CC BY
18
ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.821.6
ПРОТЕКТОРНЫЕ (ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ) ЭФФЕКТЫ ИНТРАНАЗАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ГЛИПРОЛИНОВ (РКО-ОЬУ-РКО, ОЬУ-РИО, РИО-ОЬУ) В ОТНОШЕНИИ СТРЕССОГЕННЫХ НАРУШЕНИЙ ПОВЕДЕНИЯ КРЫС
С.Е. Бадмаева, Г.Н. Копылова, Г.Е. Самонина, Б.А. Умарова, Н.Н. Абушинова
(кафедра физиологии человека и животных)
Введение
В последние годы короткие пептиды, содержащие глицин и пролин, были выделены в особое семейство — глипролины. К этому семейству относятся Рго-01у-Рго, 01у-Рго, Рго-01у, цикло-Рго-01у и некоторые другие пептиды (Ашмарин и др., 2002). В организме глипролины могут, по-видимому, образовываться в процессе синтеза и распада коллагена, эластина и некоторых пищевых белков (Ашмарин и др., 1998, 8ашотпа й а1., 2002).
У глипролинов выявлен весьма широкий спектр физиологической активности. Убедительно показано стабилизирующее влияние Рго-01у-Рго, Рго-С1у и С1у-Рго на гомеостаз слизистой оболочки желудка при ульцерогенных воздействиях различной природы (Жуйкова и др., 2003, Бакаева и др., 2004, Жуйкова и др., 2004). Известны эффекты глипролинов, связанные с их влиянием на гемостаз: они активируют функции противосвер-тывающей системы и подавляют процессы тром-бообразования (Пасторова и др., 1998, Ашмарин и др., 2002). Помимо улучшения реологических свойств крови глипролины, вероятно, могут участвовать и в регуляции сосудистого тонуса (Бакаева и др., 2003). Обнаружено наличие у глипролинов протекторных свойств в отношении стрессогенных нарушенной микроциркуляции в брыжейке крыс (Копылова и др., 2003) и их стабилизирующее влияние на стимулированную стрессом секреторную активность тучных клеток (Умарова и др., 2003).
Наименее изучена возможность и эффективность действия глипролинов на уровне структур ЦНС. Ноотропная и анксиолитическая активность обнаружена у цикло-Рго-С1у при его внутрибрю-шинном введении (Гудашева и др., 1996, Гудаше-ва и др., 2001). При использовании Рго-С1у-Рго, меченного радиоактивным тритием, была непосредственно показана возможность проникновения этого пептида и его метаболитов через гематоэн-цефалический барьер (Васьковский и др., 2003,
Золотарев и др., 2003). Интересно отметить, что уровень радиоактивной метки в мозге при им-мобилизационном стрессе значительно возрастал. Увеличение проницаемости ГЭБ в отношении веществ белковой природы при действии умеренного стресса наблюдали также Banks и Kastin (1987).
Данные литературы о влиянии глипролинов на поведение животных весьма ограничены и противоречивы. Заметного влияния пептида Pro-Gly-Pro на большинство показателей поведенческих реакций интактных крыс в тестах "Открытое поле" и "Норковая камера", а также на выработку пище-добывательного рефлекса в Т-образном лабиринте и при исследовании уровня пищевой мотивации выявлено не было (Левицкая и др., 2000). При предварительном внутрибрюшинном введении Pro-Gly-Pro отмечено лишь увеличение латентного периода первой иммобилизации в тесте Порсолта и увеличение уровня аффективных реакций в тесте подныривания по Хендерсону (Козловская и др., 2002).
Ранее мы обнаружили, что трипептид Pro-Gly-Pro и дипептид Gly-Pro при внутрибрюшин-ном введении оказывают выраженное протекторное действие в отношении нарушений поведения крыс, подвергавшихся стрессогенному воздействию, предотвращая значительное повышение тревожности и снижение уровня ориентировочно-исследовательской активности животных (Копы-лова и др., 2004, Бадмаева и др., в печати). Это позволило предположить возможность прямого действия данных пептидов на структуры ЦНС, участвующие в формировании ответной реакции организма на действие стрессогенного фактора.
Следует отметить, что введение препаратов путем инъекции (тем более внутрибрюшинной) не всегда удобно, а вне клиники может вызывать затруднения. При подкожном и внутримышечном введении всасывание и транспорт препаратов к органам-мишеням происходит относительно медленно. Значительно более простым и менее травматичным способом является интраназальное введение (Каменский и др., 2001). При этом вещест-
ва, всасывающиеся в области слизистой оболочки носа, минуя печень, по кровеносным и/или лимфатическим путям быстро достигают структур мозга.
Например, при подкожном введении инсулина его концентрация в крови достигает максимума лишь через 45—60 мин, а при интраназальном уже через 5—10 мин (БШскИоМ е! а1., 2004).
Особый интерес представляет возможность интраназального введения препаратов белковой и пептидной природы, так как при пероральном введении они могут инактивироваться под действием пептидаз пищеварительного тракта и ферментативных систем печени.
Целью данной работы было изучение особенностей протекторных эффектов Рго-01у-Рго, 01у-Рго и Рго-О1у в отношении стрес-согенных нарушений поведения крыс при интраназальном введении этих препаратов.
Материалы и методы
В опыте использовали беспородных белых крыс-самцов массой 200—250 г. Животные содержались в виварии в стандартных пластиковых клетках по 7 особей в каждой со свободным доступом к пище и воде. В течение 3 дней, предшествующих эксперименту, с каждой из подопытных крыс проводили процедуру "хэндлинга". В качестве стрессо-генного воздействия использовали 10-минутное принудительное плавание в воде при температуре 23°. Оценку поведенческих параметров проводили через 15 мин после окончания действия стрессора. Ориентировочно-исследовательскую активность и уровень тревожности животных оценивали в тестах "Норковая камера" и "Крестообразный приподнятый лабиринт". Норковая камера представляла собой ящик размером 40 х 40 х 30 см с 13 круглыми отверстиями в полу диаметром 3 см каждое. Животное помещали в центр камеры и регистрировали число стоек, число обследованных норок и время затаивания (&еег1^-реакция). Тес-
тирование проводили в бесстрессорной модификации — в тишине и при свете красной лампы мощностью 15 Вт.
Крестообразный приподнятый лабиринт использовали в модификации, имеющей следующие параметры: длина каждого из 4 рукавов лабиринта — 50 см, ширина — 15 см, высота стенок затемненных рукавов — 20 см, центральная площад-
Рис. 1. Протекторные эффекты глипролинов в отношении стрессогенных нарушений поведения. "Крестообразный приподнятый лабиринт". 1 — норма; 2 — контроль (физ. р-р + стресс). Доза пептида: 3 — 0,37 мкМ/кг; 4 — 3,7 мкМ/кг; 5 — 37 мкМ/кг. * — достоверно к норме, # — к контролю (физ. р-р + стресс), + — к дозе
3,7 мкМ/кг; Р < 0,05
ка — 10 х 10 см. Лабиринт был приподнят над полом на высоту 80 см.
Время наблюдения в каждом тесте составило 3 мин.
Животные были разделены на следующие группы: норма — интактные животные; контроль — животные, подвергавшиеся стрессорному воздействию на фоне предварительного введения физиологического раствора; опыт — животные, подвергавшиеся действию стрессора на фоне предварительного введения одного из пептидов.
Исследуемые пептиды (синтезированы в Институте молекулярной генетики РАН) вводили инт-раназально в дозах: 0,37, 3,7 и 37 мкМ/кг в объеме 50 мкл/200 г за 15 мин до действия стрессорного фактора. Интра-назальное введение осуществляли с помощью специального микрошприца объемом 100 мкл. Все препараты растворяли в физиологическом растворе непосредственно перед введением.
Статистическую обработку результатов проводили при помощи компьютерной программы ANOVA с использованием LSD-теста.
в "Крестообразном приподнятом лабиринте", так и в "Норковой камере" все показатели поведенческих реакций в этом случае достоверно не отличались от нормы, но достоверно отличались от контроля (стресс на фоне введения физиологического раствора). При использовании дозы 37 мкМ/кг выраженность протекторного противострессорного действия Pro-Gly-Pro возрастала; достоверные отличия наблюдались в отношении числа стоек и свешиваний в "Крестообразном приподнятом лабиринте" и числа стоек в "Норковой камере".
Аналогичная картина наблюдалась и при предварительном введении Gly-Pro: доза 0,37 мкМ/кг
Результаты исследований
Воздействие стрессорного фактора вызывало характерные изменения поведения крыс. Так, в тесте "Крестообразный приподнятый лабиринт" (рис. 1) значительно уменьшилось время пребывания на свету (в 2 раза), но существенно увеличилось время затаивания (более чем в 5 раз); число стоек и свешиваний, характеризующее общий уровень ориентировочно-исследовательской активности, достоверно уменьшилось. В тесте "Норковая камера" (рис. 2) резко уменьшилось число обследованных норок (в 4 раза) и число стоек (в 2 раза), но более чем в три раза возросло время затаивания. Наблюдаемые изменения поведения свидетельствуют о том, что стресс, вызванный 10-минутным принудительным плаваньем, значительно повышал тревожность животных и снижал общий уровень ориентировочно-исследовательской активности.
Введение Pro-Gly-Pro в дозе 0,37 мкМ/кг не оказывало достоверного влияния на выраженность стрессогенных нарушений поведения. Однако если стрессорное воздействие осуществляли на фоне предварительного введения Pro-Gly-Pro в дозе 3,7 мкМ/кг, постстрессорные изменения поведения практически отсутствовали. Как
Рис. 2. Протекторные эффекты глипролинов в отношении стрессогенных нарушений поведения. "Норковая камера". Обозначения те же, что и
на рис. 1
была неэффективна, а доза 3,7 мкМ/кг практически полностью предотвращала стрессогенные нарушения поведения. При использовании дозы 37 мкМ/кг выраженность протекторного противо-стрессорного действия С1у-Рго несколько возрастала, однако достоверных отличий от дозы 3,7 мкМ/кг выявлено не было.
При предварительном введении пептида Рго-С1у наблюдалась лишь некоторая тенденция к ослаблению стрессогенного влияния на поведение животных, причем эффективность протекторного действия не возрастала с увеличением дозы.
Таким образом, при интраназальном введении пептиды Рго-С1у-Рго и С1у-Рго оказывают выраженное протекторное действие в отношении нарушений поведения крыс, подвергавшихся стрес-сорному воздействию, предотвращая значительное повышение тревожности и снижение уровня ориентировочно-исследовательской активности в тестах "Крестообразный приподнятый лабиринт" и "Норковая камера". Минимальной эффективной дозой пептидов Рго-С1у-Рго и С1у-Рго, обеспечивающей существенное протекторное действие, является доза 3,7 мкМ/кг.
Пептид Рго-С1у ни в одной из исследованных доз не оказывал выраженного протекторного
действия в отношении стрессогенных нарушений поведения.
В нашей предшествующей работе были исследованы аналогичные протекторные эффекты глип-ролинов в условиях внутрибрюшинного введения (Бадмаева и др., в печати). Сопоставление результатов внутрибрюшинного и интраназального введений показало, что эффективность протекторного действия при интраназальном способе введения даже несколько выше, чем при внутрибрюшин-ном, хотя достоверных различий между разными способами введения нет.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что при интраназальном введении, так же как и при внутрибрюшинном, пептиды Рго-С1у-Рго и С1у-Рго могут оказывать воздействие на структуры ЦНС, участвующие в формировании ответной реакции организма на действие стрессора. Эффективность протекторного действия Рго-С1у не проявилась при обоих способах введения.
Учитывая простоту и меньшую травматичность интраназального введения при равной эффективности протекторного действия, по-видимому, при дальнейшем изучении центральных эффектов этих пептидов целесообразно сосредоточить внимание именно на интраназальном введении.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Ашмарин И.П., Каменский А.А., Ля-пина Л.А., Мясоедов Н.Ф., Самони-н а Г . Е . 2002. Глипролины как самостоятельные регуляторы и стабилизаторы других пептидов // Вопр. мед. биол. и фарм. химии. № 1. 24—27.
Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ля-пина Л.А., Самонина Г.Е. 1998. Регулятор-ная активность простейших пролинсодержащих пептидов Pro-Gly, Gly-Pro, Pro-Gly-Pro и Gly-Pro-Gly-Gly и возможные источники их биосинтеза // Биохимия. 63. Вып. 2. 149—155.
Бадмаева С.Е., Копы лова Г.Н., А б у -шинова Н.Н., Самонина Г.Е., Умаро-в а Б . А . 2005. Влияние глипролинов на стрессогенные нарушения крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. В печати.
Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю, Самонина Г.Е. 2003. Влияние глипролинов на норадреналиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 135. № 4. 390—393.
Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Же-лязник Н.Я., Самонина Г.Е. 2004. Протекторный эффект внутрибрюшинного и внутрижелудоч-ного введения PGP на этаноловое эрозирование и ацетатное язвообразование у крыс // Эксперимент. и клин. гастроэнтерология. № 4. 82—84.
Васьковский Б.В., Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Бакаева З.В. 2003. Изуче-
ние распределения [3Н] Pro-Gly-Pro в организме крыс // Вопр. мед. биол. и фарм. химии. № 3. 45—47.
Гудашева Т.А., Бойко С.С., Акпа-ров В.Х., Островская Р.У., Розанцев Г.Г., Воронина Т.А., Жердев В.П., Середе н и н С . Б . 1996. Идентификация в мозге крыс цикло-пролилглицина, нового эндогенного пептида с ноотропной активностью // Докл. РАН. 350. № 6. 834—836.
Гудашева Т.А., Константинопольский М.А., Островская Р.У., Середе-н и н С . Б . 2001. Анксиолитическая активность эндогенного ноотропного дипептида циклопролилглицина в тесте приподнятого крестообразного лабиринта // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 131. № 5. 547—550.
Жуйкова С.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2003. Дифференцированные противоязвенные эффекты возможных метаболитов пептида Pro-Gly-Pro — Pro-Gly и Gly-Pro — на этаноловой и стрес-сорной моделях вызова язв у крыс // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 2. 20—22.
Жуйкова С.Е., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. 2004. Противоязвенные эффекты трипептида PGP и его возможных метаболитов — PG и GP, глицина и пролина — на разных моделях вызова язв у крыс // Изв. РАН. Сер. биол. № 5. 585—588.
Золотарев Ю.А., Жуйкова С.Е., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф., Васьковский Б.В., Самонина Г.Е. 2003. Метабо-
лизм пептида Рго-в1у-Рго при разных способах введения // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 135. № 4. 423—426.
Каменский А.А, Воскресенская О.Г., Дубынин В.А., Левицкая Н.Г. 2001. Зависимость физиологических эффектов ряда нейропептидов от пути введения // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 87. № 11. 1493—1501.
Козловская М.М., Козловский И.И., Вальдман Е.А., Середенин С.Б. 2002. Се-ланк и короткие пептиды семейства тафтсина в регуляции адаптивного поведения при стрессе // Журн. высш. нервн. деятельности. 88. № 6. 751—761.
Копы лова Г.Н., Смирнова Е.А., С а н -жиева Л.Ц., Умарова Б.А., Лелекова Т.В., Самонина Г.Е. 2003. Глипролины и семакс уменьшают стрессогеные нарушения микроциркуляции в брыжейке // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 136. № 11. 497—499.
Копы лова Г.Н., Бадмаева С.Е., Левицкая Н.Г., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Гусева А.А. 2004. Влияние пептида Рго-в1у-Рго на изменения поведения крыс, вызванные воздействием стрессогенного фактора // Бюл. эксперимент. биол. и мед. 137. № 7. 9—11.
Левицкая Н.Г., Латышева Н.В., Андреева Л.А., Каменский А.А. 2000. Поведенческие эффекты трипептида Pro-Gly-Pro // Вестн. Моск. ун-та Сер. Биология. № 2. 17—22.
Пасторова В.Е., Ляпина Л.А., Смолина Т.Ю., Ашмарин И.П. 1998. Антикоагу-лянтные и фибринолитические эффекты коротких про-линсодержащих пептидов // Изв. РАН. Сер. биол. № 3. 390—394.
Умарова Б.А., Копы лова Г.Н., Смирнова Е.А., Гусева А.А., Жуйкова С.Е. 2003. Секреторная активность тучных клеток при стрессе — влияние пептидов пролил-глицил-пролина и се-макса // Бюл. эксперимент. биол.и мед. 136. № 10. 371—373.
Samonina G.E., Ashmarin I.P., Lya-p i n a L . A . 2002. Glyproline peptide family: review on bioactivity and possible origins // Pathophysiology. N 8. 229—234.
Stockhorst U., de Fries D., Steing-rueber H.J., Scherbaum W.A. 2004. Insulin and the CNS: effects on food intake, memory, and endocrine parameters and the role of intranasal insulin administration in humans // Physiol. Behav. 83. N 1. 47—54.
Поступила в редакцию 24.01.05
PROTECTIVE (PROPHYLACTIC) ANTISTRESS EFFECTS INTRANASAL ADMINISTRATION OF GLYPROLINES (PRO-GLY-PRO, GLY-PRO, PRO-GLY) IN THE CASE OF STRESS DISTURBANCES OF BEHAVIOR OF RATS
S.E. Badmaeva, G.N. Kopylova, G.E. Samonina, B.A. Umarova, N.N. Abushinova
Protective antistress effects of intanasal administration of glyprolines — Pro-Gly-Pro, Pro-Gly and Gly-Pro in the doses 0,37; 3,7 and 37 mkmol/kg were studied. Stress influences (forced-swimming for 10 min) produced typical changes of behavioural activity in the elevated pluz-maze and the hole-board tests. These changes lead to significant increase of anxiety and decrease of level of orientational-investigative activity. Preluminal (15 minutes before stress agent) administration of Pro-Gly-Pro and Gly-Pro at the doses of 3,7 mkmol/kg significantly decreased stress disturbances of behavior, preventing the substantially increase of anxiety and decrease of level of orientational-investigative activity. During increase the dose to 37 mkmol/kg protective effects of Gly-Pro didn't essentially increase, while protective effects of Pro-Gly-Pro became more pronounced. The dose 0,37 mkmol/kg were ineffective.
The peptide Pro-Gly didn't provide considerable protective action in the case of stress disturbances of behavior in non-affiliated investigate doses.
