Влияние метилирования промотора Kiss1 на подавление экспрессии гена в клетках рака молочной железы и его метастазов в головном мозге

Каверина Наталья Владимировна; Уласов Илья Валентинович; Фаворская Ирина Алексеевна; Зборовская Ирина Борисовна; Барышников Анатолий Юрьевич; Кадагидзе Заира Григорьевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наталья Владимировна Каверина1, Илья Валентинович Уласов2, Ирина Алексеевна Фаворская3, Ирина Борисовна Зборовская4, Анатолий Юрьевич Барышников5, Заира Григорьевна Кадагидзе6

ВЛИЯНИЕ МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРА KISS1 НА ПОДАВЛЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА В КЛЕТКАХ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И ЕГО МЕТАСТАЗОВ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ

1 Аспирант, лаборатория клинической иммунологии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

2 К. б. н., ведущий научный сотрудник, центр опухолей головного мозга,

Университет Чикаго (5841 Мариленд Авеню, Чикаго, Иллинойс, 60637, США)

3 Научный сотрудник, лаборатория регуляции онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

4 К. б. н., заведующая, лаборатория регуляции онкогенов НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

5 Профессор, д. м. н., директор, НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

6 Профессор, д. м. н., заведующая, лаборатория клинической иммунологии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)

Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24,

НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, лаборатория клинической иммунологии опухолей, Каверина Наталья Владимировна; e-mail: [email protected]

Проведено исследование экспрессии и метилирования гена — супрессора опухолевого роста KISS1 в клетках рака молочной железы и его метастазов в головном мозге. Иммуногистохимический анализ экспрессии гена KISS1 проведен на 44 образцах первичного инвазивного протокового рака молочной железы и 44 образцах его метастазов в головном мозге. Обнаружено, что экспрессия белка KISS1 в клетках метастазов рака молочной железы в головном мозге значительно ниже, чем в клетках первичного рака молочной железы (р = 0,002). Для выявления взаимосвязи между экспрессией белка и уровнем мРНК проведен сравнительный анализ содержания мРНК гена-мишени методом количественной полимеразной цепной реакции. Выявлено, что уровень экспрессии мРНК гена KISS1 в клетках метастазов в головном мозге в 11 раз ниже, чем в клетках первичного рака молочной железы ф = 0,038). C помощью метилчувствительной полимеразной цепной реакции выявлена высокая частота метилирования гена KISS1 в клетках метастазов рака молочной железы в головном мозге (90,9%) и первичного рака молочной железы (41%). В качестве контроля изучены 5 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы, в которых метилирование не выявлено. Полученные результаты подтверждают, что метилирование промотора KISS1 может быть одной из причин снижения экспрессии мРНК и белка KISS1 в клетках метастазов рака молочной железы в головном мозге.

Ключевые слова: рак молочной железы, инвазивный протоковый рак молочной железы, церебральные метастазы рака молочной железы, KISS1, ген — супрессор опухолевого роста и метастазирования, метилчувствительная полимеразная цепная реакция.

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующие позиции по заболеваемости злокачественными новообразованиями у женщин. Среди данной популяции смертность, вызываемая РМЖ, достигает 25—40% от числа за-

болевших [1]. Метастатическая болезнь обусловливает повышение смертности при РМЖ. В общей группе больных с метастатическим поражением головного мозга (ГМ) РМЖ находится на 2-м месте, уступая только раку

легкого. Так, по данным литературы, частота метаста-зирования в ГМ при РМЖ составляет 10—20% [2]. При аутопсии метастазы в ГМ диагностируют в 30% случаев [3]. Прогноз для жизни больных с метастазами в ГМ в большинстве случаев неблагоприятен: независимо от возможных методов лечения продолжительность жизни пациентов не превышает 12—24 мес. Таким образом, необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых специфичных маркеров ранней диагностики метастазирования при РМЖ очевидна.

В настоящее время помимо онкогенов и генов — супрессоров опухолевого роста, положительно или отрицательно регулирующих формирование первичной опухоли, выделяют новый класс генов, функцией которых является регуляция метастазирования. Изучение данного класса генов расширяет понимание механизмов опухолевой прогрессии, а также представляет практический интерес с точки зрения поиска новых мишеней для терапии онкологических заболеваний. Среди генов — супрессоров метастазирования известны KAI, NM23, а также KISS1. Впервые ген-супрессор KISS1 был обнаружен в клетках метастазирующей меланомы в 1996 г. [4]. Позднее М. Е. Miele и соавт. [5] и F. Shirasaki и соавт. определили локализацию данного гена в локусе 6q16.3-q23 и выяснили, что в результате мутаций гена KISS1 способность к метастазированию клеток меланомы увеличивается [5; 6].

Известно, что наряду с генетическими событиями, обусловливающими инактивацию клеточных генов вследствие изменения последовательности ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но значительно изменяющие экспрессию генов [7]. Одним из таких эпигенетических механизмов является аберрантное гиперметилирование специфических последовательностей островков CpG, расположенных в 5 -регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена. Практически половина молчащих генов-супрессоров и генов репарации инактивируются в результате метилирования промотор-ного района. Метилирование ДНК — важнейший механизм инактивации генов — супрессоров опухолей самых различных морфологических типов [8]. Анализ наиболее часто метилируемых генов способствует созданию систем диагностических и прогностических маркеров и при РМЖ.

Основная задача нашей работы состояла в проведении сравнительного анализа активности гена KISS1 в клетках метастазов в ГМ и первичного РМЖ, а также в исследовании статуса метилирования промотора гена в указанных выше клинических образцах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использованы 44 образца метастазов в ГМ, полученных от больных РМЖ, и 44 образца инвазивного протокового РМЖ. В качестве контроля в реакции метилчувствительной полимеразной цепной ре-

акции (МЧ-ПЦР) использованы 5 образцов морфологически нормальной ткани молочной железы, взятых от доноров без онкологических заболеваний в анамнезе. Все клинические образцы получены в клинике РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина в результате хирургических вмешательств (см. табл. 1).

Иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимический анализ проводили на срезах (4 мм) с предназначенных для морфологического исследования парафиновых блоков опухолей. Первичные антитела KISS1 были любезно предоставлены разработчиком (проф. Д. Велш, Университет Алабамы, Бирменгем, США). Парафиновые срезы депарафинизировали и ре-гидратировали по стандартной методике. Для «демаскировки» антигенов срезы прогревали на водяной бане в предварительно нагретом до 95—99 °С 0,01 M цитратном буфере (pH 6,0) в течение 40 мин. Затем стекла охлаждали при комнатной температуре в течение 20—30 мин, инкубировали в фосфатном буфере (pH 7,6) 5 мин и 20 мин в темноте с 3% водным раствором перекиси водорода для блокирования эндогенной пероксидазы. Затем срезы промывали на протяжении 5 мин в 0,01 М фосфатном буфере (pH 7,6) и инкубировали 15 мин с 5% водным рас-

Таблица 1

Характеристика клинических образцов, полученных от больных РМЖаб

Характери- стика РМЖ Метастазы РМЖ в ГМ р

Возраст, годы

Средний 50,6 ± 13,4 51 ± 10,5 0,325

Моложе 35 4 (9,1) 2 (4,54)

35—55 16 (36,3) 26 (59)

Старше 55 24 (54,6) 16 (36,4)

Степень злокачественности

1 16 (36,3) 0 <0,001

2 12 (27,4) 2(4,5)

3 16 (36,3) 42 (95,45)

Отдаленные метастазы

Нет 30 (65) 7 (16) 0,001

Есть 14 (35) 37 (84)

а В скобках указаны проценты.

б Для определения различий по возрасту использован критерий Манна— Уитни, для оценки различий групп по качественным признакам — односторонний критерий Фишера.

твором обезжиренного молока (Sigma) для блокирования неспецифического связывания антител.

Инкубацию с первичным антителом KISS1 (1/200) проводили при комнатной температуре в течение 60 мин. Впоследствии стекла промывали 3 раза по 5 мин в фосфатном буфере. Инкубацию с проявочной тест-системой [DAKO Envision® + kit] проводили при комнатной температуре в течение 40 мин, затем срезы промывали 2 раза по 5 мин. Для визуализации им-муногистохимической реакции использовали систему DAB+ [DAKO]. Реакцию проводили в течение 5—10 мин. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и заключали в канадский бальзам. Интенсивность реакций, локализованных в цитоплазме, оценивали полуколичественным способом по балльной шкале от 0 до 3 с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции и ее локализацию: 0 — отсутствие реакции, 1 — слабая реакция (от 5—20% окрашенных клеток),

2 — умеренная реакция (20—50% окрашенных клеток),

3 — сильная реакция (более 50% окрашенных клеток).

Выделение ДНК

ДНК выделяли из архивных парафиновых блоков с использованием набора «DNeasy Blood and Tissue Kit» по методике, рекомендованной производителем («Qiagen»). Качество выделенной ДНК контролировали путем электрофореза в 1% агарозном геле и измерения концентрации с помощью спектрофотометра «Thermo Scientific NanoDrop 1000». Полученный раствор ДНК хранили при температуре —20 °С.

Метилирование гена KISS1 определяли с помощью МЧ-ПЦР. При подготовке к бисульфитному секвениро-ванию геномную ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который вызывает переход неметилированных остатков цитозина в урацил, но не изменяет метилированные цитозины. Таким образом, генерируется разница в нуклеотидной последовательности между метилированной и неметилированной ДНК.

Позитивный контроль для бисульфитной реакции был получен от компании «ZYMED» (образец с универсальной метилированной ДНК, № D5011). Бисульфитную обработку проводили при помощи набора «EZ DNA Methylation™ Kit, Zymo Research» по протоколу, оптимизированному для полученных из архивных парафиновых срезов образцов ДНК. Обработанную бисульфитом натрия ДНК амплифицировали в ПЦР объемом 25 мкл. Реакционная смесь содержала lx HotStar Taq буфер, 2,0 единицы активности полимеразы «Hot Star Taq» («Qiagen»), 1,6 мМ MgC12, 5 пмоль каждого праймера из соответствующей пары, 200 мкмоль каждого дезоксину-клеотидтрифосфата, 2 мкл обработанной бисульфитом натрия ДНК. ПЦР-циклирование состояло из активации полимеразы в течение 10 мин при температуре 95 °С; 50 циклов, включающих шаги денатурации (95 °С, 15 с), отжига праймеров (52—60 °С, 30 с), элонгации (72 °С, 30 с); а также шага завершающего синтеза при температуре 72 °С в течение 5 мин. Праймеры для ПЦР были подобраны к промоторному району гена KISS1, соответствующие модифицированной бисульфитом матрице. Продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле.

Выделение РНК и ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Тотальная РНК была выделена из 88 архивных патоморфологических образцов ткани РМЖ и его метастазов в ГМ. Архивные срезы депарафинизировали с помощью ксилола, регидратировали путем последовательной инкубации в 96, 80 и 70% этаноле и проводили дальнейшее лизирование и экстракцию РНК с использованием набора «RNeasyR Mini kit» («Qiagen»). Качество выделенной РНК контролировали с помощью анализатора («Agilent Technologies»). Для реакции обратной транскрипции использовали набор компании «iScriptTM c DNA Synthesis Kit» («Bio-Rad»). Реакция проходила в объеме 20 мкл и включала 1 мкл фермента обратной транскриптазы («iScript reverse transcriptase»), 4 мкл 5-кратного раствора реакционной смеси и 15 мкл тотальной РНК.

Использовали следующий температурный режим: 42 °C в течение 30 мин с последующей инактивацией фермента при температуре 85 °C в течение 15 мин. Полученную кДНК хранили при температуре —20 °C.

Количественная ПЦР

Экспрессию гена KISS1 измеряли при помощи количественного ПЦР-анализа на приборе «OPTICON 2 Detection System» («Bio-Rad Laboratories», США). В качестве контрольного гена выбран ген GAPDH. Праймеры были подобраны с помощью программы Primer Design и проверены на специфичность. Последовательность праймеров указана в табл. 2. ПЦР (суммарный объем 10 мкл) содержала 1 мкл раствора кДНК, 300 нмоль/л праймеров и смесь ДНК-полимеразы, флуоресцентного красителя, однократного буфера ПЦР (pH 8,3) и MgCl2 («SYBRR GreenERTM Super Mix», «Invitroge»). Реакцию начинали с 10-минутной активации ДНК-полимеразы при температуре 95 °C; затем проводили 45 циклов амплификации (денатурация: 15 с при температуре 95 °C; отжиг: 30 с при температуре 60 °C; синтез: 30 с при температуре 72 °C). Уровень экспрессии оценивали путем вычисления соотношения относительных количеств копий кДНК гена-мишени и контрольного гена (GAPDH). Анализ результатов проводили с использованием метода DCt и програмного обеспечения, предоставленого фирмой «Applied Biosystems».

Статистический анализ данных проводили с использованием программы «PRISM» (v. 4.0). Для оценки различий групп с нормальным распределением признака использовали критерий Стьюдента для независимых переменных, для оценки различий между группами в отсутствие нормального распределения признака — критерий Манна—Уитни, для оценки различий групп по качественным признакам — односторонний критерий Фишера, для анализа распределения изучаемых признаков — критерий согласия Колмогорова—Смирнова. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 (95% точности).

результаты и обсуждение

При иммуногистохимическом исследовании образцов экспрессия белка KISS1 выявлялась в виде гомогенного окрашивания цитоплазмы опухолевых клеток. Интенсивность реакции и процент антигенположитель-

Таблица 2

Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР и бисульфитного секвенирования

Метод Последовательность праймеров Ссылка

ОТ-ПЦР Прямая Обратная Ikeguchi M.,

ACTCACTGGTTTCTTGGCAGC ACCTTTTCTAATGGCTCCCCA 2003

Метилированные

Прямая Обратная

Бисульфитное AAAGTTTCGTTTCGGAGGGTTC CTTTTATAAAACCCGAAATAACG Satoshi

секвенирование Неметилированные Yamashita., 2005

Прямая Обратная

AAAGTTTTGTTTTGGAGGGTTT CCTTTTATAAAACCCAAAATAACA

ных клеток варьировали в различных опухолях и иногда в различных участках одной и той же опухоли (рис. 1). В клетках первичного РМЖ отсутствие экспрессии белка KISS1 наблюдали в 3 (6,8%) случаях, слабую интенсивность реакции — в 8 (18,2%). Умеренная интенсивность окраски выявлена в 21 (47,7 %) образце, сильная — в 12 (27,3%). В клетках метастазов РМЖ в ГМ обнаружена слабая реакция в 13 (29,5%) образцах, умеренная — в 20 (45,5%), сильная — в одном (2,3%); в 10 (22,7%) образцах реакция отсутствовала.

При статистической обработке результатов показано, что экспрессия белка KISS1 в клетках метастазов РМЖ в ГМ значительно ниже, чем в клетках первичного РМЖ (р = 0,002; рис. 2).

Для выявления взаимосвязи между экспрессией белка KISS1 и уровнем мРНК мы провели сравнительный анализ содержания мРНК методом ОТ-ПЦР в клетках метастазов РМЖ в ГМ и первичного РМЖ. Результаты представлены с помощью логарифмической шкалы с основанием 10, уровень экспрессии мРНК гена KISS1 в клетках метастазов РМЖ в ГМ в 11 раз ниже, чем в клетках первичного РМЖ (р = 0,038; рис. 3).

По данным литературы, анализ с помощью ОТ-ПЦР при раке легкого позволяет выявлять минимальную экспрессию гена KISS1 либо ее полное отсутствие не только в опухолях, но и в прилегающих условно нормальных тканях. Таким образом, отмечено соответствие между экспрессией мРНК гена KISS1 и уровнем белка в клетках первичного РМЖ и метастазов РМЖ в ГМ.

В дальнейшем исследовании с помощью МЧ-ПЦР проведен анализ метилирования островков CpG промотора гена KISS1 в 44 образцах РМЖ, 44 образцах метастазов РМЖ в ГМ и 5 образцах нормальной ткани молочной железы (рис. 4). При этом обнаружен высокий уровень метилирования промотора гена KISS1 в образцах РМЖ — в 18 (41%) случаях и достоверно высокий — в образцах метастазов РМЖ в ГМ — в 40 (90,9%; р < 0,001) (рис. 5). В нормальной ткани молочной железы не выявлено метилирования промотора гена KISS1.

Как показано ранее, KISS1 является одним из основных генов — супрессоров опухолевого роста, экспрессия которого снижена в клетках злокачественной меланомы и РМЖ [9]. Отмечается, что выраженная экспрессия белка связана с менее агрессивным фенотипом первич-

'V. :

‘Л -

' ' ' ч Л-■О*

1 1 ' ; 1л*

.

Рисунок 1. Метастазы РМЖ в ГМ. Иммуногистохимическая реакция с антителами к белку KISS1 (х40).

А. Отсутствие экспрессии KISS1. Б. Слабая экспрессия KISS1. В. Умеренная экспрессия KISS1. Г. Положительный контроль (инвазивный протоковый РМЖ).

100

90

80

70

и 60

о

3

ГС

га 50 о.

vo

о

“ 40 о

4

30

20

10

0

III

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

IV

А

Б

Рисунок 2. Экспрессия гена К18Э1 в клетках метастазов РМЖ в ГМ и первичного РМЖ ф = 0,002, односторонний критерий Фишера). I — сильная реакция (более 50% окрашенных клеток); II — умеренная реакция (20—50% окрашенных клеток); III — слабая реакция (5—20% окрашенных клеток); IV — отсутствие реакции.

А. РМЖ. Б. Метастазы РМЖ в ГМ.

ной опухоли [10]. При исследовании уровня экспрессии мРНК гена KISS1 в тканях рака мочевого пузыря, рака щитовидной железы, рака молочной железы и гепато-целлюлярной карциномы выявлена обратно пропорциональная зависимость между экспрессией гена KISS1 и метастатической прогрессией [11]. Результаты настоящего исследования согласуются с этими данными. Однако причины снижения экспрессии гена KISS1 еще во многом неясны. В последнее десятилетие установлено, что в многостадийном процессе образования опухолей нарушение функции клеточных генов возможно в результате не только генетических событий (точечные мутации, делеции, амплификация), но и эпигенетических изменений [12]. Доказано, что потеря экспрессии генов — супрессоров опухолевого роста в результате аномального гиперметилирования островков CpG, расположенных в промоторных областях, является одним из самых ранних событий, происходящих в злокачественной клетке. Это позволяет использовать аномальное метилирование данных генов в качестве раннего маркера злокачественного процесса [13].

Число генов, для которых обнаружен эпигенетический механизм инактивации экспрессии в опухолях, постоянно растет, что свидетельствует о широком распространении этого механизма в процессе канцерогенеза [14]. В ряде исследований изучено метилирование генов — супрессоров опухолевого роста при метаста-зирующем раке молочной железы [15]. В. Л. Metge и со-авт. показали, что промотор гена-супрессора BRMS1 ги-перметилирован в клетках метастазов рака молочной железы в регионарных лимфатических узлах [16]. В немногочисленных исследованиях изучено метилирование некоторых генов-супрессоров в клетках метастазов

III

IV

РМЖ в ГМ [17]. Показано, что при РМЖ частота метилирования гена DAPK также коррелирует с метастазирова-нием опухолевых клеток в ГМ [18].

Таким образом, полученные результаты подтверждают, что метилирование промотора гена KISS1 может быть одной из причин снижения экспрессии как мРНК, так и белка гена в клетках церебральных метастазов РМЖ. Идентификация генов с высокой частотой метилирования может быть использована для ранней диагностики злокачественного процесса и определения прогноза развития и поведения опухоли. Поскольку многочисленные метилированные гены (в частности, p16) обнаруживаются в мокроте курящих и в сыворотке крови задолго до постановки клинического диагноза, молекулярно-генетическое определение аберрантного метилирования промоторов генов применяется в ряде передовых клиник мира для ранней диагностики рака легкого [19]. Разработан ряд технологий для массового скрининга профиля метилирования в целях как ранней диагностики, так и мониторинга опухолевого процесса [15].

Предпринята попытка оценить конкордантные взаимодействия в метилировании 20 различных генов и дать общий эпигеномный анализ для разных стадий развития аденокарциномы пищевода. При исследовании 104 образцов метаплазированных и дисплазированных тканей кишечника при болезни Баррета, большая часть из которых впоследствии малигнизируется, обнаружен разный уровень метилирования генов. Несмотря на отсутствие морфологических отличий, образцы нормальной слизистой оболочки и метапластических участков при дисплазии и раке демонстрируют значительно более высокий общий уровень метилирования, чем в отсутствие прогрессирования основного заболевания. В таких образцах нормальной слизистой оболочки пищевода и желудка наиболее часто выявлялось метилирование гена APC, а также генов CALCA, MGMT и TIMP3. Аберрантное ме-

А Б

Рисунок 3. Экспрессия мРНК гена К18Э1 в клетках метастазов РМЖ в ГМ и первичного РМЖ ф = 0,038, критерий Стьюдента).

А. РМЖ. Б. Метастазы РМЖ в ГМ.

Положительный контроль

200 п. н.

100 п. н.

Л

1 2 3 4 5 6 7

Метилированные образцы ДНК

Неметилиро-ванные образцы ДНК

Б

150 п. н.

Праймер

150 п. н.

Праймер

В

Рисунок 4. Анализ метилирования промоторной области гена Ківві в клетках метастазов РМЖ в ГМ. К+ — положительный контроль; К----отрицательный контроль

А. Определение чувствительности МЧ-ПЦР на контрольных образцах (образец с универсальной метилированной ДНК, «ТУМЕй», №05011); Маркер — маркер молекулярной массы. Б. Оценка метилирования гена KISS1 в тканях РМЖ (7 образцов, №1 —7). В. Оценка метилирования гена KISS1 в метастазах РМЖ в ГМ (10 образцов, №1—10).

тилирование наблюдалось в самых различных участках одних и тех же тканей, что свидетельствует об общем нарушении контроля метилирования при онкогенезе в пищеводе. Авторы не обнаружили доказательств существования групп опухолей с определенным фенотипом метилирования островков CpG [20].

заключение

Полученные в настоящем исследовании данные свидетельствуют о достоверном снижении уровня экспрессии белка и мРНК гена-супрессора KISS1 в клетках метастазов РМЖ в ГМ по сравнению с таковым в первичном РМЖ.

При анализе статуса метилирования гена KISS1 наиболее высокая частота аберрантного метилирования промоторного региона обнаружена в клетках метастазов РМЖ в ГМ (90,9%), при этом достаточно высокий уровень метилирования отмечен в первичном РМЖ (41%).

ЛИТЕРАТУРА

1. Аксель Е. М. Статистика злокачественных образований женских половых органов // Опухоли женск. репрод. сист. — 2009. — № 1—2. — С. 79—2.

2. Cheng X., Hung M. C. Breast cancer brain metastases. // Cancer

1 23456789 10

Метилированные образцы ДНК

Неметилиро-ванные образцы ДНК

150 п. н. Праймер

100 90 -80 -70 -

И 60 -

о

ц

з

ел 50 — р б о

§ 40 -ол Д

30 -20 -10 -0

Рисунок 5. Сравнение частоты метилирования гена — супрессора опухолевого роста Ківві в клетках метастазов РМЖ в ГМ и первичного РМЖ (р < 0,001, критерий согласия Колмагорова—Смирнова). I — положительные по метилированию образцы ДНК; II — отрицательные по метилированию образцы ДНК.

А. РМЖ. Б. Метастазы РМЖ в ГМ.

Metastasis Rev. — 2007. — Vol. 3—4. — P. 635—643.

3. Gonzales-Angulo A. M., Hortobagyi G. N. Brain metastases and breast cancer subtypes // Onkologie. — 2010. — Vol. 33. — P. 143—144.

4. KISS-1, a novel human malignant melanoma metastasis-suppressor gene / Lee J. H., Miele M. E., Hicks D. J., Phillips K. K., Trent J. M., Weissman B. E., Welch D. R. // J. Natl. Cancer. Inst. — 1996. — Vol. 88. — P. 1731—1737.

5. A human melanoma metastasis suppressor locus maps to 6q16.3-q23 / Miele M. E., Jewett M. D., Goldberg S. F., Hyatt D. L., Morelli C., Gualandi F., Rimessi P., Hicks D. J., Weissman B. E., Barbanti-Broda-no G., Welch D. R. // Int. J. Cancer. — 2000. — Vol. 86. — P. 524—528.

6. Loss of expression of metastasis suppressor gene KISS1 during melanoma progression and its association with LOH of chromosome 6q16.3-q23 / Shirasaki F., Takata M., Hatta N., Takehara K. // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 7422—7425.

7. Karpf A. R., Jones D. A. Reactivating the expression of methyla-tion silenced genes in human cancer // Oncogene. — 2002. — Vol. 21. — P. 5496—5503.

8. Guarneri V., Conte P. F. The curability of breast cancer and the treatment of advanced disease // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. — 2004. — Vol. 31. — Suppl. 1. — P. 149—160.

9. Lee J. H., Welch D. R. Suppression of metastasis in human breast carcinoma MDA-MB-435 cells after transfection with metastasis suppressor gene, KISS-1 // Cancer Res. — 1997. — Vol. 57. — P. 2384—2387.

10. Новые маркеры метилирования и экспрессии генов при раке молочной железы / Кузнецова Е. В., Кекеева Т. В., Ларин С. С., Землякова В. В., Бабенко О. В., Немцова М. В., Залетаев Д. В., Стрельников В. В. // Мол. биол. — 2007. — Т. 41. — № 4. — С. 624—633.

11. Requirement of KISS1 secretion for multiple organ metastasis suppression and maintenance of tumor dormancy / Nash K. T., Phad-ke P. A., Navenot J. M., Hurst D. R., Accavitti-Loper M. A., Sztul E., Vai-dya K. S., Frost A. R., Kappes J. C., Peiper S. C., Welch D. R. // J. Natl. Cancer Inst. — 2007. — Vol. 99. — P. 309—321.

12. Сравнительный анализ аномального метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов p16/ CDKN2A и р14/ARF при немелкоклеточном раке легкого и остром лимфобластном лейкозе / Землякова В. В., Стрельников В. В., Зборовская И. Б., Балукова О. В., Майорова О. А., Васильев Е. В., Залетаев Д. В., Немцова М. В. // Мол. биол. — 2004. — Т. 38, № 6. — С. 966—972.

13. Aberrant methylation of gene promoter in cancer-concepts, mis-concepts and promise / Baylin S. B., Belinsky S. A., Herman J. G. //J. Natl. Cancer. Inst. — 2000. — Vol. 92. — P. 1460.

14. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях / Залетаев Д. В., Немцова М. В., Стрельников В. В., Бабенко О. В., Васильев Е. В., Землякова В. В., Жевлова А. И., Дрозд О. В. // Мол. биол. — 2004. — Т. 38, № 2. — С. 213—223.

15. Methylation and gene silencing of the Ras-related GTPase gene in lung and breast cancers / Suzuki M., Shigematsu H., Shames D. C., Su-naga N., Takahashi T., Shivapurkar N., Iizasa T., Minna J. D., Fujisawa T., Gazdar A. F. // Ann. Surg. Oncol. — 2007. — Vol. 4. — P. 1397—1404.

16. Epigenetic silencing contributes to the loss of BRMS1 expression in breast cancer / Metge B. J., Frost A. R., King J. A., Dyess D. L., Welch D. R., Samant R. S., Shevde L. A. // Clin. Exp. Metastasis. — 2008. — Vol. 25. — P. 753—763.

17. Reduced metastasis-suppressor gene mRNA-expression in breast cancer brain metastases / Stark A. M., Tongers K., Maass N., Meh-

dorn H. M., Held-Feindt J. // J. Cancer Res. Clin. Oncol. — 2005. — Vol. 131. — P. 191—198.

18. Promoter methylation status of multiple genes in brain metastasis of solid tumors / Gonzalez-Gomez P., Bello M. J., Alonso M. E., Amino-so C., Lopez-Marin I., De Campos J. M., Isla A., Gutierrez M., Rey J. A. // Int. J. Mol. Med. — 2004. — Vol. 13. — P. 93—98.

19. Enhancing effect of connexin 32 gene on vinorelbine-induced cytotoxicity in A549 lung adenocarcinoma cells / Sato H., Fukumoto K., Hada S., Hagiwara H., Hagiwara H., Fujimoto E., Negishi E., Ueno K., Yano T. // Cancer Chemother. Pharmаcol. — 2007. — Vol. 60. — P. 449— 457.

20. Epigenetic patterns in the progression of esophageal adenocarcinoma / Eads C. A., Lord R. V., Wickramasinghe K., Long T. I., Kurum-boor S. K., Bernstein L., Peters J. H., DeMeester S. R., DeMeester T. R., Skinner K. A., Laird P. W. // Cancer Res. — 2001. — Vol. 61. — P. 3410— 3418.

Поступила 11.12.2011

Natalia Vladimirovna Kaverina1, Ilya Valentinovich Ulasov2, Irina Alexeyevna Favorskaya3, Irina Borisovna Zborovskaya4, Anatoliy Yurievich Baryshnikov5, Zaira Grigoryevna Kadagidze6

THE EFFECT OF KISS1 PROMOTOR METHYLATION ON DOWNREGULATION OF GENE EXPRESSION IN CELLS OF BREAST CANCER AND CEREBRAL METASTASES FROM BREAST CANCER

1 Postgraduate Student, Tumor Clinical Immunology Laboratory,