CC BY
22
УДК 615.367:616.42-001:616.36-002
ВЛИЯНИЕ ЛИТИЙСОДЕРЖАЩЕЙ КОМПОЗИЦИИ НА ЭТАНОЛ-ИНДУЦИРОВАННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В ПЕЧЕНИ И МОЗГЕ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ
Анастасия Анатольевна КОТЛЯРОВА1, Андрей Юрьевич ЛЕТЯГИН1, Татьяна Генриховна ТОЛСТИКОВА2, Наталия Петровна БГАТОВА1, Любовь Никифоровна РАЧКОВСКАЯ1
1 НИИ клинической и экспериментальной лимфологии 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2
2 Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН 630090, г. Новосибирск, просп. Академика Лаврентьева, 9
Цель работы - оценить влияние литийсодержащей композиции на развитие патологических процессов в печени и мозге на модели хронической алкогольной интоксикации. Материал и методы. В работе использовались нелинейные мыши-самцы массой 25-30 г. Алкогольную интоксикацию моделировали путем внутрижелудочно-го введения в течение 5 недель 40%-го водного раствора этилового спирта (3 г/кг массы тела) в сочетании с 5%-м раствором этилового спирта в качестве питья ad libitum. Для проведения эксперимента мышей рандомизировали на 3 группы: 1-я получала физиологический раствор (интактный контроль), 2-я - этанол (негативный контроль), 3-я группа получала в течение двух недель этанол и с 15 по 35 сутки, на фоне продолжающегося введения этанола, литийсодержащую композицию в дозе 1120 мг/кг. Забор органов и крови на анализ осуществляли каждые 7 дней, начиная с третьей недели эксперимента. Результаты и их обсуждение. На основании биохимического и гистологического анализа выявлено, что у мышей экспериментальной группы (3-я группа) на фоне введения ли-тийсодержащей композиции сорбента по сравнению с животными из группы негативного контроля (2-я группа) в мозге произошло уменьшение перинейронального и перикапиллярного отека, снижение общего содержания гиперхромных нейронов; в печени уменьшились размеры межклеточного пространства. Таким образом, предлагаемая лекарственная форма лития (иммобилизованного на матрице-носителе) оказывает комплексное нейро- и гепатопротекторное действие, проявляя антитоксические свойства на фоне длительного введения этанола.
Ключевые слова: литий, хроническая алкогольная интоксикация, мыши, печень, префронтальная кора мозга, алюминия оксид.
Соединения лития используются в качестве препаратов, стабилизирующих настроение при биполярных аффективных расстройствах. В настоящее время интерес представляют нейропро-тективный и нейрорегенеративный эффекты лития - как при острых повреждениях мозга, так и при хронических нейродегенеративных заболеваниях, таких как старческая деменция, алкоголизм, болезнь Альцгеймера и др. [14-16, 20]. Препараты лития ограниченно используются в клинике из-за трудности подбора терапевтической дозы, необходимости мониторирования его концентра-
ции в крови, развития побочных эффектов за счет кумуляции в организме. Для улучшения фармакологических свойств комбинирование лития с другими веществами (например, иммобилизация на пористой основе) в перспективе может дать более длительный и безопасный терапевтический эффект, с меньшим количеством побочных реакций. Иммобилизация лития на пористую основу изменяет фармакокинетику лития, убирает резкий пик концентрации в плазме крови, поддерживая ее на терапевтическом уровне.
Котлярова А.А. - аспирант, младший научный сотрудник лаборатории лимфорегуляции, e-mail: [email protected]
Летягин А.Ю. - д.м.н., проф., ведущий научный сотрудник лаборатории лимфорегуляции, e-mail: [email protected]
Толстикова Т.Г. - д.б.н., проф., зав. лабораторией фармакологических исследований, e-mail: [email protected]
Бгатова Н.П. - д.б.н., проф., зав. лабораторией ультраструктурных исследований, e-mail: [email protected]
Рачковская Л.Н. - к.х.н., зав. лабораторией лимфорегуляции, e-mail: [email protected]
Мозг является одним из основных органов-мишеней негативного воздействия этанола. В общем понимании нейродегенеративная патология независимо от этиологии включает следующие процессы: 1) снижение мозгового кровотока; 2) гипоксия; 3) энергодефицит; 4) глутаматная «эксайтотоксичность»; 5) осмотический стресс; 6) интенсификация свободнорадикального окисления; 7) апоптоз, гибель нейронов [1, 19]. Каждый из этих процессов является потенциальной мишенью для терапевтического воздействия. В этой ситуации литий может выступать в качестве антагониста сразу нескольких повреждающих факторов.
Протекторное действие лития при алкогольной нейродегенерации обусловливается его взаимодействием с сигнальными путями клеточного выживания и апоптоза [12, 22]. Литий в терапевтически значимых концентрациях ин-гибирует опосредованный NMDA-рецепторами вход кальция в клетку, который в свою очередь уменьшает последующую активацию ЖК-, р38- и АР-1-зависимых сигнальных путей, тем самым ингибируя внутриклеточное увеличение кальция, а также снижает активность кальпаина и кальпаин-опосредованной активации проапоп-тотической киназной системы Cdk5/p25 [13, 17]. С другой стороны, литий может прямо или косвенно снизить активность GSK-3 за счет нескольких механизмов, что приводит к активации транскрипционных факторов, таких как СЯЕВ и HSF-1, и в результате - к индукции основных ци-топротекторных белков (BDNF , VEGF, ЖР70, Вс1-2). Уменьшение активности GSK-3 дополнительно снижает активность проапоптотического белка р53 и его влияния на Вс1-2. Индукция BDNF является важным механизмом в нейропротекции и литий-опосредованном нейрогенезе. Кроме того, за счет инактивации NF-kB литий оказывает противовоспалительный эффект.
Все вышеперечисленные эффекты лития: антиапоптотическое действие, уменьшение воспаления, усиление ангиогенеза и нейрогенеза, способствуют улучшению поведенческого и функционального восстановления после интоксикации алкоголем [18].
В последнее время все больше данных свидетельствуют о том, что в эксперименте фармакологические эффекты лития развиваются при дозах меньших, чем установленные в терапевтической практике: лабораторным грызунам назначают дозы лития около 1 ммоль/кг (6,9 мг/кг), в то время как амбулаторным больным - 900-1500 мг/сут (12,86-21,43 мг/кг) [4, 23]. Предлагаемая форма доставки лития дает возможность достижения терапевтических эффектов при низких концен-
трациях иона металла в плазме, что, возможно, позволит решить проблемы, возникающие при терапии препаратами лития и создаст перспективу расширения внедрения данной лекарственной формы в клиническую и амбулаторную практику.
Цель работы - оценить влияние литийсодержащей композиции на патологические процессы в печени и мозге (области Fr1-Fr3 префронталь-ной коры) на фоне длительной алкогольной интоксикации.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперимент выполнен на 90 лабораторных белых мышах-самцах массой 25-30 г, которых содержали в виварии при свободном доступе к воде и пище (стандартный гранулированный корм) и естественной смене дня и ночи. Животные были получены из вивария Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск). Все экспериментальные процедуры осуществляли с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директиве Европейского сообщества (86/609/ЕС) и в «Положении об использовании животных в биомедицинских исследованиях».
Алкогольную интоксикацию вызывали ежедневным внутрижелудочным введением в течение 14 дней 40%-го раствора этанола в дозе 3 г/кг и свободным доступом к 5%-му раствору этанола в качестве питья ad libitum в течение 5 недель; алкоголизированные животные содержались без воды [3, 11]. Эта модель алкоголизма позволяет добиться более быстрого развития этанол-инду-цированных изменений поведения по типу асте-нодепрессивного состояния и морфологических изменений в тканях (печени, мозге), чем при ненасильственном (свободный выбор этанол/вода) или полунасильственном (этанол как единственный источник питья) способах введения этанола [21].
В качестве фармакокорректора этанол-ин-дуцированных повреждений мозга и печени использовали оригинальную пористую основу с иммобилизованной на ее поверхности солью лития, разработанную в НИИ клинической и экспериментальной лимфологии.
Исходная пористая основа представляет собой термоактивированный оксид-гидроксид алюминия с нанесенным на его поверхность крем-нийорганическим полимером - полиметилсилок-саном. Литийсодержащую композицию получали путем физической адсорбции цитрата лития на поверхность сорбента.
Все животные были разделены на три группы по 30 мышей в каждой: 1-я группа в течение 5 недель получала физиологический раствор (ин-тактный контроль), 2-я - раствор этилового спир-
та (негативный контроль), 3-я группа получала в течение двух недель этанол и с 15 по 35 сутки, на фоне продолжающегося потребления этанола, литийсодержащую композицию в дозе 1120 мг/кг. В пересчете на ионы лития доза составляла 5,6 мг/кг, она рассчитана в соответствии со справочником Машковского [9], в котором указана суточная дозировка применяемого в лечебных целях лития карбоната 2,1 г.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации. Объектами для светооптического исследования служили печень и мозг (области Fr1-Fr3 префронтальной коры головного мозга). Для светооптического исследования биологические образцы фиксировали в 4%-м растворе параформальдегида, приготовленном на среде Хенкса, дофиксировали в течение 1 ч в 1%-м растворе OsO4 (Sigma, США) на фосфатном буфере (pH 7,4), обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и заключали в эпон (Serva, Германия). Полутонкие срезы толщиной 1 мкм получали на ультрамикротоме Leica EM UC7 (Германия/Швейцария), окрашивали то-луидиновым синим и изучали с помощью светового микроскопа LEICA DME (Германия).
Биохимические показатели крови: активность АлАТ и АсАТ, содержание общего белка, общего билирубина, определяли с использованием стандартных наборов (Biocon). Измерения выполняли на автоматическом фотометре - 5010 «Boehringer Mannheim» (Германия).
Статистическую обработку результатов исследования проводили, вычисляя среднее арифметическое значение (М), ошибку среднего арифметического значения (m) и представляли в виде M ± m. Различия между группами оценивали с помощью непараметрического U-критерия Ман-на-Уитни. За достоверный уровень значимости принимали p < 0,05. Различия на уровне тенденции рассматривали при значениях 0,05 < p < 0,1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Установлено, что пятинедельная алкоголизация животных приводит к увеличению содержания общего белка в 1,1 раза (см. таблицу). Ак-
тивность АлАТ и АсАт, а также уровень АСТ и общего билирубина достоверно не различаются у групп с введением алкоголя и интактного контроля. У группы с введением литийсодержащей композиции значимых отличий от интактного контроля в значениях биохимических показателей нет.
Исследованные биохимические параметры отражают функциональное состояние печени и используются в практике при диагностике патологических процессов, происходящих в печени как алкогольного, так и неалкогольного гене-за [6]. Ферменты АсАТ и АлАТ присутствуют в значительных количествах в органах, таких как печень, почки, миокард, поэтому в норме их концентрации в крови незначительны. Билирубин -один из промежуточных продуктов распада гемоглобина, происходящего в гепатоцитах. При повреждении гепатоцитов, их цитолизе, происходит потеря клетками билирубина, АсАТ и АлАТ, и уровни этих биохимических маркеров в крови возрастают [2]. Повышение содержания общего белка выше нормы (для мышей норма составляет 52,0-57,0 г/л) является признаком грубой патологии печени [2, 6]. В нашем эксперименте этот показатель у мышей 2-й и 3-й групп повышен относительно контроля в 1,1 раза, что подтверждается морфологически компенсаторными реакциями паренхимы печени в ответ на введение этанола.
При макроскопическом исследовании печени животных контрольной группы наблюдается характерное дольчатое строение. Гепатоциты формируют четко выраженные радиально лежащие балки, между которыми находятся умеренно наполненные кровью венозные синусы. Венозные синусоиды в центре долек формируют центральную вену с четко выраженным просветом. Гепа-тоциты многогранной формы содержат 1-2 ядра, цитоплазма клеток равномерно окрашена, клетки плотно прилегают друг к другу. В клеточном ма-триксе присутствуют липидные включения, что можно считать нормой [8].
Через 5 недель введения этанола у животных группы негативного контроля наблюдается компенсаторная реакция паренхимы печени в виде увеличения количества многоядерных ге-
Группа Активность АсАТ, ЕД/л Активность АлАТ, ЕД/л Содержание общего белка, г/л Содержание общего билирубина, мкмоль/л
Контроль (1-я) 44,08 ± 3,14 37,04 ± 5,01 58,45 ± 1,8 3,06 ± 2,48
Негативный контроль (2-я) 35,73 ± 5,60 41,08 ± 2,43 62,84 ± 0,57* 3,20 ± 1,13
Опыт (3-я) 44,85 ± 2,71 33,68 ± 9,40 66,46 ± 4,05* 6,00 ± 3,35
Примечание. Обозначены отличия от величин соответствующих показателей группы контроля (*) при 0,05 <р < 0,1.
Таблица
Биохимические показатели сыворотки крови при алкогольной интоксикации
Рис 1. а - печень после 5-недельного внутрижелудочного введения 40%-го этанола (2-я группа), 21-е сутки. Расширение межклеточного пространства, инфильтрация лимфоидными и плазматическими клетками, зернистая дистрофия. б - печень после 5-недельного внутрижелудочного введения 40%-го этанола на фоне введения ЛЦ/С (3-я группа). Уменьшение размера межклеточного пространства, умеренная воспалительная реакция. Окраска толуидиновым синим, ув. х 400
1
Рис 2. а - структура мозга после 5-недельного внутрижелудочного введения 40%-го этанола (2-я группа), 21-е сутки. В коре выявляется значительное количество гиперхромных нейронов. Ядра нейронов с выраженной конденсацией хроматина. б - структура мозга после 5-недельного внутрижелудочного введения 40%-го этанола на фоне введения ЛЦ/С (3-я группа). Умеренное набухание нейронов, расширение перинейрональных пространств. Окраска толуидиновым синим, ув. х 200
патоцитов. Архитектоника печени мышей на протяжении всего эксперимента была без явных патологических изменений, балочное строение печеночных долек не нарушено. Изменения печени мышей в условиях экспериментальной хронической алкогольной интоксикации характеризуются прежде всего мелкокапельной жировой дистрофией гепатоцитов и расширением межклеточного пространства. В междольковой соединительной ткани, портальных зонах наблюдалась инфильтрация лимфоидными и плазматическими клетками [5].
При алкогольном поражении печени на фоне введения литийсодержащей композиции происходило уменьшение межклеточного простран-
ства, наблюдались единичные нейтрофилы, в перипортальной зоне - слабовыраженная воспалительно-клеточная инфильтрация портальных трактов нейтрофилами, также можно отметить наличие жировой дистрофии.
В структуре ткани области Fr1-Fr3 префрон-тальной коры при алкоголизации наблюдались нарушения микроциркуляции в виде неравномерного кровенаполнения сосудов, стазов. Также отмечалось расширение перинейрональных и периваскулярных пространств, которое является признаком диффузного отека ткани мозга.
При длительном воздействии этанола изменения в нервной ткани в эксперименте носят адаптивный характер и в большинстве своем явля-
ются обратимыми. Наиболее часто встречаются нейроны с изменением тинкториальных свойств по гипо- и геперхромному типу. Подобные изменения в литературе определяют как пограничные и обратимые, на их основе в дальнейшем могут возникать как альтеративные, так и адаптационные изменения [7, 10]. Пограничные изменения являются «срочной» адаптивной реакцией клеток на внешние воздействия и отражают промежуточное состояние нейронов между вариантами биологической нормы и патологии. Основная масса нейронов имеет структурно-функциональную организацию, соответствующую классическим представлениям о строении нервной клетки. В ткани практически отсутствуют пикноморфные нейроны и клеточные тени, наличие которых считается маркером деструктивных (альтеративных) изменений в мозге.
Морфологическое исследование ткани мозга животных на фоне введения литийсодержащей композиции показало, что на 14-21-е сутки по сравнению с нелеченными животными структурные изменения были менее выраженными. Уменьшалось общее содержание гипо- и гипер-хромных нейронов; можно отметить слабовыра-женный интерстициальный отек.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании биохимического и гистологического анализа у мышей на фоне алкогольной интоксикации выявлены функциональная напряженность гепатоцитов, умеренный отек и сморщивание нейронов, которое имеет преимущественно обратимый характер. Гистологическое исследование тканей печени и мозга мышей, получавших исследуемый комплекс, показало, что его введение значимо улучшает гистологическую картину этих органов. Предлагаемая лекарственная форма лития (иммобилизованного на матрице-носителе) оказывает комплексное нейро- и гепатопротекторное действие, проявляя антитоксические свойства на фоне длительного введения этанола.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Батухтина Е.И. Психонейроиммунологиче-ские закономерности формирования зависимости от психоактивных веществ: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Томск, 2014.
2. Бочков В.Н., Добровольский А.Б., Кушлин-ский Н.Е. и др. Клиническая биохимия: учебное пособие / ред. В.А. Ткачук. 3-е изд., испр. и доп. 2008. 264 с.
3. Головенко Н.Я., ЖукМ.С., Зиньковский В.Г. и др. Фармакокинетика этанола у мышей с различной
алкогольной мотивацией // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2001. 132. (9). 281-284.
4. Замощина Т.А. 35 лет изучения солей лития // Бюл. сиб. медицины. 2006. 5. (Прил. 2). 26-29.
5. Ищенко И.Ю., Мичурина С.В. Воздействие сорбента «Энтеросгель» на тканевый микрорайон печени и регионарные лимфатические узлы у крыс с хроническим токсическим гепатитом // Бюл. СО РАМН. 2006. (1). 67-72.
6. Лапин А.А. Клинико-морфологические критерии в диагностике алкогольной болезни: автореф. дис. ... канд. мед. наук. Волгоград, 2007.
7. Лапин А.А., Лапина А.А. Морфогистохими-ческая характеристика сосудистых сплетений головного мозга при острой и хронической алкогольной интоксикации в эксперименте // Естественные науки. 2006. (3). 27-29.
8. Манских В.Н. Патоморфология печени лабораторной мыши: подводные камни на пути к верному диагнозу. http://ruslasa.ru/wp-content/uploads/ Patologiya-pecheni-metodichka-dlya-sayta.pdf
9. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2005. 1216 с.
10. Федоров В.П., Афанасьев Р.В., Сгибнева Н.В., Маслов Н.В. Морфофункциональное состояние ней-роцитов головного мозга при повышенном радиационном фоне // Морфология. 2010. 137. (4). 200.
11. Bertola A., Mathews S., Ki S.H. et al. Mouse model of chronic and binge ethanol feeding (the NIAAA model) // Nat. Protoc. 2013. 8. (3). 627-637.
12. Chakraborty G., Saito M., Mao R.F. et al. Lithium blocks ethanol-induced modulation of protein kinases in the developing brain // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008. 367. (3). 597-602.
13. Chandler L.J., Sutton G. Acute ethanol inhibits extracellular signal-regulated kinase, protein kinase B, and adenosine 3':5'-cyclic monophosphate response element binding protein activity in an age- and brain region-specific manner // Alcohol Clin. Exp. Res. 2005. 29. (4). 672-682.
14. Chiu C.T., Chuang D.M. Molecular actions and therapeutic potential of lithium in preclinical and clinical studies of CNS disorders // Pharmacol. Ther. 2010. 128. (2). 281-304.
15. Chuang D.M. Neuroprotective and neurotro-phic actions of the mood stabilizer lithium: can it be used to treat neurodegenerative diseases? // Crit. Rev. Neurobiol. 2004. 16. 83-90.
16. Chuang D.M., Chen R.W., Chalecka-Fra-naszek E. et al. Neuroprotective effects of lithium in cultured cells and animal models of diseases // Bipolar. Disord. 2002. 4. 129-136.
17. Einat H., Yuan P., Gould T. D., Li J. et al. The role of the extracellular signal-regulated kinase signaling pathway in mood modulation // J. Neurosci. 2003. 23. 7311-7316.
18. Hashimoto R., Takei N., Shimazu K. et al. Lithium induces brain-derived neurotrophic factor
and activates TrkB in rodent cortical neurons: an essential step for neuroprotection against glutamate excitotoxicity // Neuropharmacology. 2002. 43. (7). 1173-1179.
19. Muresanu D.F. Neuroprotection and neuro-plasticity - a holistic approach and future perspectives // J. Neurol. Sci. 2007. 257. (1-2). 38-43.
20. Noble W., Planel E., Zehr C. et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. 102. 6990-6995.
21. Tabakoff B., Hoffman P.L. Animal models in alcohol research // Alcohol Res. Health. 2000. 24. (2). 77-84.
22. Young C., Straiko M.M.W., Johnson S.A. et al. Ethanol causes and lithium prevents neuroapoptosis and suppression of pERK in the infant mouse brain // Neurobiol. Dis. 2008. 31. 355-360.
23. Zhu Z.F., Wang Q.G., Han B.J., William C.P. Neuroprotective effect and cognitive outcome of chronic lithium on traumatic brain injury in mice // Brain Res. Bull. 2010. 83. (5). 272-277.
THE EFFECT OF A LITHIUM-CONTAINING COMPOSITION ON ETHANOL-INDUCED CHANGES IN LIVER AND BRAIN WITHIN THE EXPERIMENTS ON MICE
Anastasiya Anatolevna KOTLYAROVA1, Andrey Yurevich LETYAGIN1, Tatyana Genrikhovna TOLSTIKOVA2, Nataliya Petrovna BGATOVA1, Lyubov Nikiforovna RACHKOVSKAYA1
1 Research Institute of Clinical and Experimental Lymphology 630117, Novosibirsk, Timakov str., 2
2 N.N. Vorozhtsov Novosibirsk Institute of Organic Chemistry of SB RAS 630090, Novosibirsk, AcademikLavrentev av., 9
The work is aimed to assess the effect of lithium-containing composition on pathogenic pathway in liver and brain based on model of chronic alcohol abuse. Materials and methods. During the work we used nonlinear mice - males, weighing 25-30 g. For studies mice were randomly assigned to groups: first group was intact animals, mice from second and third groups received 40 % ethanol solution (3 g per 1 kg body weight) along with 5 % ethanol solution as a free drinking every day for 5 weeks; in addition starting from the third week of the experiment mice from the third group were administered suspension lithium-containing composition intragastrically. Starting from the third week of the experiment organs and blood samplings were taken every seven days for analysis. Results and discussion. Based on biochemical and histological analysis we determined that after lithium-containing composition administration it was observed reduction perineural and perivascular edemas in brain, reduction of total content of hyperchromic neurons and intercellular space reduction in liver among mice from the third intervention group in comparison with another negative control group. Proposed drug dosage form of lithium has a comprehensive protection effect on neurons and hepatic cells, it shows antitoxic property in case of chronic alcohol abuse.
Key words: lithium, chronic alcohol intoxication, mice, liver, prefrontal cortex F1-F3.
Kotlyarova A.A. - postgraduate student, junior researcher of the laboratory of lymphoregulation, e-mai: [email protected]
Letyagin A.Yu. - doctor of medical sciences, leading researcher of the laboratory of lymphoregulation, professor, e-mail: [email protected]
Tolstikova T.G. - doctor of biological sciences, head of the laboratory ofpharmacological investigation, professor Bgatova N.P. - doctor of biological sciences, head of the laboratory ultrastructural researches, professor, e-mai: [email protected]
Rachkovskaya L.N. - candidate of chemical sciences, head of the laboratory of lymphoregulation, e-mai: [email protected]
