CC BY
124
ИММУНОЛОГИЯ
УДК:547.53:615.37:616-097
Л.Е. Панин, Е.Ю. Клейменова, Г.С. Русских
ВЛИЯНИЕ НЕСИММЕТРИЧНОГО ДИМЕТИЛГИДРАЗИНА (ГЕПТИЛА) НА ПРОДУКЦИЮ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ M И G И РАЗВИТИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
В статье описан новый механизм индукции синтеза иммуноглобулинов у млекопитающих. Продукция иммуноглобулинов лимфоцитами селезенки усиливается биологически активным комплексом тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I (ТГК-апоА-I), который образуется в макрофагах лимфоидной ткани. Впервые показано, что данный механизм сильно подавляется гептилом — токсическим элементом ракетного топлива. В условиях in vivo это может приводить к развитию иммунодефицита.
Ключевые слова: несимметричный диметилгидразин (гептил), иммуноглобулины
Территории падения отделяющихся частей ракетоносителей в Алтайском крае включают 5 районов: Змеиногорский, Краснощековский, Курьинский, Третьяковский и Чарышский. Это районы края, где отсутствуют промышленные предприятия и где влияние на иммунную систему промышленных поллютантов исключено. Все они относятся к заповедной зоне. По проекту на границе России, Казахстана, Китая и Монголии планируется создать трансграничную биосферную территорию «Алтай». Она будет представлять единый заповедный природный комплекс. Эти места сегодня отведены под районы падения второй ступени ракетоносителя. По свидетельству врачей, у населения этих территорий часто выявляются нарушения системы иммунитета. Развитие иммунодефицитов — основная причина увеличения инфекционной патологии и паразитарных болезней. Болезни данного класса в структуре заболеваемости населения составляют 3,4%. Уровень интенсивного показателя (132,9%0) в 2,4 раза выше, чем в среднем по Алтайскому краю. Наиболее высокий удельный вес данной патологии выявлен в возрасте 5-9 лет: в среднем 11,6%. У мужчин в возрасте 40-46 лет эта патология составляет 10%, в возрасте 65-69 лет — 10,9%; у женщин в возрасте 45-49 лет — 10,4%, а в возрасте 60-64 года — 13,7% [2].
Считается, что иммунная система представляет собой одну из мишеней действия НДМГ и его производных, однако механизм их негативного влияния до сих пор неизвестен. Иммуносупрес-сивный эффект несимметричного диметилгидра-зина (НДМГ) проявляется в подавлении реакций
гиперчувствительности на антиген, в подавлении способности селезеночных Т-лимфоцитов отвечать на действие митогенов, в снижении жизнеспособности иммунокомпетентных клеток, в снижении массы иммунных органов [8, 9]. У мышей обнаружено снижение числа Т-хелперов и иммуномодулирующее действие на лимфоциты и спленоциты. В токсическом эффекте НДМГ, вероятно, важную роль играет такой фактор апоп-тоза, как JP-8, который освобождается при гибели клеток [5]. Известно, что усиление синтеза ДНК под влиянием конканавалина А (Con. A) в мышиных спленоцитах подавляется субтоксическими дозами НДМГ [3]. Кроме того, НДМГ подавлял миристилацетатиндуцированную продукцию IL-2 EL-4 клетками. Снижение образования IL-2 некоторые авторы рассматривают как механизм иммуномодулирующего действия НДМГ [3, 10]. Изменение активности Т-лимфоцитов и главного комплекса гистосовместимости второго типа (Major Histocompatibility Complex Class II) и Ia антигена также рассматривается как проявление иммуномодулирующего действия НДМГ [4].
Однако приведенные литературные данные не исчерпывают полностью все механизмы негативного влияния НДМГ на иммунную систему. Нами был описан механизм усиления продукции иммуноглобулинов лимфоцитами под влиянием биологически активного комплекса тетрагидрокор-тизол-аполипопротеин А-I (THC-apoA-I). Было показано, что антигенпрезентирующие клетки (макрофаги печени и лимфатических узлов, ретикулярные клетки), захватывая бактериальные и вирусные антигены, активно поглощают HDL3
и стероидные гормоны. Это приводит к формированию биологически активного комплекса THC-apoA-I, который, попадая в межклеточную среду, стимулирует вместе с антигеном плазматические клетки (В-лимфоциты), усиливая образование иммуноглобулинов [6, 7]. Эту модель мы выбрали для изучения токсического действия НДМГ на синтез иммуноглобулинов.
Материалы и методы исследования
Экспериментальная модель. Крысы-самки Вистар покрывались самцами. Самки на 7-е, 12-е и 17-е сутки беременности получали внутрибрю-шинно НДМГ в дозе 100 мкг/кг массы животного. Затем животных забивали. Сыворотку крови брали на исследование содержания IgM и IgG им-муноферментным методом. Измерение содержания иммуноглобулинов проводили на многоканальном фотометре Reader «Multiscan ASCENT», полученном по проекту №1924 МНТЦ. Сыворотку крови новорожденных крысят также брали на определение IgM и IgG в течение первого месяца жизни.
Влияние НДМГ на синтез иммуноглобулинов класса M и G изучали на культуре лимфоцитов селезенки [1]. Для этого животных забивали де-
капитацией, вскрывали в верхней трети брюшную полость, с помощью пинцета выделяли селезенку Затем ее мягко гомогенизировали и гомогенат фильтровали через капроновый фильтр для удаления стромальных элементов. Полученную клеточную взвесь наслаивали на двухступенчатый градиент плотности фикол-верографин (р=1,077 и р=1,09 г/см3). Полученную клеточную взвесь центрифугировали при 3000 об/мин 40 мин при 4 °С. Интерфазный слой клеток собирали и отмывали средой по обычной схеме [1]. Чистоту и жизнеспособность полученных клеток оценивали с помощью световой микроскопии и по исключению трипанового синего.
Влияние НДМГ на синтез иммуноглобулинов M и G изучали в культуре лимфоцитов. Для этого изолированные лимфоциты в количестве 2-3* 108 на мл инкубировали в среде Игла МЕМ, содержащей 10 мМ HEPES-буфер, 10% эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глютамина и 50 мкг/мл ген-тамицина при 37 °С в атмосфере СО2 (5% СО2 и 95% О2) в течение 24 час. Для стимуляции иммунного ответа в среду инкубации добавляли комплекс THC-apoA-I (отношение 2:1) в количестве 100 мкг/мл среды и LPS из Serratia marcescens
Таблица 1
Влияние НДМГ на содержание иммуноглобулинов М и G в крови самок крыс (в мг/мл), получавших НДМГ в период беременности (группа 1), а также в период беременности и в первые 2 недели после родов (группа 2)
Тип иммуноглобулинов Контроль Гептил (группа 1) Гептил (группа 2)
IgG 16,44±1,08 n=6 13,31±0,43* n=5 16,35±1,04 n=4
IgM 0,560±0,094 n=6 0,501±0,043 n=5 0,567±0,096 n=4
Примечание: * — различия в сравнении с контролем достоверны (р<0,05).
Таблица 2
Влияние НДМГ на содержание иммуноглобулинов М и G в крови крысят (в мг/мл), рожденных от матерей, получавших НДМГ в период беременности (группа 1), а также в период беременности и в первые 2 недели после родов (группа 2)
Тип иммуноглобулинов Контроль Гептил (группа 1) Гептил (группа 2)
IgG 12,07±0,31 10,38±0,32* 10,78±0,34*
n=22 n=13 n=17
IgM 0,320±0,012 0,290±0,011 0,280±0,006*
n=22 n=12 n=18
Примечание: * — различия в сравнении с контролем достоверны (р<0,001).
Таблица 3
Влияние различных доз гептила на синтез иммуноглобулина G в культуре лимфоцитов (Кл) селезенки мышей
Доза гептила (мкг/мл) Содержание иммуноглобулина G в культуре лимфоцитов (нг/мл)
Кл + LPS Кл + апоА-I + LPS Кл + ТГК + LPS Кл + апоА-I - ТГК + LPS
Контроль 8,6±0,2 8,9±0,4 57,2±2,3** 60,0±5,5**
Гептил — 5,0 4,5±0,2* - - 7,4±0,7*
Гептил — 0,5 8,4±0,7 - - 10,8±0,1*
Гептил — 0,05 8,7±0,2 - - 14,7±0,1*
Примечание:различия в сравнении с контролем достоверны: * — прир<0,01; ** — прир<0,001.
— 7,5 мкг/мл среды. В контроле оценивали также действие одного гормона — ТНС, который добавляли в среду инкубации в дозе 10-6 М либо одного апоА-1 (100 мкг/мл среды).
Для инкубации культуры клеток использовали СО2-инкубатор Со1е-Рагтег (США), полученный по проекту №1924 МНТЦ.
Эксперименты на животных и проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. №755).
Результаты исследования
В представленной модели мы изучали дозозависимый эффект НДМГ, который добавляли в дозах соответственно 5 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 0,05 мкг/мл. Проведенные исследования показали, что у самок, получавших НДМГ в период беременности, в крови достоверно снижалось содержание IgG, содержание ^М практически не изменялось (таблица 1). Самки, которые получали НДМГ дополнительно после родов, не имели отличий в содержании ^М и IgG от контрольных животных.
У новорожденного потомства на первом месяце постнатального развития содержание ^М и IgG в крови снижалось по сравнению с крысятами, рожденными от матерей, не получавших НДМГ (таблица 2). В группе самок, которые дополнительно получали НДМГ после родов, крысята также имели пониженное содержание ^М и IgG в крови. Полученные результаты говорят о том, что иммунная система новорожденных крысят более чувствительна к токсическому действию НДМГ, чем организм взрослого животного. В данной модели нужно принимать во внимание, что развивающийся внутриутробно плод контак-
Таблица 4
Влияние несимметричного диметилгидразина (гептила) на продукцию М(нг/мл) лимфоцитами селезенки крыс Вистар
Примечание: количество измерений в каждом случае 4-5. В качестве антигена во всех случаях использовался ЛПС из Serratia marcescens. * — P<0,05 по отношению к контролю.
тирвал с НДМГ через организм матери, когда у него система иммунитета еще только формировалась. Эта ситуация адекватна той, которая имеет место в реальной действительности у людей.
В дальнейшем токсическое действие НДМГ на иммунную систему мы изучали в условиях in vitro, т.е. в культуре лимфоцитов селезенки, где стимуляцию иммунного ответа (синтез IgG) осуществляли с помощью LPS (антиген) и биологически активного комплекса THC-apoA-I. Эти результаты представлены в таблице 3. Оказалось, что сами лимфоциты без каких-либо добавок, кроме LPS, очень мало синтезируют IgG. Если в культуру лимфоцитов добавить аполипопротеин А-I, то ситуация практически не изменяется. Синтез IgG по-прежнему оставался низким в присутствии антигена (LPS). Однако ситуация резко изменялась, если в среду инкубации добавляли стероидные гормоны в восстановленной форме - тетрагидросоединения. В данном случае мы добавляли тетрагидрокортизол (THC). В присутствии ТНС синтез IgG резко усиливался. Если добавить в среду инкубации комплекс THC-apoA-I, продукция IgG также резко увеличивается, хотя разница с действием одного ТНС недостоверна. На этом фоне оценивали ингибирующее действие НДМГ на синтез иммуноглобулинов. Оказалось, что в дозе 5 мкг/мл НДМГ полностью подавлял продукцию IgG. Она была на уровне контроля (культура лимфоцитов + LPS без гептила). В этой дозе НДМГ снижал продукцию IgG и во втором контроле (культура лимфоцитов + LPS + гептил), где присутствовал только один антиген (LPS).
Снижение дозы НДМГ на порядок — до 0,5 мкг/мл среды — оказывало столь же выраженный ингибирующий эффект на синтез иммуноглобулинов в присутствии апоА-I + ТГК. Снижение дозы НДМГ на два порядка — до 0,05 мкг/мл
— по-прежнему значительно снижало продукцию иммуноглобулинов, хотя и в меньшей степени, чем при дозе 5 мкг/мл. В дозе 0,05 и 0,5 мкг/мл НДМГ не подавлял продукцию IgG в контрольных лимфоцитах, где единственным индуктором являлся LPS, т.е. антиген. Аналогичные данные получены по действию НДМГ на продукцию иммуноглобулина М лимфоцитами селезенки (таблица 4).
Заключение
Описан новый механизм индукции синтеза иммуноглобулинов у млекопитающих. В основе его лежит усиление биосинтеза белка в лимфоцитах под влиянием биологически активного комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин А-I, который активно образуется резидентными макрофагами. Впервые показано, что данный механизм сильно подавляется НДМГ-токсическим элементом ракетного топлива.
Условия опыта Продукция иммуноглобулина
Лимфоциты, контроль 0,30±0,020
Лимфоциты + апоA-I 0,44±0,021*
Лимфоциты + ТГК 0,36±0,027
Лимфоциты + апоA-I +ТГК 0,46±0,021*
Лимфоциты + апоA-I +ТГК + гептил 5 мкг/мл 0,28±0,027
Лимфоциты + апоA-I +ТГК + гептил 0,5 мкг/мл 0,29±0,015
Лимфоциты + апоA-I +ТГК + гептил 0,05 мкг/мл 0,31±0,032
Лимфоциты + гептил 5 мкг/мл 0,26±0,027
Лимфоциты + гептил 0,5 мкг/мл 0,28±0,005
Лимфоциты + гептил 0,05 мкг/мл 0,30±0,01
Полученные результаты свидетельствуют о том, что НДМГ является мощным ингибитором синтеза иммуноглобулинов. Его действие на систему иммунитета следует считать многоплановым, если учесть те разнообразные факты, которые уже описаны в литературе.
Работа выполнялась по проекту МНТЦ № 1924 (головная организация — Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»).
INFLUENCE OF UNSYMMETRICAL DIMETHYLHYDRAZINE (HEPTYL)
ON PRODUCTION OF IMMUNOGLOBULINS M AND G AND DEVELOPMENT OF IMMUNODEFICIENCIES L.E. Panin, E.Ju. Kleymenova, G.S. Russkikh
The new mechanism of an induction of immunoglobulin synthesis at mammals is described. Production of immunoglobulin by spleen lymphocytes become intensify under action of biologically active complex tetrahydrocortisol — apolipoprotein A-I (THC — apoA-I) which is formed in macrophages of lymphoid tissue. For the first time it is shown, that the given mechanism is strongly suppressed by hep-tyl — a toxic element of rocket fuel. It can result in vivo in development of an immunodeficiency.
Литература
1. Гольдберг Е.Д. Методы культуры тканей в гематологии / Е.Д. Гольдберг, А.М. Дыгай, В.П. Шахов.
— Томск, 1992. — 272 с.
2. Патологическая пораженность (point prevalence) населения, проживающего в зонах Алтайского края, прилегающих к районам падения отделяющихся частей ракет-носителей / Я.Н. Шойхет, В.Б. Колядо, И.Б.
Колядо и др. / Препринт №26, часть 1. — Барнаул, 2002.
— 76 с.
3. Bauer R.M. Effect of 1,1-dimethylhydrazine on lymphoproliferation and interleukin 2 immunoregulatory function / R.M. Bauer, M.G. Tarr, R.G. Olsen // Arch. Environ. Contam. Toxicol. — 1990. — Vol. 19. — № 1. — P. 148-153.
4. Frazier D.E.Gr. The in vitro and in vivo effects of 1,1-dimethylhydrazine (UDMH) on murine lymphocyte subset and Ia antigen expression / D.E. Gr. Frazier, M.G. Tarr, R.G. Olsen // Immunopharmacol Immunotoxicol.
— 1991. — Vol. 13. — P. 25-46.
5. McDougal G.N. Assessment of skin absorption and penetration of JP-8 jet fuel and its components / G.N.McDougal, D.L.Pollard, W.Weisman et al. // Toxicol. Sci. — 2000. — Vol. 55. — P. 247-255.
6. Panin L.E. Activation of nuclear DNA expression in hepatocytes by glucocorticoids and high density lipoproteins / L.E. Panin, V.F. Maksimov, I.F. Usynin, I.M. Korostyshevskaya // J. Steroid Biochem. & Molec. Biol.
— 2002. — № 81. — P. 69-76.
7. Panin L.E. The role of macrophages as antigen-presenting cells in the formation of biologically active complex tetrahydrocortisol — apolipoprotein A-I and activation of immune response / L.E. Panin., E.Yu. Kleymenova // XII Intern. Symp. on Cells of Hepatic Sinusoid, 5-9 Sept. Abstract Book. — 2004, Bilbao (Spain). — P. 13.
8. Rosenthal D.S. Mechanisms of JP-8-jet fuel toxicity. 2. Induction of necrosis in skin fibroblasts and keratinocytes and modulation of levels of Bcl-2 family members / D.S. Rosenthal, C.G. Simbulan-Rosenthal, W.F. Liu et al. // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 2001. — Vol. 171. — P. 107-116.
9. Stoicia B.A. Mechanisms of JP-8-jet fuel toxicity 1. Induction of apoptosis in rat lung epithelial cells / B.A. Stoicia, A.H. Boulares, D.S. Rosenthal et al // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 2001. — Vol. 171. — P. 94-106.
10. Tarr M.G. Enhancement of murine mixed lymphocyte response by 1,1-dimethylhydrazine: characterization and possible mechanism / M.G. Tarr, B.G. McKown, R.G. Olsen // Cancer Detect Prev. — 1988. — Vol. 12.
— P. 573-581.
