека и животных; e-mail: [email protected])
Введение
Проблема фармакологической коррекции ги-поксических состояний относится к числу приоритетных. Актуальность и значимость поиска, отбора и разработки антигипоксантов объясняются чрезвычайно широким распространением гипоксии, возникающей как в условиях дефицита кислорода во внешней среде, так и в результате самых различных патологических состояний, связанных с нарушением функции дыхательной, сердечно-сосудистой систем, а также транспортной функции крови (Мал-кин, Гиппенрейтер, 1977; Агаджанян, Елфимов, 1986; Лукьянова, 2002). Во всех случаях в конечном счете происходит снижение доставки кислорода к тканям до уровня, недостаточного для поддержания функции, метаболизма и структуры клетки (Лукьянова, 2002).
Наше внимание привлекло семейство глипро-линов, обладающих большим разнообразием физиологических эффектов. Данное семейство включает в себя дипептиды 01у-Рго, Рго-01у, Нур-С1у и С1у-Нур, а также трипептиды, сочетающие в разных последовательностях те же аминокислотные остатки, например Рго-О1у-Рго, 01у-Рго-Нур и т.п. Эффекты глипролинов изучены как на системном, так и на клеточном уровне. Известны их влияние на постстрессорные нарушения поведения (Бадмае-ва и др., 2005а, б; Копылова и др., 2004; Граф и др., 2006); антикоагулянтные и фибринолитические свойства (Ашмарин и др. 1998; Пасторова и др., 1998; Ашмарин и др., 2002); способность поддерживать гомеостаз слизистой оболочки желудка (Ашмарин и др., 1998; Жуйкова и др., 2003); влияние на систему микроциркуляции (Копылова и др., 2003); стабилизирующее действие на тучные клетки (Умарова и др., 2003); регуляция активности лейкоцитов ^агапаЪе й а1., 1994; Наёёох й а1., 1999) и фиб-робластов (РозйеТ^айе е! а1., 1978).
Толчком для исследования глипролинов как антигипоксантов послужило определенное структурное сходство пролина с пирацетамом, который обладает антиамнестическим и антигипоксическим эффектами (Островская и др., 2002). В пользу того что глипролины могут обладать антигипоксически-ми эффектами, свидетельствуют данные о том, что Рго-С1у-Рго и семакс в культуре тканей защища-
ют клетки феохромоцитомы крыс РС12 от окислительного стресса, увеличивая выживаемость клеток на 60 и 20% соответственно (Сафарова и др., 2003). Нейропротекторные свойства в условиях гипоксии обнаружены также в экспериментах на крысах для трипептида 01у-Рго-01и (Оиап е! а1., 2004).
Цель данной работы — выявление и исследование антигипоксических свойств трипептида Рго-С1у-Рго в условиях острой гипобарической гипоксии.
Материалы и методы исследования
Эксперименты выполнены на белых беспородных крысах-самцах весом 200—250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к пище и воде. Крыс помещали в сосуд из толстого стекла (V = 3,2 л) с плотно закрывающейся резиновой пробкой с двумя трубками. Одна из трубок была подключена к насосу, при помощи которого производили откачку воздуха из камеры, другая служила для засасывания воздуха из окружающей среды. Гипоксию создавали при разряжении атмосферы в 145 мм рт. ст., что соответствует высоте 11 500 м над уровнем моря. Подъем на "высоту" осуществляли за 1 мин.
Для оценки устойчивости животных к гипоксии определяли следующие параметры:
1) время потери позы (ВПП, с) — время от момента окончания "подъема" до того, как животное ложилось на дно камеры;
2) время жизни на "высоте" (ВЖ, с) — время от момента окончания "подъема" до остановки дыхания;
3) время реституции (ВР, с) — время восстановления активной позы животного после его извлечения из камеры.
Для каждого животного рассчитывали коэффициент индивидуальной устойчивости к гипоксии (КИУ) как отношение времени жизни к времени реституции (ВЖ/ВР).
За 15 мин до начала гипоксии животным опытной группы (п = 12) внутрибрюшинно вводили пептид Рго-С1у-Рго в дозе 1 мг/кг в объеме 0,5 мл на 200 г массы тела. Животные контрольной груп-
пы (п = 12) получали соответствующие объемы физиологического раствора.
Параметры поведенческой активности животных оценивали в тесте "Норковая камера" (НК) и "Крестообразный приподнятый лабиринт" (КПЛ) через 1 ч после окончания действия гипоксии (Бадмаева и др., 2005а, б).
В тесте "Норковая камера" регистрировали горизонтальную (длина пробега) и вертикальную (число стоек) двигательную активность, а также число обследованных норок и время затаивания. Тестирование проводили в бесстрес-сорной модификации — в тишине, при свете красной лампы мощностью 15 Вт.
В тесте "Крестообразный приподнятый лабиринт" (Копылова и др., 2004) регистрировали время пребывания на свету, время затаивания (Агее2т§-реакция), число стоек и др.
Время наблюдения в каждом тесте составило 3 мин.
Оценку уровня депрессии осуществляли по модифицированному методу Порсолта через 2 ч после окончания гипоксии (Рогеок, 1979). Животное помещали в воду при температуре 23° и в течение 10 мин регистрировали следующие параметры поведения:
1) суммарную длительность активного плавания — крыса совершает активные плавательные движения, перемещаясь внутри емкости;
2) суммарную длительность пассивного плавания — крыса производит редкие одиночные движения конечностями и хвостом, удерживая голову над поверхностью воды;
3) длительность иммобилизации — животное полностью неподвижно, над поверхностью воды выступает только нос.
Использованный в эксперименте пептид Рго-О1у-Рго был синтезирован в Институте молекулярной генетики РАН.
Статистическую обработку данных осуществляли при помощи компьютерного параметрического теста ЛКОУЛ с использованием Ь8Б-теста и непараметрического теста Вилкоксона—Манна—Уитни (критерий и).
Результаты и обсуждение
На рис. 1 представлены результаты опыта, иллюстрирующие влияние Рго-О1у-Рго на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии. Как видно на рисунке, предварительное введение Рго-01у-Рго практически не изменило время потери позы и время жизни животных на высоте. Однако при этом достоверно уменьшилось время реституции (со 141 до 88 с), т.е. на фоне пептида восстановительные процессы после гипоксии протекали быстрее. Соответственно возрос и коэффициент индивидуальной устойчивости — с 2,86 до 4,36.
Рис. 1. Влияние пептида Рго-в1у-Рго на следующие параметры острой гипобарической гипоксии.
ВПП — время потери позы на высоте, с; ВЖ — время жизни на высоте, с; ВР — время реституции, с; КИУ — коэффициент индивидуальной устойчивости.
1 — контроль (физ. р-р. + гипоксия), 2 — Рго-в1у-Рго + гипоксия. # — Р < 0,05
Оценку поведенческих параметров проводили через 1 ч после гипоксии в тестах "Крестообразный приподнятый лабиринт" и "Норковая камера". Как видно на рис. 2, гипоксия вызывала значительные нарушения поведения у животных контрольной группы. В КПЛ произошло значительное снижение времени пребывания на свету, числа стоек, свешиваний, выходов на открытые рукава лабиринта. При этом более чем в 10 раз возросло время затаивания. В тесте НК у животных контрольной группы после воздействия гипоксии достоверно снизились число стоек, число обследованных норок и длина пробега, но, так же как и в КПЛ, значительно увеличилось время затаивания. Таким образом, изменения поведения, вызванные гипоксией, оказались аналогичны постстрессорным изменениям, вызванным другими видами стресса — водноим-мерсионным (Копылова и др., 2004; Бадмаева и др., 2005а, б) и психоэмоциональным (Данилова и др., 1998). Эти изменения свидетельствуют о повышении уровня тревожности и снижении уровня ориентировочно-исследовательской активности.
Предварительное введение пептида Рго-01у-Рго привело к значительному ослаблению проявлений постгипоксических нарушений поведения. В тесте КПЛ время на свету и выходы в открытые рукава лабиринта на фоне введения пептида остались в пределах нормы, а время затаивания и число све-шиваний хотя и изменились, но достоверно меньше, чем в контроле.
В тесте НК предварительное введение Рго-01у-Рго также сопровождалось уменьшением наруше-
Рис. 2. Влияние пептида Рго-01у-Рго на поведение животных в тестах "Крестообразный приподнятый лабиринт" (А) и "Норковая камера" (Б).
1 — норма; 2 — контроль (физ. р-р + гипоксия); 3 — Рго-С1у-Рго + гипоксия; * — к норме (Р < 0,05), # — к контролю
ний поведения, вызванных гипоксией: число обследованных норок осталось в пределах нормы и в меньшей степени возросло время затаивания.
В то же время в обоих тестах введение пептида практически не предотвращало уменьшение показателей вертикальной (число стоек) и горизонтальной (длина пробега) двигательной активности.
Результаты экспериментов по исследованию влияния гипоксии на поведение животных в тесте принудительного плавания по Порсолту представлены на рис. 3. У животных контрольной группы после гипоксии значительно снизилось время активного (в 1,5 раза) и пассивного (в 2 раза) плавания, но возросло время иммобилизации (в 1,5 раза). Такие изменения свидетельствуют о существенном увеличении уровня депрессии.
Рис. 3. Влияние пептида Рго-в1у-Рго на уровень депрессии в тесте принудительного плавания по Порсолту.
1 — норма; 2 — контроль (физ. р-р + гипоксия); 3 — Рго-С1у-Рго + гипоксия. * — к норме (Р < 0,05), # — к контролю
У животных, получавших Рго-О1у-Рго за 15 мин до гипоксии, параметры, характеризующие уровень депрессии (время активного и пассивного плавания, время иммобилизации), статистически не отличались от нормы.
Итак, Рго-О1у-Рго оказывает протекторное про-тивогипоксическое действие, повышая устойчивость крыс к гипоксии и уменьшая постгипоксические нарушения поведения. При этом время жизни на высоте и время потери позы не изменялись, а наблюдаемое повышение коэффициента устойчивости обусловливалось уменьшением времени реституции. На основании этого можно полагать, что Рго-О1у-Рго влияет главным образом на постгипоксические восстановительные процессы.
Ранее были получены данные о том, что глип-ролины, в том числе Рго-О1у-Рго, оказывают положительное влияние на систему кровоснабжения:
уменьшают постстрессорные нарушения микроциркуляции в брыжейке (Копылова и др., 2003, Ко-пылова и др., 2006), препятствуют снижению кровотока в тканях желудка, вызванного введением индометацина и этанола (Самонина и др., 2001; Самонина, Жуйкова, 2001; Жуйкова и др., 2003), обладают сосудорасширяющим действием (Бакаева и др., 2003). Эти данные позволяют предполагать, что усиление кровотока и более быстрое насыщение тканей кислородом может быть одним из основных механизмов антигипоксического эффекта Рго-О1у-Рго.
* * *
Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 06—04—48833).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Агаджанян Н.А., Елфимов А.И. 1986. Функции организма в условиях гипоксии и гиперкап-нии. М.
Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ля-пина Л.А., Самонина Г.Е. 2002. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. биол., мед. и фарм. химии. № 1. 24—27.
Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ля-пина Л.А., Самонина Г.Е. 1998. Регуляторная активность простейших пролинсодержащих пептидов РО, ОР, РЯО-ОЬУ-РЯО и ОРОО и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. 63. Вып. 2. 149—155.
Бадмаева С.Е., Копылова Г.Н., А б у -шинова Н.Н., Фролков В.К., Самонина Г.Е. 2005а. Влияние глипролинов на стрессоген-ные нарушения поведения крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 91. № 5. 543—550.
Бадмаева С.Е., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. 2005б. Протекторные (профилактические) эффекты интраназального введения глипролинов (РЯО-ОЬУ-РЯО, ОЬУ-РЯО, РЯО-ОЬУ) в отношении стрес-согенных нарушений поведения крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 3—7.
Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И . Ю . 2003. Влияние глипролинов на норадре-налиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 135. № 4. 390—393.
Граф А.В., Маклакова А.С., Крушин-ская Я.В., Соколова Н.А. 2006. Пептидергиче-ская коррекция поведения половозрелого потомства белых крыс, перенесших острую гипоксию в период раннего органогенеза // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 141. № 7. 38—41.
Жуйкова С.Е., Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е. 2003. Семакс и некоторые глипролиновые пептиды ускоряют заживление ацетатных язв у крыс // Эксперимент. и клинич. гастроэнтерология. № 4. 88—92.
Копылова Г.Н., Бадмаева С.Е., Левицкая Н.Г., Самонина Г.Е., Умаро-ва Б.А., Гусева А.А. 2004. Влияние пептида Pro-Gly-Pro на изменения поведения крыс, вызванные воздействием стрессогенного фактора // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 137. № 7. 9—11.
Копылова Г.Н., Смирнова Е.А., С а н -жиева Л.Ц., Умарова Б.А, Лелекова Т.В., Самонина Г.Е. 2003. Глипролины и семакс уменьшают стрессогенные нарушения микроциркуляции в брыжейке // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 136. № 11. 497—499.
Копылова Г.Н., Смирнова Е.А., С а н -жиева Л.Ц., Умарова Б.А., Лелекова Т.В, Самонина Г.Е. 2006. Участие тучных клеток в стрессогенных нарушениях микроциркуляции брыжейки крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 6—9.
Лукьянова Л.Д. 2002. Современные представления о биоэнергетических механизмах адаптации к гипоксии // Hyp. Med. J. 10. N 3—4. 30—43.
Малкин В.Б., Гиппенрейтер Е.Б. 1977. Острая и хроническая гипоксия. М.
Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А. и др. 2002. Оригинальный ноотроп-ный и нейропротективный препарат ноопепт // Эксперимент. и клинич. фармакология. № 2. 8—10.
Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина Т . Ю . и др. 1998. Антикоагулянтные и фибриноли-тические эффекты некоторых пролинсодержащих пептидов // Изв. РАН. Сер. биол. № 3. 390—394.
Самонина Г.Е., Жуйкова С.Е. 2001. Гомео-стаз слизистой оболочки желудка и кровоток. Сообщ. 1. Механизмы поддержания адекватного кровотока в слизистой оболочке желудка // Усп. физиол. наук. 32. № 4. 60—72.
Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Сергеев В. И. и др. 2001. Коррекция кровотока желудка как один из возможных механизмов противоязвенных эффектов коротких пролинсодержащих пептидов // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 87. № 11. 1488—1492.
Сафарова Э.Ф., Шрам С.И., Золотарев Ю.А. 2003. Влияние пептида семакс на выживаемость культивируемых клеток феохромоцитомы крысы при окислительном стрессе // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 135. № 3. 309-313.
Умарова Б.А., Копы лова Г.Н., Смирнова Е.А., Гусева А.А., Жуйкова С.Е. 2003. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-пролина и семакса // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 137. № 10. 371—373.
Ashmarin I.P., Samonina G.E., Lya-pina L.A., Kamenskii A.A., Livetskaya N.G., Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Andreeva L.A., Myasoedov N.F. 2005. Natural and hybrid ("chimeriс") stable regulatory glyproline peptides // Pathophysiology. N 11. 179—185.
Guan J., Thomas G.B., Lin H. etal. 2004. Neuroprotective effects of the N-terminal tripeptide of in-
sulin-like growth factor-1, glycine-proline-glutamate (GPE) following intravenous infusion in hypoxic-ischemic adult rats // Neuropharmacology. 47. N 6. 892—903.
Haddox L.J., Pfister R.R., Muccio D.D. et al. 1999. Bioactivity of peptide analogs of the neutrophil chemoattractant, N-acetyl-proline-glycine-proline // Inves. Ophthalmol. and Visual Science. 40. 2427—2429.
Porsolt R.D. 1979. Animal model of depression // Biomedicine. 30. N 3. 139—140.
Postlethwaite A., Seyer J., Kang A. 1978. Chemotactic attraction of human fibroblasts to type I, II and III collagens and collagen-derived peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. N 75. 871—875.
Watanabe T., Sagara Y., Sugahara K., Kodama H. 1994. Iminodipeptides containing proline with C-terminal and N-terminal residues prime the stimulation of human neutrophil superoxide generation by fMLP // Biochem. Biophys. Res. Commun. 205. N 1. 758—764.
Поступила в редакцию 26.03.07
INFLUENCE THE PEPTIDE PRO-GLY-PRO TO STABILITY
OF RATS TO ACUTE HYPOBARIC HYPOXIA
AND POSTHYPOXIC DISTURBANCES OF BEHAVIOUR
S.E. Edeeva, K.E. Baglikova, G.N. Kopylova, G.E. Samonina, B.A. Umarova, Z.V. Bakaeva, R.D. Platonova
Outbred white rats treated to action of acute hypobaric hypoxia in a pressure chamber at rarefaction of an atmosphere of 145 mm hg. Parameters of behavioural activity estimated in the elevated plus-maze, hole-board and Porsolt's test. Postgypoxic changes of behaviour were characterized by increase of a level of anxiety and depression, but decrease in a level of orientational-investigative activity. Preliminary introduction of peptide (15 minutes prior to hypoxia, 3,7 micromol/kg, i/p) raised factor of individual stability of animals to hypoxia due to decrease in time of restitution and considerably reduced posthypoxic disturbances of behaviour. The assumption is done, that one of the important mechanisms ptotective antihypoxic effect of PRO-GLY-PRO can be the ability of this peptide to render positive influence on a hemostasis and to support adequate blood flow of bodies and tissues.
