CC BY
14УДК 616.8-005: 616.831-005.4.-092.9 https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-09
© Коллектив авторов, 2020
ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНОГО КОРИЧНОЙ КИСЛОТЫ НА ИЗМЕНЕНИЕ АКТИВНОСТИ
КОМПЛЕКСОВ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА
Д.И. Поздняков
к.фарм.н., зав. лабораторией живых систем, доцент,
кафедра фармакологии с курсом клинической фармакологии,
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ
E-mail: [email protected]
Д.С. Золотых
к.фарм.н., доцент,
кафедра аналитической химии, Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ E-mail: [email protected] М.В. Ларский
к.фарм.н., зав. кафедрой фармацевтической химии,
Пятигорский медико-фармацевтический институт - филиал ФГБОУ ВО ВолгГМУ
E-mail: [email protected]
Актуальность. Митохондриальная дисфункция является значимым патогенетическим механизмом ишемического поражения головного мозга и перспективной фармакотерапевтической мишенью церебропротективной терапии.
Цель исследования. Изучить влияние 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты на изменение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи в супернатанте головного мозга у крыс в условиях церебральной ишемии. Материал и методы. Исследование выполнено на крысах самцах линии Wistar, которым воспроизводили ишемию головного мозга по методу Tamura. Крысам вводили 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричную кислоту в дозе 100 мг/кг (per os) через 30 мин после ишемии и далее однократно в день на протяжении трех суток. На четвертый день в супернатанте головного мозга методом респирометрии оценивали изменение активности митохондриальных комплексов I, II, IV и V.
Результаты. На фоне введения животным 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты отмечалось увеличение активности митохондриальных комплексов: НАДН-дегидрогеназы; сукцинатдегидрогеназы; цитохром С-оксидазы; F1F0 АТФ-синтазы по отношению к животным, не получавшим фармакологическую поддержку, на 71% (p<0,05); 86% (p<0,05); в 2,29 раза (p<0,05) и 1,9 раза (p<0,05) соответственно. По величине терапевтической эффективности изучаемая 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричная кислота превосходила препарат сравнения - янтарную кислоту в эквивалентной дозе.
Выводы. На основании полученных результатов можно предполагать, что 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричная кислота оказывает церебропротекторное действие за счет восстановления митохондриальной функции и устранения энергетического дефицита, возникающего в зоне ишемической пенумбры.
Ключевые слова: ишемия головного мозга, митохондриальная дисфункция, производные коричной кислоты.
Для цитирования: Поздняков Д.И., Золотых Д.С., Ларский М.В. Влияние производного коричной кислоты на изменение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи в условиях экспериментальной ишемии головного мозга. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2020;23(6):50-54. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-09
Ишемический инсульт представляет собой гетерогенный клинический синдром, в основе которого лежит окклюзия церебральных артерий тромбом, либо эмболом. На сегодняшний день инсульт ишемического типа занимает одно из ведущих мест в структуре смертности и первичной инвалидности населения [1]. В общемировом масштабе приблизительно 80-85% цереброваскуляр-ной патологии приходится на ишемический инсульт, при этом порядка 80%, перенесших данное состояние, не способны возобновить трудовую де-
ятельность и подвержены социальной дезадаптации [2]. Поскольку основной причиной развития ишемического инсульта является окклюзия мозговых артерий, характер метаболических и функциональных нарушений, возникающих при нарушении мозгового кровотока и недостатке кислорода, во многом определяют размер зоны ишемического инфаркта мозга и характер клинических проявлений инсульта [3].
На сегодняшний день установлено, что первоочередной причиной метаболического сдвига,
наблюдаемого при манифестации инсульта, является нарушение функциональной активности митохондрий в зоне ишемической «пенумбры» [4], сопровождаемое активацией реакций каспаза-зависимого и каспаза-независимого апоптоза, окислительного стресса, а также уменьшением образования макроэргических соединений, что в свою очередь может способствовать усилению некротических процессов в мозговой ткани [5]. При этом установлено, что в большинстве случаев развития митохондриальной дисфункции дефект, приводящий к нарушению функциональной активности митохондрий, локализуется на уровне комплексов ми-тохондриальной дыхательной цепи: НАДН-де-гидрогеназы (комплекс I); сукцинатдегидрогеназы (комплекс II); убихинол-цитохром С оксидоредук-тазы (комплекс III); цитохром С-оксидазы (комплекс IV); FlFo АТФ-синтазы (комплекс V) [6].
В связи с этим можно предположить, что коррекция митохондриальной дисфункции является перспективным направлением целенаправленной патогенетической терапии инсульта. В ранее проведенных исследованиях было установлено, что применение 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты (лабораторный шифр ATACL) в условиях ишемии головного мозга способствовало повышению синтеза АТФ, однако механизм реализации данного эффекта до конца не был установлен [7].
Цель исследования - изучение влияния соединения ATACL на изменение активности митохондриальных комплексов у крыс в условиях церебральной ишемии.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Исследование выполнено на 40 крысах-самцах линии Wistar массой 200-240 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рап-полово» и содержащихся в стандартных условиях вивария. Концепция исследования одобрена локальным этическим комитетом (протокол № 5 от 27.02.2020). Ишемию головного мозга моделировали методом правосторонней необратимой окклюзии средней мозговой артерии по методу Tamura (1981 г.) [8]. Животные были распределены на четыре группы по 10 особей:
1) ложнооперированные животные (ЛО);
2) крысы негативного контроля (НК) с воспроизведенной ишемией, но лишенные фармакологической поддержки;
3) животные, получавшие референтный препарат - янтарную кислоту в дозе 100 мг/кг;
4) крысы, которым вводили соединение ATACL в дозе 100 мг/кг [7].
Препарат сравнения и исследуемое соединение вводили per os в виде тонкодисперсной водной суспензии (приготовлялась непосредственно перед введением без использования вспомогательных веществ) через 30 мин после операции и далее в течение трех суток (одно введение в день). Выбор доз исследуемого соединения и референтного препарата был основан на ранее проведенных исследованиях [7]. На 4-й день с момента воспроизведения ишемии крыс под хлоралгидратной анестезией (350 мг/кг, интраперитонеально) декапи-тировали и извлекали головной мозг. Далее мозг гомогенизировали в среде, содержащей 1 ммоль ЭДТА, 215 ммоль маннита, 75 ммоль сахарозы, 0,1%-ный раствор БСА, 20 ммоль HEPES, с рН 7,2. Полученный гомогенат центрифугировали на холоду при 1400 g 5 мин, после чего супернатант повторно центрифугировали при 13000 g 15 мин. Полученный вторичный супернатант удаляли для проведения респирометрического анализа. Активность комплексов митохондриальной дыхательной цепи определяли методом респирометрии с использованием системы лабораторного респирометра АКПМ1-01Л (Альфа Бассенс, РФ) при внесении в анализируемую среду разобщителей (ро-тенон - 1 мкM; натрия азид - 20 ммоль; олигоми-цин - 1 мкг/мл) и субстратов (пировиноградная кислота - 10 ммоль; малат - 1 ммоль; сукцинат -10 ммоль; аскорбат - 2 ммоль; АДФ - 1 ммоль; К,К,№,№-тетраметил-1,4-фенилендиамин (TMPD) - 0,5 ммоль) митохондриального дыхания. Активность дыхательных комплексов оценивали по изменению потребления кислорода в пересчете на концентрацию белка в анализируемом образце:
комплекс I - по разнице потребления кислорода после внесения в среду смеси малат/пируват и ротенона;
комплекс II - по разнице потребления кислорода после внесения в среду сукцината и олиго-мицина;
комплекса IV - по разнице потребления кислорода после внесения в среду смеси роте-нон/TMPD/аскорбат и азида натрия;
комплекса V - по разнице потребления кислорода после внесения в среду ротенона и АДФ [9].
Содержание общего белка определяли по методу Бредфорда [10].
Полученные результаты обрабатывали методом вариационной статистики с применением про-
граммного пакета STATISTICA 6.0. Данные выражали в виде M±SEM. Сравнение средних осуществляли методом ANOVA с постобработкой Ньюмена-Кейсла при p<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе данного исследования установлено, что у животных группы НК в сравнении с ложно-оперированными крысами наблюдалось уменьшение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи (рисунок): активность комплекса I снизилась в 2 раза (p<0,05); комплекса II - в 2,1 раза (p<0,05); комплекса IV - в 3,9 раза (p<0,05) и комплекса V - в 1,7 раза (p<0,05).
Полученные данные группы НК могут свидетельствовать о том, что в условиях ишемического поражения головного мозга отмечается развитие ми-тохондриальной дисфункции, что в свою очередь согласуется с ранее проведенными исследованиями.
Введение животным янтарной кислоты в дозе 100 мг/кг способствовало увеличению активности дыхательных комплексов. При этом у крыс, получавших янтарную кислоту, относительно группы животных, лишенных фармакологической поддержки, наблюдалось повышение активности комплекса I - на 24% (p<0,05); комплекса II - на 22% (p<0,05); комплекса IV - на 69% (p<0,05) и комплекса V - на 57% (p<0,05).
На фоне применения соединения ATACL также отмечено восстановление митохондриаль-ной функции, выражаемое в повышении каталитических свойств дыхательных комплексов. Так, при введении крысам исследуемого соединения
ATACL активность комплекса I превосходила аналогичный показатель НК группы животных на 71% (p<0,05), активность комплекса II увеличилась на 86% (p<0,05). При этом стоит отметить, что на фоне введения соединения ATACL наблюдалась нормализация функции электроноемких митохондриальных комплексов IV и V, активность которых была в 2,29 раза (p<0,05) и 1,9 раза (p<0,05) выше таковой у крыс, лишенных фармакологической поддержки. У животных, которым вводили соединение ATACL, активность митохондриальных комплексов I, II, IV и V увеличилась по отношению к крысам, получавшим янтарную кислоту на 38,4% (p<0,05), 52,9% (p<0,05), 35,7% (p<0,05) и 18,8% (p<0,05) соответственно.
Структурные и функциональные нарушения митохондрий играют существенную роль в патогенезе ишемически-гипоксического повреждения органов и тканей, в особенности тех структур, которые в значительной степени чувствительны к недостатку кислорода и макроэргических соединений, например, тканей головного мозга [11].
Известно, что митохондриальная дисфункция является неотъемлемой составляющей «ишемиче-ского каскада» церебрального повреждения и во многом ассоциирована с недостатком АТФ, развивающегося в ходе нарушения реакций переноса электронов по дыхательной цепи митохондрий [12].
При этом разобщение реакций электронного транспорта, наблюдаемое в условиях ишемии, отмечается чаще всего на уровне комплексов I и IV, которые становятся главными источниками активных форм кислорода в клетке, усугубляя тем са-
Комплекс! Комплект П Комплект IV Комплексу
оэЛО пНК ыЯК 1» Mrjfer ш ATACL 1»мг/кт
Влияние соединения АТА^ и янтарной кислоты на изменение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи у крыс в условиях церебральной ишемии (ЛО - ложнооперированные животные; НК -группа крыс негативного контроля; ЯК - группа животных, получавшая янтарную кислоту; АТА^ - группа крыс, получавшая соединение АТА^; # - статистически достоверно по отношению к группе ЛО; * - статистически достоверно относительно группы НК)
мым течение ишемического процесса. В связи с этим можно предположить, что восстановление функциональных свойств дыхательных комплексов будет способствовать снижению степени ми-тохондриального повреждения [13]. Установлено, что применение янтарной кислоты и 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты в условиях ишемии головного мозга способствовало повышению активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи. При этом нормализация функции дыхательных комплексов может быть связана с биохимическим шунтированием НАДН-дегидро-геназы и включением восстановительных эквивалентов в митохондриальную дыхательную цепь в обход комплекса I [14]. В результате чего может наблюдаться нормализация реакций электронного транспорта от сукцинатдегидрогеназы к F1F0 АТФ-синтазе и уменьшению продукции активных форм кислорода, что в свою очередь повышает активность комплекса I [15].
ВЫВОДЫ
В условиях экспериментальной фокальной ишемии головного мозга у крыс отмечается снижение активности комплексов митохондриальной дыхательной цепи, что свидетельствует о развитии митохондриальной дисфункции. Применение янтарной кислоты и 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричной кислоты в дозе 100 мг/кг per os способствует восстановлению активности комплексов I, II, IV и V дыхательной цепи. При этом по величине фармакологического эффекта 4-гидрокси-3,5-ди-третбутил коричная кислота превосходит референтный препарат - янтарную кислоту.
ЛИТЕРАТУРА
1. Jayaraj R.L., Azimullah S., Beiram R., Jalal F.Y., Rosenberg G.A. Neuroinflammation: friend and foe for ischemic stroke. J. Neuroin flammation. 2019; 16(1): 142.
2. Ma Y. Liu Y., Zhang Z., Yang G.Y. Significance of Complement System in Ischemic Stroke: A Comprehensive Review. Aging Dis. 2019; 10(2):429-462.
3. Mondal N.K., Behera J., Kelly K.E., George A.K., Tyagi P.K., Tyagi N. Tetrahydrocurcumin epigenetically mitigates mitochondrial dysfunction in brain vasculature during ischemic stroke. Neurochem Int. 2019; 122:120-138.
4. Ham P.B. 3rd, Raju R Mitochondrial function in hypoxic ischemic injury and influence of aging. Prog Neurobiol. 2017; 157:92-116.
5. Nguyen H., Zarriello S., Rajani M., Tuazon J., Napoli E., Borlongan C. V. Understanding the Role of Dysfunctional and Healthy Mitochondria in Stroke Pathology and Its Treatment. Int J Mol Sci. 2018; 19(7):2127.
6. Bernardi P., Rasola A., Forte M., Lippe G. The Mitochondri-al Permeability Transition Pore: Channel Formation by F-ATP Synthase, Integration in Signal Transduction, and Role in Pathophysiology. Physiol Rev. 2015; 95(4):1111-1155.
7. Воронков А.В., Абаев В.Т., Оганесян Э.Т., Поздняков Д.И. Некоторые аспекты церебропротекторной активности 4-гид-рокси-3,5-ди-трегбугил коричной кислоты при ишемичес-ком повреждении головного мозга в эксперименте. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2018; 13(1-1): 90-93.
8. Tamura A., Graham D.I., McCulloch J., Teasdale G.M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1981; 1(1): 53-60.
9. Воронков А.В., Поздняков Д.И., Нигарян С.А., Хури Е.И., Мирошниченко К.А., Сосновская А.В., Олохова Е.А. Оценка респирометрической функции митохондрий в условиях патологий различного генеза. Фармация и фармакология. 2019; 7(1): 20-31.
10. He F. Bradford Protein Assay. Bio-101. 2011: e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45.
11. Klacanova K., Kovalska M., Chomova M., et al. Global brain ischemia in rats is associated with mitochondrial release and downregulation of Mfn2 in the cerebral cortex, but not the hippocampus. Int. J. Mol. Med. 2019; 43(6): 2420-2428.
12. Kumar R., Bukowski M.J., Wider J.M., et al. Mitochondrial dynamics following global cerebral ischemia. Mol. Cell. Neu-rosci. 2016; 76: 68-75.
13. Kuznetsov A.V., Javadov S., Margreiter R., Grimm M., Ha-genbuchner J., Ausserlechner M.J. The Role of Mitochondria in the Mechanisms of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Antioxidants. 2019; 8(10): 454.
14. Deroche-Gamonet V., Revest J.M., Fiancette J.F., Balado E., Koehl M., Grosjean N., et.al. Depleting adult dentate gyrus neurogenesis increases cocaine-seeking behavior. Molecular psychiatry. 2019; 24(2): 312-320.
15. üyedotun K.S., Lemire B.D. The quaternary structure of the Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase. Homol-ogy modeling, cofactor docking, and molecular dynamics simulation studies. J. Biol. Chem. 2004; 279(10): 9424-9431.
Поступила 2 марта 2020 г.
INFLUENCE OF A CINNAMIC ACID DERIVATIVE ON CHANGES IN THE ACTIVITY OF MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN COMPLEXES IN EXPERIMENTAL BRAIN ISCHEMIA
© Authors, 2020 D.I. Pozdnyakov
Ph.D. (Pharm.), Head of Living System Laboratory, Associate Professor,
Department of Pharmacology with Clinical Pharmacology Course, Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected]
D.S. Zolotyh
Ph.D. (Pharm.), Associate Professor,
Analytical Chemistry Department, Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected] M.V. Larskij
Ph.D. (Pharm.), Head of Pharmaceutical Chemistry Department, Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute E-mail: [email protected]
Relevance. It is known that mitochondrial dysfunction is a significant pathogenetic mechanism of ischemic brain damage and a promising pharmacotherapeutic target for cerebroprotective therapy.
The aim of the study. To evaluate the effect of 4-hydroxy-3,5-di-tret-butyl cinnamic acid on the change of the mitochondrial respiratory chain complexes activity in rats brain supernatant in cerebral ischemia conditions.
Material and methods. The study was performed on male Wistar rats that reproduced cerebral ischemia using the Tamura method. 4-hydroxy-3,5-di-tret-butyl cinnamic acid was administered at a dose of 100 mg / kg (per os) after 30 minutes when ischemia was reproduced and then once a day for 3 days. On day 4, a change in the activity of mitochondrial complexes I, II, IV, and V in the supernatant of the brain was assessed by the respirometric method.
Results. Against the background of the administration of 4-hydroxy-3,5-di-tret-butyl cinnamic acid into animals, an increase in the activity of mitochondrial complexes was noted: NADH-dehydrogenase; succinate dehydrogenase; cytochrome c - oxidase; F1F0 ATP synthase in relation to animals that did not receive pharmacological support by 71% (p < 0.05); 86% (p < 0.05); 2.29 times (p < 0.05) and 1.9 times (p < 0.05) times, respectively. It should be noted that the 4-hydroxy-3,5-di-tret-butyl cinnamic acid test compound exceeded the reference drug succinic acid in an equivalent dose in terms of therapeutic efficacy. Conclusions. Based on the obtained results it can be assumed that 4-hydroxy-3,5-di-tret-butyl cinnamic acid has a cerebroprotective effect due to the restoration of mitochondrial function and the elimination of energy deficiency arising in the area of ischemic penumbra.
Key words: cerebral ischemia, mitochondrial dysfunction, cinnamic acid derivatives.
For citation: Pozdnyakov D.I., Zolotyh D.S., Larskij M.V. Influence of a cinnamic acid derivative on changes in the activity of mitochondrial respiratory chain complexes in experimental brain ischemia. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2020;23(6):50-54. https://doi.org/10.29296/25877313-2020-06-09
REFERENCES
1. Jayaraj R.L., Azimullah S., Beiram R., Jalal F.Y., Rosenberg G.A. Neuroinflammation: friend and foe for ischemic stroke. J. Neuroin flammation. 2019; 16(1):142.
2. Ma Y. Liu Y., Zhang Z., Yang G.Y. Significance of Complement System in Ischemic Stroke: A Comprehensive Review. Aging Dis. 2019; 10(2):429-462.
3. Mondal N.K., Behera J., Kelly K.E., George A.K., Tyagi P.K., Tyagi N. Tetrahydrocurcumin epigenetically mitigates mitochondrial dysfunction in brain vasculature during ischemic stroke. Neurochem Int. 2019; 122:120-138.
4. Ham P.B. 3rd, Raju R. Mitochondrial function in hypoxic ischemic injury and influence of aging. Prog Neurobiol. 2017; 157:92-116.
5. Nguyen H., Zarriello S., Rajani M., Tuazon J., Napoli E., Borlongan C.V. Understanding the Role of Dysfunctional and Healthy Mitochondria in Stroke Pathology and Its Treatment. Int J Mol Sci. 2018; 19(7):2127.
6. Bernardi P., Rasola A., Forte M., Lippe G. The Mitochondrial Permeability Transition Pore: Channel Formation by F-ATP Synthase, Integration in Signal Transduction, and Role in Pathophysiology. Physiol Rev. 2015; 95(4):1111-1155.
7. Voronkov A.V., Abaev V.T., Oganesyan E.T., Pozdnyakov D.I. Nekotorye aspekty tserebroprotektornoj aktivnosti 4-gidroksi-3,5-di-trebutil korichnoj kisloty pri ishemicheskom povrezhdenii golovnogo mozga v eksperimente. Meditsinskij vestnik Severnogo Kavkaza. 2018; 13(1-1): 90-93.
8. Tamura A., Graham D.I., McCulloch J., Teasdale G.M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1981; 1(1): 53-60.
9. Voronkov A.V., Pozdnyakov D.I., Nigaryan S.A., Khuri E.I., Miroshnichenko K.A., Sosnovskaya A.V., Olokhova E.A. Otsenka respirometricheskoj funktsii mitokhondrij v usloviyakh patologij razlichnogo geneza. Farmatsiya i farmakologiya. 2019; 7(1): 20-31.
10. He F. Bradford Protein Assay. Bio-101. 2011: e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45.
11. Klacanova K., Kovalska M., Chomova M., et al. Global brain ischemia in rats is associated with mitochondrial release and downregulation of Mfn2 in the cerebral cortex, but not the hippocampus. Int. J. Mol. Med. 2019; 43(6): 2420-2428.
12. Kumar R., Bukowski M.J., Wider J.M., et al. Mitochondrial dynamics following global cerebral ischemia. Mol. Cell. Neurosci. 2016; 76: 68-75.
13. Kuznetsov A.V., Javadov S., Margreiter R., Grimm M., Hagenbuchner J., Ausserlechner M.J. The Role of Mitochondria in the Mechanisms of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Antioxidants. 2019; 8(10): 454.
14. Deroche-Gamonet V., Revest J.M., Fiancette J.F., Balado E., Koehl M., Grosjean N., et.al. Depleting adult dentate gyrus neurogenesis increases cocaine-seeking behavior. Molecular psychiatry. 2019; 24(2): 312-320.
15. Оyedotun K.S., Lemire B.D. The quaternary structure of the Saccharomyces cerevisiae succinate dehydrogenase. Homology modeling, cofactor docking, and molecular dynamics simulation studies. J. Biol. Chem. 2004; 279(10): 9424-9431.
