ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ ЯДА СРЕДНЕАЗИАТСКОЙ КОБРЫ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Open access journal

www.in-academy.uz

«tes?

IJRASMN journal OF

TECHN01:0GY AND INNOVATION

» w. щР

ВЛИЯНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ПЕПТИДОВ ЯДА СРЕДНЕАЗИАТСКОЙ КОБРЫ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС ШИРИНОВА И.А.

ГУЛИСТАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ARTICLE INFO

ABSTRACT

Received: 08th January 2024 Accepted: 15th January 2024 Online: 16th January 2024 KEY WORDS

Адп, дх, яд, кобра, среднеазиатская кобра, митохондрии.

Малые пептиды (С-3-Б-бета) яда среднеазиатской кобры замедляют окисление суксината в митохондриях печени крыс. Снижение уровня окислительного фосфорилирования (У3) приводит к резкому снижению индекса дыхательного контроля и соотношения АДФ/Г. Этот пептид в первую очередь снижает активность сукцинатоксидазы, а затем и ротенон-чувствительной НАД.Н-оксидазы.

Обнаружено незначительное повышение содержания ротенон-чувствительной НАДН-оксидазы,

практически не влияющей на цитохром-оксидазу и цитохром-зависимые сукцинат-, НАДН-оксидазы.

Известно, что помимо фосфолипазы А2, цитотоксинов и нейротоксинов, распологающихся во фракции С-2, в яде кобры присутствуют и другие компоненты с молекулярным весом ниже 3000-4000 (1,2). Они также действуют разобщающе на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий (3). Следует отметить, что выход фракций С-3 при гельфильтрации яда среднеазиатской кобры всего лишь 1% (1,2). Ясно, что в общем механизме действия яда на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий вклад низкомолекулярных пептидов невелик. Несмотря на это, они могут представлять существенный интерес как инструмент для изучения структуры и функции биологических мембран, в частности мембран митохондрии, благодаря достаточно выраженному эффекту и небольшим размерам что позволит определить их структуру и провести направленные модификации функционально значимых групп.

Вызывало интерес сравнительное исследование мембраноактивных свойств низкомолекулярных пептидов яда кобры в отношении их действия на окислительное фосфорилирование и активности полиферментных систем митохондрий.

Низкомолекулярные пептиды яда кобры выделили по методу (1,2). Митохондрии печени крыс выделяли методом дифференциального центрифцгирования (4). Скорость потребления кислорода в различных метаболических состояниях митохондрий, величину дыхательного контроля по Чансу (ДКч) и коэффицент АДФ/0,

Open access journal

www.in-academy.uz

активность полиферментных систем мембран митохондрий измеряли полярографически (5). Содержание белка определяли по методу Лоури.

Влияние низкомолекулярных пептидов яда кобры на дыхание и окислительное фосфорилирование митохондрий. Значителные изменения функционального состояния митохондрий при непосредственном влиянии фракции С-3 в зависимости от его концентрации наблюдались начиная с 1.8 мкг. на 1 мг белка митохондрий (табл.1). При этом фракция С-3 вызывает торможение дыхания митохондрий в различных метаболических состояниях. Особенно значительное подавление дыхания митохондрий в состоянии 3 на (41,3%) приводило к снижению величины ДКч на 25.6%. Однако коэффициент АДФ/0 не отличается от контроля. С увеличением концентрации пептидов ингибирование переноса электронов от сукцината до молекулярного кислорода по дыхательной цепи митохондрий усиливается. При этом уменьшение дыхания митохондрий особенно заметно протекает в состоянии 3. Так, если в присутствии 4,8 мкг пептидов на 1 мг белка митохондрий , дыхание митохондрий в состоянии 3 уменьшается на 75,5% , то в состоянии 2, 4 и в присутствии разобщителя -на 50 , 20 и 25% соответственно от контроля. При этом величины ДКч и коэффициент АДФ/0 теряется полностью. Таким образом, низкомолекулярные пептиды яда среднеазатской кобры способны блокировать в первую очередь АТФ-синтетазной , а затем дыхательной функции митохондрий.

Полученные результаты показывают, что фракция С-3, как фракция С-2 яда кобры подавляла дыхание митохондрий в метаболическом состоянии 3, величину ДКч и коэффициент АДФ/0. Действие фракций С-2 и С-3 на энергетический обмен митохондрий в фософрилирующем состоянии совпадает с действием цельного яда, однако по признакам активации или ингибирования дыхания митохондрий в метаболических состояниях 2 и 4 не совпадает с действием цельного яда. Ранее нами было показано (6), что цельный яд кобры в низких концентрациях повышает дыхание митохондрий в состоянии У4 и уменьшает в состоянии Уз. В отличие от цельного яда фракция С-2 дозозависимо повышает дыхание митохондрий в этих состояниях, а фракция С-3, напротив, является ингибитором дыхания митохондрий в метаболическом состоянии 4 и особенно в состоянии 2. В этом соотношении наши результаты не согласуются с данными Р. Саттыева (3). Он показал, что уменьшение окислительного фосфорилирования митохондрий под действием фракции С-з происходит совместно с повышением дыхания в состоянии 4.

В таблице 1 приведены результаты изучения действия пептидов фракции С-3-Б-1У-бета яда кобры на различные параметры функционального состояния митохондрий печени. Данный пептид в концентрации 0,8 мкг/мг белка митохондрии подавляет скорость окисления сукцината в состояниях 2, 3 и 4 и в присутствии разобщителя на 22,3; 34,7; 20,0 и 11,2% соответственно от контрольного уровня. Это приводит к уменьшению величины ДКч на 19,1%. Однако коэффициент АДФ/0 почти не меняется. Повышение действующей концентрации данного пептида приводитк дальнейшему понижению скорости потребления кислорода митохондриями в различных метаболических состояниях, в том числе и коэффициента АДФ/0. Так в присутствии 1,3 мкг/мг пептида дыхание митохондрий в состояниях 2, 3, 4 и в присутствии

Open access journal

www.in-academy.uz

динитрофенола уменьшается на 44,5; 58,7; 38,9 и 17,7% соответственно. При этом величина ДКч и АДФ/0 уменьшается на 32,5 и 19,6%. С увеличением дозы пептида ингибирование дыхания и окислительного фосфорилирования значительно усиливается. В присутствии пептида в дозе 4,8 мкг/мг белка дыхание митохондрий 2, 3, 4 и ДНФ снижается на 58,4; 81,9; 39,0; 35,8% соответственно, а величины ДКч и АДФ/0 исчезает полностью.

Влияние фракций С-3 и С-3-Б-1У-бета яда кобры на дыхание и окислительное

юсфорилирование митохондрий печени крыс (M±m n=6-8)

Концентрация Скорость дыхания, нгатом

мкг/мг белка кислорода/мин ДК (У3;У4) АДФ/0

митохондрий на мг белка митохондрий

У2 Y3 У4 Уднф

Ф ракции С-3

0 24±2 114±3 34±2 180±4 3,36±0,09 1,85±0,06

0,6 31±3 99±4 33±3 186±5 3,00±0,10 1,84±0,07

1,2 27±2 78±3 30±2 167±4 2,60±0,08 1,80±0,06

1,8 24±2 67±3 27±2 160±3 2,50±0,08 1,65±0,06

2,4 21±2 51±3 24±2 156±3 2,13±0,07 1,50±0,05

3,0 20±1 45±2 24±1 149±2 1,87±0,06 1,30±0,05

3,6 20±1 39±1 25±1 140±1 1,58±0,05 1,15±0,04

4,2 18±1 33±1 27±1 138±1 1,22±0,05 1,06±0,04

4,8 17±1 28±1 27±1 135±1 ингибирование У3

С-3-Б-1У-бета

0 36±3 121±4 36±3 187±5 3,36±0,10 1,84±0,07

0,8 28±2 79±2 29±2 168±4 2,72±0,08 1,79±0,06

1,3 20±2 50±2 22±2 154±3 2,27±0,07 1,48±0,05

2,0 11±1 38±2 22±1 138±3 1,73±0,06 1,14±0,04

2,5 15±1 22±2 22±2 120±3 ингибирование У3

Примечание: Для измерения потребления кислорода митохондрий печени крыс использовали среду инкубации следующего состава: 0,23 М, трис-НС1- буфер 10Мм, К Н2РО4 5 Мт? РН 7,4, сукцинат 10 Мм (рН 7,4). Реакцию начинали добавлением суспензии митохондрий (3-4 мг.мл). Концентрация АДФ-200 мкМ, 2,4-динитрофенол (2,4-ДНФ)-5х10-5 М.

Таким образов пептид С-3-Б-ГУ-бета яда кобры в первую очередь влияет на АТФ-синтезирующую, а затем и дыхательную функцию митохондрий. По эффективности действия на параметры сопряжения митохондрий пептид С-3-Б-ГУ-бета оказался в 3 раза активнее по сравнению с аналогичным количеством фракции С-3 и в 3 раза -цельного яда (6). В последнее время определённое внимание уделяется анализу дыхания митохондрий в состоянии покоя (состояние 4) (7, 8). При его исследовании обнаружено, что ингибиторы дыхательной цепи (антимицин, калий цианид и др.), подавляя дыхание в метаболическом состоянии 4, одновременно снижают и мембранный потенциал. Согласно указанным исследованиям, такое снижение вызвано

Open access journal

www.in-academy.uz

постоянной утечкой протонов через внутреннюю мембрану митохондрий. Этот факт заслуживает в том смысле, что для мембран характерна проницаемость, которая рассеивает часть энергии дыхания в виде тепла. Следует отметить, что этот феномен ещё недостаточно исследован и пока не ясен его механизм, обусловливающий такую утечку протонов.

Таким образом, низколомолекулярный пептид С-3-Б-1У-бета яда кобры, как олигомицин, специфический ингибитор, подавляющий фосфорилирование, сопряжённое с электрическим транспортом. Отсюда можно предположить, что пептид С-3-Б-ГУ-бета проявляет способность уменьшить протонную проводимость мембран. По данным М.Н.Кондрашовой (7), дыхание митохондрий в состоянии 4 можно рассматривать как более отвечающее физиологическим условиям, чем сотояние активного дыхания (Уэ).

Влияние низкомолекулярных пептидов яда кобры на активность полуферментных систем мембран митохондрий. В таблице 2 показано действие пептидов яда кобры на активность полиферментных ситем мембран митохондрий печени в зависимости от концентрации этих соединений в среде инкубации.

Влияние функции С-3 яда кобры на активность полиферментных систем мембран митохондрий печени крыс (М±т п=6-8)

Концетр ация Мкг/мг белка Активность нанограмматом кислорода/мин. мг. белка

Сукцинат-оксидаза Ротенончувст-вительная НАДН-оксидаза Ротеноннечувст-вительная НАДН-оксидаза Цитохром с-оксидаза

0 170±6 49±3 9,7±1,0 420±25

5 109±5 43±2 11,4±0,8 422±23

10 99±5 42±2 11,1±0,6 410±21

15 91±4 39±2 12,2±0,5 39,5±22

20 80±3 37±1 12,3±0,4 388±20

40 11±2 35±1 12,4±0,4 395±19

60 51±2 31±1 12,5±0,3 390±18

Примечание: часть митохондрий замораживали и после оттаивания измеряли НАД.Н-оксидазные , суксинатоксидазные и цитохром с-оксидазные активности, добавляя в ячейку полирографии обьёмом 1 мл 3 мкмоля НАД.Н, 10 мкмоля сукцината, 20 мкмоля аскорбата и 100 мкг цитохрома с. НАД.Н-оксидазную активность определяли также в пристуствии 2 мкг ротенона. Ротенон не влияет на внешний путь окисления НАД.Н, но полностью тормозит перенос электронов от НАД.Н по дыхательной цепи митохондрий на молекулярный кислород.

Для измерения активности полиферментных систем мембран митохондрий использовали среду следующего состава: сахароза0,66 М, трис-НС1-буфер 50мМ, гистидин 5мМ, рН 7,4. Все ферментативные активности выражали в нанограмматомах кислорода, потребляющего за 1 минуту при 25 0С в расчёте на 1мг белка митохондрий. Видно, что пептиды в первую очередь ингибируют активность сукцинатоксидазы, а затем НАД.Н-оксидазной системы дыхательной цепи митохондрий. Ингибирование

Open access journal

www.in-academy.uz

активности оксида зависит от дозы пептидов. Так, если в присутствии 40мкг пептидов на 1мг белка митохондрий активность сукцинатоксидазы уменьшается на 60%, то НАД.Н-оксидазная система дыхательной цепи ингибируется всего лишь на 27%. В то же время пептиды дозозависимо повышают активность ротеноннечувствительной НАД.Н-оксидазы и почти не влияют на активность цитохром с-оксидазной системы дыхательной цепи митохондрий.

Пептид С-3-Б-1У-бета ингибирует сукцинатоксидазную систему дыхательной цепи митохондрий (таб.3). Повышение концентрации пептида ускоряет ингибирование активности фермента. Введение в суспензию митохондрий пептила в дозе 2,5; 5,0; 10 и 20 мкг/мг белка приводит к ингибированию активности сукцинатоксидазы на 18; 23; 30 и 40% сосответственно.

Влияние пептида С-3-Б-ГУ-бета яда кобры на активность полиферментных систем мембран митохондрий (М±т п=6-8)

Активность нанограматом кислорода мин/мг белка Субстраты и добавки Концентрация пептида мкг/мг белка

0 5 10 20

Сукцинаток-сидаза Сукцинат + цитохром с 120±6 151±7 112±6 130±6 81±4 110±5 60±5 85±5

Ротенон-чувствительная НАДН-оксидаза НАДН + цитохром с 49±3 94±5 42±2 84±6 38±2 75±4 34±1 70±4

Ротенончувств ительная НАДН-оксидаза НАДН + ротенон 9,7±1,0 11,6±0,8 12,1±0,9 12,6±0, 7

Цитохром с-оксидаза Цитохром с + аскорбат 420±21 409±21 400±18 394±19

Оригинальные данные получены при определении НАД.Н-оксидазной активности. Анализ соотношения скорости окисления по ротенончувствительному и -нечувствительному пути показал, что пептид С-3-Б-ГУ-бета подавляет скорость окисления НАД.Н по дыхательной цепи и активирует примерно в такой же степени внешний путь переноса электронов (через цитохром Вб). Повышение концентрации пептида ускоряет отклонение этих оксидаз от уровня контроля. Так, добавление в суспензию митохондрий пептида в дозе 5, 10 и 20 мкг/мг белка приводит к повышению активности ротеноннечувствительной НАД.Н-оксидазы на 19; 24 и 28%, в то же время активность НАД.Н-оксидазной системы дыхательной цепи уменьшается на 14; 18 и 25% соответственно.

Пептид С-3-Б-ГУ-бета не влияет на активность цитохром с-оксидазной системы дыхательной цепи митохондрий.

Таким образом, в присутствии пептида С-3-Б-ГУ-бета подвергается инактивации не только сукцинатоксидазная система, но также снижается активность митохондрий. Ингибирование активности сукцинатоксидазы по сравнению с НАД.Н-оксидазной

Open access journal

www.in-academy.uz

протекает с гораздо более высокой скоростью. Пептид активирует ротеноннечувствительную НАД.Н-оксидазу, но не влияет на активность цитохром с-оксидазы.Эти различия могут быть связаны с двумя причинами: 1) различной доступностью пептидов к активному центру ферментов сукцинатдегидрогеназы, НАД.Н-дегидрогеназы и цитохром с-оксидазы; 2) различные переносчики электронов по дыхательной цепи в разной степени чувствительны к пептидам яда кобры.

Действие пептида С-3-Б-1У-бета яда кобры на активацию полиферментных систем дыхательной цепи митохондрий цитохром с. Предполагалось, что уменьшение активности сукцинатоксидазной и НАД.Н-оксидазной систем дыхательной цепи в присутствии пептидов яда кобры может быть выбыванием цитохрома с из внутренней мембраны митохондрий. Если это так, то после добавления в суспензии митохондрий избыточного количества цитохрома с активность полиферментных систем дыхательной цепи должна восстановиться до уровня контроля (таб 3). В связи с этим нами было исследовано влияние цитохрома с на активность этих систем мембран митохондрий, подвергнутых действию пептидов. Пептиды С-3-Б-ГУ-бета не влияют на « включения» экзогеного цитохрома с в дыхательной цепи митохондрий. Таким образом, ингибирование активности сукцинатоксидазной и НАД.Н-оксидазной систем дыхательной цепи митохондрийв присутствии пептидов яда кобры не связано с выбыванием из внутренней мембраны митохондрий цитохрома с.

References:

1. Туракулов Я.Х., Сахибов Д.Н., Сорокин В.М., Юкельсон Л.Я. Разделение яда среднеазиатской кобры фильтрацией в геле серадексе и определение биологической активности полученных фракций. Биохимия 1960 Т.34 №6. С 1119-1122.

2. Туракулов Я.Х., Сорокин В.М., Нишонходжаева С.А., Юкельсон Л.Я. Токсины яда среднеазиатской кобры. Биохимия 1971. Т.36. №6 С. 1282-1287.

3. Саттыев Р. Влияние ядов среднеазиатских змей на структуру и функции митохондрий. Дисс.канд.биология Ташкент, 1974, 147 с.

4. Рустамова, Р. П., Иргашева, Г. М., Хушбактова, З. А., Клемешева, Л. С., Ширинова, И. А., & Алматов, К. Т. (2006). Влияние некоторых флавонов на энергетический метаболизм митохондрий (сообщение 2). Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, (2), 16-20.

5. Алматов, К. Т., Кулмаматова, И. Э., Клемешева, Л. С., Ширинова, И. А., & Алматов, Ш. К. (2004). Влияние бензонала на обмен фосфолипидов митохондрии сердца крыс при гипертермии. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, (1), 47-50.

6. Рустамова, Р. П., Иргашева, Г. М., Хушбактова, З. А., Ширинова, И. А., Клемешева, Л. С., & Алматов, К. Т. (2005). Влияние некоторых флавонов на энергетический метаболизм митохондрий. Сообщение 1. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, (4), 39-45.

Open access journal

www.in-academy.uz

7. Rustamova, R. P., Irgasheva, G. M., XUSHBAKTOVA, Z., KLEMESHEVA, L., SHIRINOVA, I., & ALMATOV, K. (2005). Influence of some flavones on the energy metabolism of mitochondria. Short massage. Biological, medical and pharmacological chemistry questions, 4, 39-45.

8. Ширинова, И. А., Нурдинов, Ш. Ш., Клемешева, Л. С., & Алматов, К. Т. (2005). Влияние яда среднеазиатской кобры на содержание фосфолипидов в митохондриях печени и сердца крыс и защитный эффект бензонала. Биомедицинская химия, 51(5), 513-518.

9. Shirinova, I. A., Dzhuraeva, M. M., Almatov, K. T., & Mirakhmedov, A. K. (1992). The effect of ionizing radiation on the phospholipid content of fetal and maternal liver mitochondria at different stages of pregnancy. Radiobiologiia, 32(5), 690-695.

10. Inobat, S., & Mukhammadjon, M. (2022). IN THE BLOOD AND LIVER OF RATS POISENED BY SPECTACLED SNAKE VENOM. Galaxy International Interdisciplinary Research Journal, 10(6), 41-42.

11. Shirinova, I. A. (2020). Effect of Antihypoxants on the Energy Metabolism of Mitochondria in Some Rat Organs. Solid State Technology, 63(4), 125-131.

12. Ermatova, S. M., & Shirinova, I. A. (2020). CLARIFICATION TOLERANTMONEY ACTIVITY IN DIFFERENT GROUPS OF HYPOMETABOLISM AGENTS. Theoretical & Applied Science, (6), 488-491.

13. Ширинова, И. А. (2019). ВЛИЯНИЕ АНТИГИПОКСАНТОВ НА ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЖИВОТНЫХ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ. Мировая наука, (5 (26)), 735-738.

14. Ширинова, И. А. (2019). ВЛИЯНИЕ АНТИГИПОКСАНТОВ НА ПОКАЗАТЕЛИ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА ЖИВОТНЫХ ПРИ ГИПОКСИИ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ. Экономика и социум, (5 (60)), 1356-1359.

15. Shirinova IA, Niyazmetov BA, Almatov KT. RESEARCH OF BENZONAL'S PROTECTIVE EFFECT ON THE BACKGROUND OF COBRA VENOM (NAJA NAJA OXIANA ECHWALD) EFFECT ON THE MITOCHONDRIAL PHOSPHOLIPID CONTENT. European Journal of Biomedical. 2017;4(04):136-9.

16. Anvarovna, S. I. (2016). Influence of catacyn and benzonalum on Ca 2+-accumulation capacity of mitochondrion of a liver of the rats poisoning with toxic of a cobra naja naja pxina Echwald. European science review, (7-8), 156-158.

17. Shirinova, I. A. (2016). THE EFFECT OF ASIAN COBRA VENOM ON THE CONTENT OF RAT HEART AND LIVER MITOCHONDRIAL PHOSPHOLIPIDS AND THE PROTECTIVE EFFECT OF BENZONAL. Science and Society, (3-2), 18-24.

18. Anvarovna, S. I. (2016). Influence of catacyn and benzonalum on Ca 2+-accumulation capacity of mitochondrion of a liver of the rats poisoning with toxic of a cobra naja naja pxina Echwald. European science review, (7-8), 156-158.

19. Shirinova, I. A., ShSh, N., Klemesheva, L. S., & Almatov, K. T. (2005). The effect of Asian cobra venom on the content of rat heart and liver mitochondrial phospholipids and the protective effect of benzonal. Biomeditsinskaia Khimiia, 51(5), 513-518.

20. Кулмаматова, И. Э., Ширинова, И. А., Асанова, К., Ахмеров, Р. Н., & Алматов, К. Т. (2002). Изменение интенсивности обмена у мышей толерантогенами при гипоксии и

«

Open access journal

www.in-academy.uz

высокой

температуре среды. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, (2), 50-53.