CC BY
42
О.И. Гимаутдинова, Е.Ю. Величко, В.В. Базалук
ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ ССС/СвС ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ НА ДНК МЕТАБОЛИТОВ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ В КОМПЛЕКСЕ С АПОА-1
ГУ НИИ биохимии СО РАМН, Новосибирск
Изучена Sl-нуклеазочувствительность олигонуклеотидных дуплексов CC(GCC)n-GG(CGG)n (n=3, 5) в присутствии комплекса тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I. Показано образование одноцепочечных олигонуклеотидов, способных гидролизоваться нуклеазой S1, что подтверждает «расплетающее» действие комплекса тстрагидрокортизол-аполипопротеин А-I на двойную цепь ДНК. Показана инициаторная роль сайтов связывания ДНК эукариот с комплексами стероид-аполипопротеин А-I (тетрагидрокортизол, анд-ростерон) в реакции копирования in vitro.
Ключевые слова: GCC/GGC последовательности ДНК, аполипопротеин А-I, кортизол, тетрагидрокортизол
Введение
Известно, что в условиях стресса возрастает количество кортизола и, соответственно, его метаболита — тетрагидрокортизола (ТГК). Тетрагидрокортизол в комплексе с аиолипопро-теином А-1 способен влиять на экспрессию генов [1, 2]. Ранее было показано, что в присутствии ТГК и некоторых других стероидных гормонов и их метаболитов в комплексе с аполипопротеином А-1 происходит также активный синтез ДНК в гепатоцитах, связанный с их пролиферацией [2]. Поскольку специфическое связывание комплекса апоА-1-ТГК с ДНК эукариот осуществляется преимущественно в сайтах вида ССС/вСС [3], в настоящей работе исследовали воздействие комплекса апоА-1-ТГК на синтетические олигонуклеотиды, имитирующие подобные сайты связывания.
Материалы и методы
АпоА-1 выделяли из сыворотки крови крыс и анализировали, как описано в работе [3]. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с «Правилами проведения работ с экспериментальными животными». ДНК из печени крыс изолировали с помощью гуанидин изотио-цианата и анализировали по методу, описанному в работе [4].
Триэтиламмонийные или литиевые соли СС(ССС)п, где п=3, 5 синтезированы Д.В. Пышным (НИХБиФМ СО РАН, Новосибирск). Олигонуклеотиды СС(ССС)п метили по 5'-концу у[32Р]АТР («Изотоп» Санкт-Петербург, 1 кюри/ммоль) с помощью полинуклеотидкиназы бактериофага Т4 («Сибэнзим», Новосибирск).
Олигонуклеотиды осаждали 2% перхлоратом лития в ацетоне.
Воздействие комплекса ТГК-апоА-1 на оли-гонуклеотидный дуплекс СС(ССС)5-СС(ССС)5 (ГТГ2) оценивали, как и в случае ДНК [4], по результатам ферментативного гидролиза нуклеазой 81. Исследовались следующие молярные соотношения дуплекс-комплекс — 1:1, 1:4 и 1:10. Мольное соотношение АпоА-1/ТГК равно 1:2 [3, 4]. Связывание дуплекса Г1-Г2 с комплексом ТГК-АпоА-1 проводили в буферах с pH 5 и pH 7,5 при комнатной температуре в течение 10 мин и
1 ч. Гидролиз нуклеазой Б1 проводили как описано в работе [4], если соблюдались стандартные условия для расщепления однонитевых последовательностей (буфер pH 5, 37 °С, 30 мин). Время инкубации с ферментом увеличивали до 2 ч, если использовали буфер с pH 7,5. Для подтверждения функционирования нуклеазы Б1 в выбранных условиях в контрольных опытах вместо дуплекса использовали однонитевые СС(ССС). (Г1) и СС(ССС)5 (Г2), меченые фосфором-32. Реакционные смеси наносили на 15% или 20% ПААГ в отсутствие или в присутствии мочевины и проводили электрофорез в нативных или в денатурирующих условиях, соответственно. Затем гель радиоавтографировали на рентгеновскую пленку «АСРА», Бельгия.
Копирование ДНК с измененной структурой фрагментом Кленова [5] проводили следующим образом. Из 19 нг АпоА-1 и 0,448 нг ТГК (1:2, моль/моль) получали комплекс как указано выше и инкубировали его с 2 мкг нативной ДНК в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем
38
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
в реакционную смесь добавляли 6-звенные статистические праймеры (НИХБиФМ СО РАН) в концентрации 0,004 ОЕ.260/мкл; сІСТР. сГГТР, (ІСТР в концентрации 33 мкМ, с1[а-32Р]АТР,
50 мкКн и 0.3 ед. акт. фрагмента Кленова в буфере
0,15 М Трис-НС1. 9 мМ №^С12,3 мМ 2-меркапто-этанола, pH 7.5. Реакцию проводили 30 мин при 37 °С, затем вносили немеченный АТРдо концентрации 33 мкМ и инкубировали еще 30 мин |5]. По окончании реакции к смеси добавляли равный объем формамида (Мегск, Германия) и выдерживали на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин для денатурации ДНК. Для разделения фрагментов ДНК проводили электрофорез в 5%, 15% и 20% ПААГ или в 1% и 2% агарозе. После электрофореза ПААГ радиоавтографировали на рентгеновскую пленку, агарозный гель окрашивали бромистым этидием.
Результаты и их обсуждение
Ранее было показано, что при взаимодействии ДНК с комплексом ТГК-АпоА-1 появляются БІ-нуклеазочувствительные (однонитевые) участки преимущественно в сайтах вида ССС/ССС [3].
Для исследования структурных изменений таких участков были синтезированы олигонуклеотиды СС(ОСС). (Г1) и СС(СОС),(Г2), имитирующие сайты связывания комплекса ТГК-аноА-1 на ДНК. Показано, что в присутствии комплекса ТГК-аноА-1 даже при эквп.молярных соотношениях одноцепочечные олигонуклеотиды СС(ССС)5 (Г1) и ОС(ССС). (Г2) защищаются от действия нуклеазы Б1 (рис. 1, дор. 7 и 11), которая расщепляет их количественно в отсутствие комплекса (дор. в и 10). При воздействии комплекса ТГК-апоА-1 на дуплекс СС(ССС). ОС(ССС).) (Г1-Г2) появляются продукты гидролиза нуклеазой Б1 одноцепочечных олигонуклеотидов (рис. 1, дор. 3), что прямо подтверждает «расплетающее» воздействие этого комплекса на структуру ДНК.
9 10 1! 12
Продукт 1.1 гилролша
Рис. 1. Гидролиз олигонуклеотидов нуклеазой Ь'1 в присутствии комплекса ТГК-апоА-1.
1-4 — дуплекс Г1-Г2; 5-8 — олигонуклеотид Г1;
9-12 — олигонуклеотид Г2. Дорожки 2-4, 6-8, 10-12 с нуклеазой Я1; дорожки 3,4, 7,8, 11, 12 в присутствии комплекса ТТК-апоА-1.
Следует отметить, что аналогичные результаты ферментативного анализа получены и с более коротким дуплексом СС(ССС), СС(ССС)3. Ранее методом малоуглового рентгеновского рассеяния была показана стехиометрия аддукта «олигонуклеотид П-комплекс ТГК-апоА-1» 1:1 по белку апоА-1 [3].
Функциональная роль повторов вида ССв в 5'-нетранслируемой области гена ГМШ была показана в работе |6]. Авторы определили, что 25% носителей повторов Свв имеют некоторые «эмоциональные и поведенческие особенности». Авторы [6] считают, что ССв-повторы осуществляют контроль трансляции мРНК, связанный со способностью тринуклеотидиых повторов стабилизировать шпилечные структуры в РНК. На наш взгляд такие повторы в ДНК также могут создавать особые структуры, что при связывании комплекса апоА-1-ТГК способствует активации копирования близлежащего гена. На олигонуклеотидных дуплексах вида СС(ССС)п-СС(ССС)п (п=3, 5), имитирующих сайты связывания комплекса ТГК-апоА-1 и способных образовывать квадруплексы [7| ранее было обнаружено влияние этого комплекса на их структуру [3|.
Изучение условий копирования ДНК со структурой, измененной в присутствии комплексов стероид-апоА-1, показало, что индукция копирования осуществляется в присутствии ТГК и андростерона (АС), в небольшом интервале концентраций комплекса с аноА-1. Было показано, что при мольном соотношении ДНК/комплекс апоА-1-стероид (ТГК, АС), равном 1:50, синтезируется больше копий ДНК, чем в отсутствие комплекса (Рис. 2). При дальнейшем повышении концентрации комплекса стероид-апоА-1 до 200-кратного мольного избытка наблюдали ингибирование реакции копирования до практически полного се отсутствия (Рис. 2). Это можно объяснить связыванием избытка комплекса сте-роид-апоА-1 с теми последовательностями ДНК. на которых осуществлялось копирование, и неспособностью ДНК-полимеразы конкурировать за эти участки. Поскольку было показано, что комплексы апоА-1-сгеронд (ТГК, АС, ДЭАС и ДЭАС-сульфат) способны влиять на вторичную структуру ДНК, вызывая появление одионите-вых последовательностей в сайтах связывания [3, 4|, можно утверждать, что на этих участках инициируется копирование ДНК при небольших молярных избытках комплексов стероид-апоА-1 (ТГК, АС).
Заключение
Методом ферментативного анализа показано «расплетающее» действие комплекса апоА-1-ТГК на дуплексы СС(ССС)[-СС(ССС)п (п=3, 5). по-
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 г.
39
12 3 4
Рис. 2. Влияние комплекса ТГК-апоЛ1 на копирование ДНК.
1 — ДНК, контроль;
2 — ДНК+комплекс ТГК-апоА1, 1:50. моль/моль;
3 — ДНК+ комплекс ТГК-апоМ, 1:100;
4 — ДНК+комплекс ТГК-(шоА1, 1:200
лобные сайтам связывания комплекса на ДНК. Появление однонитевых участков в сайтах связывания вида GCC/GGC комплекса аноА-1-гормон с ДНК активирует копирование изолированной ДНК in vitro и способно на наш взгляд служить инициатором процесса репликации in vivo. Это в свою очередь активирует пролиферацию гепато-цитов, т.е. усиливает регенераторные процессы, восстанавливая гомеостаз в стрессирующих условиях.
Сокращения: ТГК-тетрагидрокортизол, аноА-1-аполипопротеин А-I. ВР-бромфеноловын, ХС-ксилен-цианол, CC(GCC), - Г1. GG(CGG)S - Г2
THE GCC/GGC SEQUENCES FUNCTION AT THE ACTION OF STEROID HORMONE METABOLITES IN COMPLEXES WITH APOA-I ON DNA
O.I. Gimautdinova, E.Ju. Velichko, V.V. Bazaluk
SI-nuclease sensitivity of oligonucleotide duplexes CC(GCC)nGG(CGG)n (n=3,5) in the presence of the tctrahvdrocortisol-apolipoprotein A-I complex was studied. It was shown the formation of single-stranded oligonucleotides that can be hydrolyzed by SI nuclease that confirms «untwisted» action of the tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex on the DNA double chain. It was shown the initiation role of eukariotic DNA binding sites with steroid-apolipoprotein A-I (tetrahydrocortisol, an-drosteron) complexes in the copy reaction in vitro.
Литература
1. Панин JIM. Явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей / Л.Е. Панин // Бюл. СО РАМН.
- 1998. -№3, — С. 11-23.
2. Панин Л.Е. Роль аполнпопротеина А-I в активации биосинтеза белка и ДНК в гепатоцнтах под влиянием стероидных гормонов / Л.Е. Панин. О.М. Хо-1ЦСНКО. И.Ф. Усынин // Бюл. эксп. биол. и медицины. -2001.-Т. 131.-С. 63-65.
3. Panin L.E. Tetrahydrocortisol-apolipoprotein A-I complex specifically interacts with eukaryotic DNA and GCC elements of genes / L.E. Panin, F.V. Tuzikov, O.I. Gimautdinova // J. Steroid Biochem. and Mol. Biol. — 2003. - Vol. 87. - P. 309-318.
4. Специфические изменения вторичной структуры ДНК эукариот иод влиянием комплекса тетрагидро-кортизол-аполипопротеин А-I / О.М. Гимаутдинова, Л.Е. Панин, П.А. Кузнецов, М.В. Еттянова-Акимжано-ва // Молекуляр. биология. — 2002. — Т. 36. — С. ЮЗ-105.
5. Manuamuc Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маннатнс, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М., 1984. - С. 146-272.
6. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome / A.J. Verkerk, M. Pieretti, J.S. Sutcliffe et al. // Cell. — 1991. — Vol. 65. — P. 905-914.
7. Simonsson T. G-quadruplex DNA structures — variations on a theme / T. Simonsson // Biol. Chem. — 2001.
- Vol. 382. - P. 621-628.
40
БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, №5 (127), 2007 r.
