CC BY
22
В.Г.Спрыгин,
кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии
ТОИ ДВО РАН; Н.Ф.Кушнерова,
доктор биологических наук, заведующий лабораторией биохимии ТОИ ДВО РАН
ДИПРИМ - ПИЩЕВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ СОЗДАНИЯ АЛКОГОЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ С ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМИ СВОЙСТВАМИ
Изучено влияние новой пищевой добавки «Диприм», полученной из гребней винограда амурского Vitis amurensis на биохимические нарушения в печени крыс, вызванные потреблением этанола. Выясняется эффективность ее приминения как корректора метаболических нарушений, вызываемых этиловым спиртом, с целью ее дальнейшего использования для производства алкогольных изделий. Показано, что полученная пищевая добавка обладает выраженным гепатопротекторным эффектом при одновременном ее поступлении в организм с этиловым спиртом и может использоваться при создании новых алкогольных напитков с профилактическими свойствами.
В современном обществе наблюдается тенденция ко все большему применению очищенных пищевых продуктов, лекарственных препаратов, что снижает адаптационные способности организма. Особенно ярко это проявляется на росте заболеваемости алкоголизмом. Хорошо известен тот факт, что высокоочищенный спирт окисляется в организме в среднем в два раза быстрее, что сопровождается образованием повышенной концентрации высокоактивного продукта его окисления - аце-тальдегида.
Если говорить о России, то годовое потребление алкогольных напитков на душу населения в пересчете на чистый алкоголь приближается к 15 литрам. Следовательно, крепкие алкогольные напитки становятся частью рациона питания основной массы населения.
Так как запретительные и ограничительные меры в плане употребления алкогольных напитков малоэффективны, да и человечество в новом тысячелетии вряд ли откажется от их употребления, то разработка и создание новых перспективных видов алкогольной продукции, содержащих в своем составе компоненты, обладающие защитными свойствами от быстрого формирования алкогольной зависимости, представляет важное на-
правление в реализации программы по обеспечению здоровья населения России.
Один из наиболее перспективных корректоров метаболических нарушений, вызываемых алкоголем, - полифенольный комплекс винограда. Именно его биологической активностью обусловлен феномен, получивший название «Французский парадокс» [9], который состоит в том, что население «винных» стран, потребляющее в абсолютном измерении большой объем алкоголя в составе вина, менее подвержено пагубному воздействию алкоголя. Исследования биологической активности поли-фенольного комплекса винограда, содержащегося в вине, показали его благоприятное воздействие на организм и нормализацию метаболических процессов, нарушающихся в условиях алкогольной интоксикации. Биохимический механизм, лежащий в основе этого эффекта, заключается в присутствии в экстракте полифенольных соединений, обладающих способностью к обратимому окислительно-восстановительному процессу «семихинонной осцилляции» и, как следствие этого, обладающих анти-оксидантными, протонофорными (увеличивается соотношение НАД+/НАДН), радиопротекторными и другими свойствами [8].
Поэтому для коррекции метаболических нарушений в организме, вызываемых действием алкоголя, нами была создана пищевая добавка, зарегистрированная под торговой маркой Диприм (заявка № 98717822), выделенная из гребней винограда Амурского. Препарат представляет собой водно-спиртовый экстракт (1:1) темно-коричневого цвета со специфическим запахом и сладковато-кисловато-терпким вкусом. В его составе содержатся полифенольные соединения, включающие лейкоантоциа-ны, катехины, флавонолы, а также органические кислоты, свободные аминокислоты, редуцирующие сахара и ряд других органических соединений.
Материалы и методы. Эксперимент проводили на белых крысах линии Вистар массой 180-200 г, содержащихся на стандартном рационе питания. Использована схема эксперимента, разработанная А. Gajdos [13]. Диприм вводили внутрижелудочно через зонд в дозе 0,4 мл/100 г массы. Контролем служили животные, получавшие водопроводную воду через зонд в той же дозе, в какой вводили препарат. Одновременно два раза в сутки животным внутрибрюшинно вводили 33% этанол в дозе 7,5 мл/кг. Все растворы вводились в течение 10 дней. На 11-й день эксперимента животных забивали методом декапитации (в каждой группе n = 10). Животные были разделены на следующие группы: 1 - контроль; 2 - введение этанола; 3 - введение этанола с дипримом. Экстракт общих липидов печени готовили традиционным методом [10]. Полярные липи-ды разделяли методом двумерной тонкослойной хроматографии на стеклянных пластинках бхб см с суспензией силикагеля и гипса [19]. Использовали системы растворителей:
1 направление - хлороформ, метанол, 28% аммиак (65:25:5) по объему;
2 направление - хлороформ, ацетон, метанол, уксусная кислота, вода (30:40:10:10:5) по объему [17].
Определение общих фосфолипидов и количественно их отдельных фракций проводили по методу В.Е. Васьковского [20]. Результаты выражали в процентах от суммы всех фракций. Для разделения неполярных липидов использовали одномерную микротонкослойную хроматографию на силикагеле в системе растворителей гексан, серный эфир, уксусная кислота (90:10:1) по объему [6]. Визуализацию хроматографических пластинок проводили в йодной камере. Идентификацию пятен липидов осуществляли с помощью коммерчески доступных очищенных стандартов. Результаты выражали в процентах от суммы всех фракций.
Для определения жирнокислотного состава липиды подвергали ме-танолизу с хлористым ацетилом [3]. Эфиры жирных кислот анализировали на хроматографе "Биохром" с пламенно-ионизационным детектором. Жирные кислоты идентифицировали как путем сравнения удерживаемых объемов в исследуемой смеси [1], так и стандартных препаратов метиловых эфиров жирных кислот (C16 - С24).
В гомогенате печени определяли концентрацию никотинамидного ко-фермента НАД+ [14]. Уровень перекисного окисления липидов оценивали по содержанию малонового диальдегида в ткани печени [2]. Активность аспарта-таминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ) в сыворотке крови определяли с помощью стандартных наборов La Chema (Чехия). Результаты обрабатывали по параметрическому критерию Стьюдента.
Экспериментальная модель алкогольной интоксикации с введением 33% этанола внутрибрюшинно [13] уже была нами апробирована ранее на мышах при изучении влияния пищевых добавок растительного происхождения [4]. В настоящем эксперименте, проведенном на крысах, в группе животных, получавших только этанол (2-я группа), наблюдалась типичная картина метаболических нарушений, формирующихся в ответ на воздействие этилового спирта. Она проявлялась в снижении на 45% (0,113+0,014 мкмоль/г против 0,164±0,004 в контроле, Р < 0,01) количества окисленной формы НАД+ в печени за счет его использования для функционирования алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы при окислении этанола.
В сыворотке крови наблюдали увеличение активности трансами-наз: АлАт на 33% и АсАТ на 73%(0,44±0,003 и 0,52±0,04 мкмоль/мл/час, соответственно, против 0,33±0,002 и 0,30±0,02 в контроле, Р < 0,01), что свидетельствует о повышении проницаемости мембран гепатоцитов.
Существенные сдвиги отмечались и в показателях липидного обмена. Они проявлялись в увеличении количества триацилглицерина (ТАГ) на 33%, что составляло 19,48±0,81% по сравнению с 14,7±1,33% в контроле (Р < 0,01). Количество холестерина (ХС) и эфиров жирных кислот (ЭЖК) равнозначно возросло на 29% (18,8±1,02% и 14,4±0,38% ), соответственно, против 14,65±0,72% и 11,12±0,16% в контроле (Р < 0,01). До 24,54±0,96% поднялся уровень свободных жирных кислот (СЖК), что
на 12% (Р < 0,05) выше контрольной величины (22±0,85%). Одновременно происходило снижение количества эфиров холестерина (ЭХС) на 39% (9,28±0,13% против 15,33±0,66% в контроле, Р < 0,001). Изменения обусловлены активацией липолиза (стрессовая реакция на этанол), в результате которого происходит поступление жирных кислот и глицерина в печень из жировых депо с последующим ресинтезом в триглицериды. Одновременно из ацетил-КоА, образующегося при окислении этанола, формируется холестерин. Однако угнетение этанолом активности холе-стеринэстеразы сопровождается уменьшением количества ЭХС.
На фоне высокой концентрации ТАГ количество общих фосфоли-пидов (ФЛ) уменьшилось в среднем на 29% (52,5±3,9% против 73,8±2,2% в контроле, Р < 0,01), что свидетельствует о нарушении этерифицирую-щей функции печени и развитии жировой инфильтрации. Среди фосфо-липидных фракций достоверно уменьшилось количество основного структурного компонента мембран - фосфатидилхолина (ФХ): 39,48±0,77% против 42,09±0,73% в контроле (Р < 0,05) (см. рисунок). Значительно увеличилось количество лизофосфатидилхолина (ЛФХ) и лизофосфатидилэтаноламина (ЛФЭ) (в среднем на 84-90%), что составляло 3,02±0,3% и 3,22±0,2%, соответственно, по сравнению с 1,64±0,12% и 1,69±0,13% в контроле (Р < 0,001). Это связано с повышением активности фосфолипазы А2 под действием этанола. Следует отметить влияние этанола на содержание метаболически активных фракций ФЛ. Оно проявлялось в снижении фосфатидилсерина (ФС) на 17% (Р < 0,001) и ди-фосфатидилглицерина (ДФГ) на 24% (Р < 0,001), что, соответственно, составляло 8,05±0,18% и 3,37+0,16% по сравнению с 9,75±0,32% и 4,43±0,13% в контроле. В то же время достоверно возросло количество фосфатидилинозита (ФИ) до 10,96±0,68% и фосфатидной кислоты (ФК) до 2,21±0,11% (в контроле 8,54±0,49% и 1,46±0,03%, соответственно). Такие изменения в соотношении фракций ФЛ сопровождаются увеличением проницаемости мембран гепатоцитов и нарушением функции ряда мембраносвязанных ферментов [12].
В жирнокислотном спектре общих липидов печени крыс 2-й группы отмечалось статистически достоверное увеличение суммы насыщенных жирных кислот при одновременном снижении суммы ненасыщенных жирных кислот (см. таблицу). Это привело к росту индекса насыщенности с 0,75 до 1,0. Увеличение суммы насыщенных жирных кислот обусловлено возрастанием количества миристиновой (14:0) на 33% (Р < 0,001), пальмитиновой (16:0) на 20% (Р < 0,001) и стеариновой (18:0) на 14% (Р < 0,05) жирных кислот. Возрастание количества насыщенных жирных кислот связано как с усилением биосинтеза низкомолекулярных карбоновых кислот из ацетата, образовавшегося при окислении этанола, так и с активацией липолиза в жировой ткани. Такая модификация ли-пидного состава в сторону увеличения степени насыщенности жирных кислот в общих липидах печени крыс представляет адаптационную реакцию с целью противодействовать разжижающему эффекту этанола. 82
В анализируемом эксперименте наблюдалось снижение концентрации полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Так, в семействе ПНЖК омега-6 снизилось количество линолевой (18:2) и арахидоновой (20:4) жирных кислот, соответственно, на 18% и 25% (Р < 0,001). В семействе ПНЖК омега-3-линоленовой (18:3) на 31% (Р < 0,01), эйкозапентаеновой (20:5) на 22% (Р < 0,05) и докозагексаеновой (22:6) на 29% (Р < 0,01) по сравнению с таковыми величинами в контроле. Нарушение метаболизма линолевой кислоты в арахидоновую, а линоленовой в докозапентаено-вую, индуцированное этанолом, объясняется как снижением активности дельта-5- и дельта-6-десатураз и процесса элонгации [16], так и активизацией процесса перекисного окисления липидов. В пользу такого вывода свидетельствует увеличение на 23% содержания малонового диальде-гида, служащего биологическим маркером данного процесса. В целом, установленные нами метаболические нарушения в печени крыс под действием этанола, демонстрируют его гепатотоксический эффект.
При одновременном введении этанола с дипримом (3-я группа) наблюдалась коррекция метаболических нарушений, вызываемых этанолом. Она проявлялась в сохранении на уровне контроля содержания окисленной формы НАД+ (0,169+0,019 мкмоль/г), более низкой активности АлАТ и АсАТ (0,34+0,01 и 0,38+0,02, соответственно), свидетельствующих о проявлении дипримом мембранопротекторных свойств. Полученный результат обусловлен известным эффектом флавоноидов встраиваться в плазматическую мембрану, увеличивая ее жесткость [7].
Количественные характеристики фракций нейтральных липидов статистически достоверно не отличались от контрольных показателей. По сравнению с результатами, полученными во второй группе (этанол), отмечалось снижение количества ТАГ и ХС на 36% и 42% соответственно (14,32+0,80% и 13,18+0,46%, Р < 0,05). Значительно возросло содержание ЭХС (на 76%). Оно достигло 16,61+0,74% (Р < 0,01). Данный факт может быть частично обусловлен как ингибированием полифенолами биосинтеза эндогенного холестерин [5], так и активизацией фермента лецитин: холестерин-ацилтрансферазы [18], участвующего в гомеостазе холестерина клеточных мембран и катаболизме липопротеидов.
На 36% возросло количество общих ФЛ (71,5+3,11, Р < 0,01). Очевидно это обусловлено способностью флавоноидов снимать ингибируе-щее действие этанола на скорость включения триглицеринов в фосфоли-пиды.
Таким образом, добавка диприма в этанол сохраняет этерифици-рующую функцию печени, что определяет его гепатопротекторные свойства.
При анализе фосфолипидного спектра печени крыс 3-й группы наблюдалось более высокое содержание ФХ (43,07+1,5%), чем у крыс, потреблявших этанол без добавки (см. рисунок). Количество лизофосфоли-пидов (ЛФХ и ЛФЭ) оставалось повышенным по сравнению с контролем (на 9% и 14%, соответственно), но по сравнению со 2-й группой эти ве-
личины были равнозначно снижены в среднем на 66% (1,79±0,12% и 1,94±0,13%, соответственно). Этот эффект можно объяснить ингиби-рующим действием полифенолов на активность фосфолипазы А2 [8].
Потребление композиции этанола с дипримом препятствовало снижению содержания фосфатидилэтаноламина и повышению фосфати-дилинозита в плазматических мембранах печени крыс, присущее 2-й группе (этанол). Тем самым раскрывается способность полифенолов ди-прима предотвращать фосфолипидную модификацию плазматических мембран под действием гепатотропных ядов [15]. Так, содержание ФИ уменьшилось до 7,86±0,42% (Р < 0,001), а ФЭ увеличилось до 24,19±1,52% по сравнению с воздействием этанола без препарата. Содержание ФК было снижено до 1,60±0,18% (Р < 0,05). Количество ДФГ при этом составляло 4,58±0,18%, что на 36% (Р < 0,01) выше, чем в эта-нольной группе. Следовательно диприм обеспечивает сохранение метаболических реакций печени по синтезу ФЛ фракций (ФХ, ФС, ДФГ) и поддерживает их соотношение, что определяет его мембранопротек-торный эффект.
Как видно из таблицы, суммы насыщенных и ненасыщенных жирных кислот в общих липидах печени крыс 3-й группы были на уровне контрольных величин. В то же время сравнивая жирнокислотные спектры этой группы со 2-й группой, обращает на себя внимание факт снижения количества насыщенных жирных кислот в среднем на 10-12% (Р < 0,001). Оно вероятно, обусловлено, как увеличением уровня их окисления в митохондриях вследствие нормализации окислительно-восстановительного равновесия под действием полифенольных структур, так и за счет использования их для биосинтеза фосфолипидов.
Достоверно выше было содержание ПНЖК семейства омега-6: эй-козатриеновой (20:3) на 33% (Р < 0,001) и арахидоновой кислоты на 27% (Р < 0,001). Известно, что флавоноиды способны модифицировать ли-пидные мембраны, стабилизируя их в области жирнокислотных хвостов фосфолипидов, повышая при этом их упорядоченность [7], а также защищать полиненасыщенную составляющую мембран от процессов сво-боднорадикального окисления [11]. Следовательно, нормализацию содержания ПНЖК в мембранах, по-видимому, можно объяснить этим биохимическим механизмом. В его пользу свидетельствует и более низкое, чем в контрольной группе, содержание малонового диальдегида (46,5±1,8 нмоль/г против 49,7±1,6).
Таким образом, из анализа вышеизложенных результатовследует, что пищевая добавка Диприм обладает выраженным гепатопротектор-ным эффектом при одновременном его поступлении в организм с этиловым спиртом, т.к. содержит в своем составе комплекс полифенольных соединений, служащих корректорами нарушений метаболических процессов при алкогольной интоксикации. Данная пищевая добавка может быть использована для создания новых перспективных алкогольных на-
питков с профилактическими свойствами, препятствующими формированию алкогольной зависимости человека.
Таблица
Жирнокислотный состав общих липидов печени крыс при воздействии этанола и композиции этанола с дипримом (% от суммы всех фракций; М+т)
Жирные кислоты 1-я группа Контроль 2-я группа Этанол 3-я группа Этанол + диприм
14:0 0,3 + 0,01 0,4 + 0,02* 0,2 + 0,01**
16:0 22,8 + 0,46 27,3 + 0,68* 23,4 + 0,53**
17:0 19,9 + 0,49 22,7 + 1,12* 20,3 + 0,39**
16:1 5,6 + 0,22 6,6 + 0,41* 5,2 + 0,22**
18:1 19,0 + 0,54 17,9 + 0,76 19,8 + 0,86
18:2 омега-6 12,7 + 0,38 10,4 + 0,44* 12,1 + 0,51
18: 3 омега-6 0,2 + 0,01 0,2 + 0,01 0,2 + 0, 01
20:3 омега-6 0,4 + 0,02 0,3 + 0,01* 0,4 + 0,01**
20:4 омега-6 13,5 + 0,33 10,2 + 0,56* 13,0 + 0,44**
18:3 омега-3 3,6 + 0,26 2,5 + 0,16* 3,5 + 0,16**
20:5 омега-3 0, 9 + 0,06 0,7 + 0,06* 1,0 + 0,05**
22:5 омега-3 0,3 + 0,02 0,2 + 0,01* 0, 3 + 0,02**
22:6 омега-3 0,7 + 0,05 0,5 + 0,02* 0, 6 + 0,02**
Сумма насыщенных 43 50 44
Сумма ненасыщенных 57 50 56
Индекс насыщенности 0,75 1,0 0,78
Примечание. *Различия достоверны между второй и первой группой ;** между второй и третьей. Приведены средние данные из 10 определений. Жирные кислоты: 14:0 - миристиновая; 16:0 - пальмитиновая; 18:0 - стеариновая; 16:1 - пальмитолеиновая; 18:1 - олеиновая; 18:2 омега-6 - линолевая; 18:3 омега-6 - гамма-линоленовая; 20:3 омега-6 - эйкозатриеновая; 20:4 омега-6 - арахидоновая; 18:3 омега-3 - альфа-линоленовая; 20:5 омега 3 - эйкозапентаеновая; 22:5 омега 3 - докоза-пентаеновая; 22:6 омега 3 - докозагексаеновая.
50
45
40
35
30
25
20
15
10
ФХ - фосфатидилхолин;
ЛФХ - лизофосфатидшшшин;
СМ - сфингомиелин;
ФЭ - фосфатидилэтаноламин;
ЛФЭ - лизофосфатидилэтаноламин;
ФС - фосфатидилсерин;
ФИ - фосфатидилинозит;
ФК - фосфатидная кислота;
ДФГ - дифосфатидилглицерин.
ФХ
ЛФХ
см
ФЭ
ДФГ
Рис. 1. Изменение фосфолнпндного состава в ткани печени крыс при воздействии этанола и композиции этанола с дипримом: 1 - контрольная группа; 2 - группа получавшая этанол; 3 - группа получавшая композицию этанол + диприм. По оси абсцисс - определяемые фосфолипидные фракции, по оси ординат - показатели, % от суммы всех фракций - М+т.
Литература
1. Берчфилд Г., Сторрс Э. Газовая хроматография в биохимии. - М.,
1964.
2. Гончаренко М.С., Латинова А.М. Метод оценки перекисного окисления липидов // Лабораторное дело 1985. №. 1. P. 60-61.
3. Кейтс Т. Техника липидологии. - М., 1975.
4. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Положенцева М.И. et. al. Влияние природных комплексов биологически активных веществ на процессы восстановления функций печени при алкогольной интоксикации // Вопросы медицинской химии 1995. Vol. 41. №. 2. P. 20-23.
5. Abe I., Seki T., Umehara K. et.al. Green tea polyphenols: novel and potent inhibitors of squalene epoxidase // Biochem Biophys Res Commun 2000. Vol. 268. №. 3. P. 767-771.
6. Amenta J.S. A rapid chemical method for quantification of lipids separated by thin-layer chromatography // J. Lipid res. 1964. Vol. 5. № 2. P. 270-272.
7. Arora A., Byrem T.M., Nair M.G. et. al. Modulation of liposomal membrane fluidity by flavonoids and isoflavonoids // Arch Biochem Biophys 2000. Vol. 373. №. 1. P. 102-109.
8. Bravo L. Polyphenols: chemistry, dietary sources, metabolism, and nutritional significance // Nutr Rev 1998. Vol. 56. №. 11. P. 317-333.
9. Constant J. Alcohol, ischemic heart disease, and the French paradox // Coron Artery Dis 1997. Vol. 8. №. 10. P. 645-649.
10. Folch J., Less M., Sloane-Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. Vol. 226. №. 1. P. 497-509.
11. Fremont L., Gozzelino M.T., Franchi M.P. et. al. Dietary flavonoids reduce lipid peroxidation in rats fed polyunsaturated or monounsaturated fat diets // J Nutr 1998. Vol. 128. №. 9. P. 1495-1502.
12. French S.W. Biochemical basis for alcohol-induced liver injury [published erratum appears in Clin Biochem 1989 Aug; 22 (4): 337] // Clin Biochem 1989. Vol. 22. №. 1. P. 41-49.
13. Gajdos A., Gajdos-Torok M., Horn R. [Therapeutic effect of the (+) -catechin on biochemical disorders of the liver in the ethanol intoxicated rat] // CR Seances Soc Biol Fil 1972. Vol. 166. №. 2. P. 277-279.
14. Klingenberg M. Diphosphopyridin nucleotide (DPN). - New York, 1963.
15. Muriel P.,Mourelle M. Prevention by silymarin of membrane alterations in acute CCl4 liver damage // J Appl Toxicol 1990. Vol. 10. №. 4. P. 275-279.
16. Nakamura M.T., Tang A.B., Villanueva J. et. al. Selective reduction of delta 6 and delta 5 desaturase activities but not delta 9 desaturase in micropigs chronically fed ethanol // J Clin Invest 1994. Vol. 93. №. 1. P. 450-454.
17. Rouser G., Kritchevsky G., Yamamoto A. Column chromatographic and associated procedures for separation and determination of phosphatides and glicolip-ids. Lipid Chromatographic Analysis. G.V. Marinetti. - New York, Dekker. 1: 99-162.
18. Sudheesh S., Presannakumar G., Vijayakumar S. et. al. Hypolipidemic effect of flavonoids from Solanum melongena // Plant Foods For Human Nutrition 1997. Vol. 51. №. 4. P. 321-330.
19. Svetashev V.I., Vaskovsky V.E. A simplified technique for thin layer mi-crochromatography of lipids // J. Chromatography. 1972. Vol. 67. №. 2. P. 376-378.
20. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.Y., Vasenden I.M. A universal reagent for phospholid analysis // J. Chromatography 1975. Vol. 114. №. 1. P. 129-141.
