CC BY
32
42 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
УДК 616-006.444-092.9:612.433’62
E.N. Filatova1, T.V. Aksyonova1, Yu.Yu. Hahina1, A.Yu. Baryshnikov2,
V.V. Novikov1,1.M. Solopaeva3, N.L. Ivanova3
HUMAN CHORIONIC GONADOTROPIN INFLUENCES THE PLISSE LYMPHOSARCOMA’S GROWTH
1N.I. Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod 2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow 3Nizhni Novgorod State Medical Academy
ABSTRACT
The human chorionic gonadotropin is the member of glycoprotein gonadotropin hormone family. It is produced in many mammal’s tissues and organs during all the ontogenesis and plays a remarkable role in the organism’s development. It also possesses some antitumor properties. Our study is to investigate the hormone influence upon the growth of the Plisse lymphosarcoma and the tumor-bearing rat immune system. As the result it was shown that human chorionic gonadotropin affects strongly and destructively the tumor. The hormone’s ability to prevent from the tumor dependent immunedeficit development was also revealed.
Key words: human chorionic gonadotropin, Plisse lymphosarcoma, tumor’s growth, apoptosis, immune system.
1 1 1 2 Е.Н. Филатова , T.B. Аксенова , Ю.Ю. Хахина , А.Ю. Барышников ,
1 3 3
B.B. Новиков , И.М. Солопаева , Н.Л. Иванова
ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА ЧЕЛОВЕКА НА РОСТ ЛИМФОСАРКОМЫ ПЛИССА У КРЫС
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород
2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина, РАМН, Москва 3Нижегородская государственная медицинская академия
РЕЗЮМЕ
Хорионический гонадотропин человека принадлежит к семейству гликопротеиновых гонадотропных гормонов. Он синтезируется во многих тканях и органах млекопитающих на всем протяжении онтогенеза и играет исключительную роль в развитии организма, а также обладает противоопухолевыми свойствами. Целью нашего исследования явилось изучение влияние гормона на некоторые параметры роста опухоли лим-фосаркомы Плисса и состояние иммунной системы у крыс-опухоленосителей. В результате исследований было выявлено комплексное тормозящее воздействие хорионического гонадотропина человека на рост опухоли и его способность препятствовать развитию онкозависимого иммунодефицита.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин человека, лимфосаркома Плитеа, опухолевый рост, апоптоз, иммунная система.
ВВЕДЕНИЕ
Хорионический гонадотропин человека (ХГч) - ге-теродимерный гликопротеин, принадлежащий семейству гонадотропных гормонов. Этот гормон состоит из консервативной, общей для всех гормонов этого семейства а-субъединицы и уникальной Р-субъединицы, которая определяет биологическую специфичность гормона. Несмотря на это, Р-субъединица ХГч и Р-субъединица лютеинизирующего гормона проявляют большую степень гомологии: они связываются с одним
рецептором и отчасти проявляют схожую функциональную активность [11]. Также выявлена значительная степень гомологии между молекулами хорионического гонадотропина человека и различных видов млекопитающих [2].
Известно, что ХГч синтезируется в хорионе тро-фобласта и плаценты, в тканях плода [8], в клетках многих органов и тканей детей и взрослых обоих полов [4; 12], то есть во многих участках организма на протяжении всего онтогенеза. Показано, что ХГч яв-
ляется главным специфическим гормоном беременности, который обеспечивает нормальное течение этого процесса [2].
Открыта закономерность структурно-функционального обеспечения организма млекопитающих хорионическим гонадотропином, которая заключается в инициации и стимуляции размножения клеток и их развития на всех этапах онтогенеза, что приводит к развитию организма в эмбриогенезе и раннем постна-тальном онтогенезе, физиологической, репаративной и внутриклеточной регенерации и нормализации структуры и функции патологически измененных органов [3].
Однако биологическая роль ХГч в организме млекопитающих остается до сих пор недостаточно изученной. К настоящему времени появились публикации о благоприятных результатах лечения некоторых злокачественных опухолей человека препаратами ХГч, что привлекло внимание онкологов к этому гормону [1; 5-7; 9]. Антибластическое действие ХГч свидетельствует о возможном последующем применении его в клинике в составе комплексной терапии злокачественных новообразований.
Целью исследования было изучение влияния ХГч на такие показатели состояния лимфосаркомы Плисса (ЛСП), как рост, апоптоз и митотическая активность опухолевых клеток, морфология опухоли, в том числе состояние ее сосудов. Кроме того, определяли относительное содержание CD4+-мононуклеарных клеток периферической крови крыс-опухоленосителей и наличие признаков апоптоза в клетках крови.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали 350 самцов белых беспородных крыс массой тела 180-200 г. Животные были разделены на группы по 10-12 крыс в каждой: интакт-ные, контрольные (не леченые крысы с ЛСП) и опытные (животные с ЛСП, получавшие ХГч). Экспериментальные группы различались по объему перевиваемой взвеси опухолевых клеток, дозе и способу введения ХГч, а также по срокам забора материала. Все манипуляции над подопытными животными производились с использованием ингаляционного наркоза.
Измельченную и отфильтрованную взвесь клеток ЛСП перевивали животным контрольных и опытных групп подкожно в правый бок. ХГч вводили животным опытных групп подкожно в левый бок или ин-тратуморально. В исследовании использовали различные штаммы ЛСП: 1-й был приобретен в РОНЦ им.
H.H. Блохина РАМН, а 2-й получен из другой лаборатории. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюдента.
Для изучения темпов роста ЛСП под влиянием ХГч производили замеры линейных параметров новообразования по 2 осям, определяя площадь поперечного сечения опухоли в мм2. Для оценки структуры опухоли и определения пролиферативной активности опухолевых клеток использовали парафиновые гисто-
логические препараты ЛСП толщиной 5-6 микрон, окрашенные гематоксилином с докрашиванием эозином. Митотически делящиеся клетки ЛСП подсчитывали в 400 полях зрения препарата при увеличении 90x1,5x10, митотический индекс высчитывали по стандартной формуле. Влияние ХГч на индукцию апоптоза в опухолевых клетках ЛСП и мононуклеар-ных клетках периферической крови крыс определяли по наличию низкомолекулярной фрагментации хромосомной ДНК (НМФ хДНК) с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле. Наличие НМФ хДНК (кратной 200 п.н.о.) расценивалось нами как признак апоптоза. Влияние опухоли и ХГч на содержание CD4+-мононуклеарных клеток в периферической крови крыс оценивали методом непрямой поверхностной иммунофлюоресценции с помощью моноклональных антител ИК0-101 против CD4-антигена крыс. В каждом препарате просчитывали 200-300 моноклональных клеток крови.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Как указано в табл. 1, в 1-й серии экспериментов у животных, получавших по 150 ЕД ХГч за сут до перевивки опухоли или через 3 дня после перевивки, на 5-й день наблюдалось достоверное торможение роста опухоли на 23 % и 17 % соответственно. Во 2-й серии экспериментов обнаружено достоверное снижение темпов роста ЛСП более, чем на 50 %, на всех сроках наблюдения у животных, дважды получавших по 25 ЕД ХГч, и на 4-е, 5-е и 8-е сут после перевивки опухоли у животных, дважды получавших по 50 ЕД ХГЧ.
0бращает на себя внимание то, что темпы роста ЛСП у перевитых животных контрольной группы 1 практически в 2 раза превышали данный показатель у животных контрольной группы 4 (см. табл. 1). Мы объясняем эти расхождения различной биологической активностью 2 разных штаммов опухоли ЛСП, использованных в 2 сериях экспериментов. Как в 1-й, так и во 2-й серии экспериментов более выраженное влияние ХГч на рост опухолевых клеток проявляется на ранних сроках развития ЛСП, то есть на 4-е и 5-е сут после ее перевивки. В эти сроки опухоль еще является относительно однородным образованием, состоящим из опухолевых клеток и небольшого количества сосудов. При дальнейшем росте ЛСП ее структура изменяется: в ней появляются участки некроза и фиброзирования, она сильно прорастает кровеносными сосудами. Полученные данные позволяют заключить, что ХГч в дозах 25; 50 и 150 ЕД достоверно тормозит рост ЛСП на ранних сроках развития опухоли, когда она сравнительно однородна.
Иссле довали влияние ХГч на митотическую активность клеток ЛСП на 10-е сут после перевивки опухоли. ХГч в дозе 150 ЕД, введенной как до, так и после перевивки ЛСП в объеме 1 мл, достоверно снижал количество митотически делящихся опухолевых клеток в 2,3 и 2,0 раза соответственно. Угнетающий эффект проявлялся при разном количестве введенных
44 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
Таблица 1
Влияние ХГч на темпы роста ЛСП
Опыт Группа Площадь поперечного сечения опухоли, мм2
Время после перевивки опухоли, сут
4 5 6 7 8 11
1 (1-й штамм ЛСП) 1. Контрольная н.о.* 328,8 ±24,5 407,4 ±49,1 562,3 ±31,5 713,8 ±68,4 н.о.*
2. 150 ЕД ХГч за сут до перевивки н.о.* 253,1 ±22,5** 366,8 ±39,7 526,3 ±44,4 713,8 ±60,2 н.о.*
3. 1 50 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки н.о.* 272,2 ±16,2** 360,2 ±22,4 566,4 ±32,9 754,1 ±35,8 н.о.*
2 (2-й штамм ЛСП) 4. Контрольная 217,0 ±4,1 189,3 ±11,9 н.о.* 222,0 ±13,3 338,0 ±18,9 810,0 ±33,5
5. 25 ЕД ХГч на 3-и и 7-е сут после перевивки 80,0 ±5,8** 108,0 ±5,2* н.о.* 228,5 ±20,4 187,0 ±12,7** 513,0 ±17,4**
6. 50 ЕД ХГч на 3-и и 7-е сут после перевивки 131,3 ±21,3** 77,0 ±13,3** н.о.* 208,2 ±40,6 195,0 ±34,0** 820,0 ±113,3
7. 75 ЕД ХГч на 3-и и 7-е сут после перевивки 293,0 ±49,4 208,5 ±0,9 н.о.* 278,3 ±47,9 361,0 ±22,7 820,0 ±1,2
*н.о. - не исследовали; **р<0,01 - достоверные различия относительно контрольной группы
животным клеток ЛСП. Так, ХГч в дозе 150 Ед на 3-и сут после перевивки опухолевых клеток в объеме
0,3 мл приводил к снижению количества делящихся клеток в 2,2 раза на 10-е сут подкожного роста ЛСП. Более выраженный эффект оказывало введение ХГч в дозе 75 ЕД, осуществленное на 3-и сут после инокуляции опухолевых клеток. В этом случае митотический индекс понижался в 3,8 раз, что статистически достоверно ниже количества митозов при введении животным-опухоленосителям ХГч в дозе 150 ЕД (табл. 2).
При морфологическом анализе гистологических препаратов ЛСП было выявлено, что под влиянием ХГч, введенного подкожно в дозе 150 ЕД на 10-е сут после перевивки 1 мл опухоли, в исследуемой ткани обнаруживается гораздо больше апоптотически измененных клеток, чем в контроле (рис. 1, А, Б). Это говорит о способности гормона стимулировать апоптоз в клетках ЛСП.
Другим отличием структуры ЛСП крыс, получавших ХГч, от контрольных животных было наличие в опухоли большого количества кровеносных сосудов разного диаметра, имеющих поврежденную сосудистую стенку. Следствием таких повреждений было образование в ткани опухоли животных опытной группы большого количества кровоизлияний
разной величины. Ранее было показано, что ХГч способен тормозить образование и пролиферацию сосудов в опухоли [10]. Все эти данные указывают на способность ХГч нарушать в ЛСП процесс ангиогенеза.
Различий в морфологической картине ЛСП при подкожном и внутриопухолевом введении гормона не было обнаружено.
Исследовали наличие НМФ хДНК опухолевых клеток как характерный признак апоптоза. В 1-й серии экспериментов НМФ хДНК была обнаружена нами у животных, получавших инъекции ХГч в дозе 150 ЕД, на 10-е сут после перевивки ЛСП. Введение животным ХГч в дозе 75 ЕД способствовало индукции апоптоза на 5-е и 10-е сут развития опухоли. При этом способ введения гормона - подкожно или в опухоль - не оказывал влияния на индукцию апоптоза в клетках ЛСП. Во 2-й серии экспериментов инъекции ХГч в дозе 75 ЕД индуцировали апоптоз в опухолевых клетках, начиная с 4 сут после перевивки опухоли. У животных, получавших ХГч в дозе 25 и 50 ЕД, а также у животных контрольной группы НМФ хДНК клеток ЛСП обнаруживалась на более поздних сроках развития ЛСП - 5-е, 8-е и 11-е сут после ее перевивки (рис. 1, В, Г). Следовательно, ХГч способен индуцировать развитие апоптоза в опухолевых клетках ЛСП,
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ 45
Таблица 2 Влияние ХГч на митотический индекс клеток ЛСП
№ опыта Группы крыс Объем взвеси клеток опухоли, мл Митотический индекс, М±ш
1 (1-й штамм ЛСП) 1. Контрольная 1 796,4±22,3
2. 150 ЕД ХГч за сутки до перевивки 1 349,6±20,6*
3. 150 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки 1 400,8±20,7*
2 (2-й штамм ЛСП) 4. Контроль 0,3 307,3±22,7
5. 150 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки 0,3 137,3±15,6*
3 (2-й штамм ЛСП) 6. Контроль 1 268,3±12,4
7. 150 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки 1 126,8±6,4*
8. 75 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки 1 70,3±7,8*
*р<0,01 - достоверные различия относительно контрольной группы опыта.
Рис. 1. Апоптотические процессы в опухолевых клетках ЛСП:
А и Б - препарат опухолевой ткани ЛСП контрольных животных (А) и животных, получавших 150 ЕД ХГч (Б); стрелками показаны апоптотически измененные опухолевые клетки;
В и Г - электрофореграммы хромосомной ДНК опухолевых клеток; В - 1-й опыт, группы: 1 - контроль, 2 - ХГч 150 ЕД подкожно, 3 - ХГч 150 ЕД в опухоль, 4 - ХГч 75 ЕД подкожно, 5 - ХГч 75 ЕД в опухоль; Г - 2-й опыт, группы: 6 - контроль, 7 - ХГч 25 ЕД, 8 - ХГч 50 ЕД, 9 - ХГч 75 ЕД подкожно.
что обусловливает противоопухолевый эффект этого гормона. Данная способность гормона наиболее выражена на ранних сроках развития опухоли (5-е сут после перевивки опухоли в 1-й серии экспериментов и 4-е сут во 2-й серии) и состоит в более раннем и более интен-
Рис. 2. Изменение относительного содержания CD4+-мононyклеарныx клеток в периферической крови крыс-опухоленосителей под влиянием ХГч:
1 - интактная группа; 2 - контрольная группа; 3 - животные, получавшие 150 ЕД ХГч на 3-и сут после перевивки опухоли.
сивном проявлении апоптоза в опухолевых клетках под воздействием ХГч по сравнению с опухолевыми клетками животных контрольных групп. Среди изученных нами доз наиболее эффективной с точки зрения индукции апоптоза опухолевых клеток оказалась доза ХГч, равная 75 ЕД.
НМФ хДНК мононуклеарных клеток периферической крови крыс не обнаруживалась ни в одном случае. Это свидетельствует о том, что ХГч в исследованном нами диапазоне доз от 25 до 150 ЕД при различных дозах и способах введения не является индуктором апоптотических процессов и не оказывает влияния на их развитие в мононуклеарных клетках периферической крови крыс при ЛСП.
При первоначальном исследовании относительного содержания CD4+ мононуклеарных клеток в пери-
46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ
ферической крови крыс нами было обнаружено снижение данного показателя у животных контрольной группы в 3,7 раз относительно животных интактной группы на 10-е сут после перевивки ЛСП (рис. 2). Это говорит о депрессивном влиянии опухоли на иммунную систему в виде выраженного изменения популяционного состава Т-лимфоцитов и соответственно развития онкозависимого иммунодефицита у крыс. При этом введение животным ХГч в дозе 150 ЕД на 3-и сут развития опухоли стимулировало увеличение количества CD4+-мононуклеарных клеток в их крови в 3,2 раза по сравнению с показателем контрольной группы и способствовало нормализации содержания CD4+-клеток до уровня, статистически неразличимого с показателем интактной группы крыс.
При дальнейших исследованиях на 4-е, 5-е и 8-е сут после перевивки ЛСП была выявлена нормализация содержания CD4+-мононуклеарных клеток в крови животных, дважды получавших ХГч в дозе 75 ЕД. Восстановления количества CD4+-клеток у животных, дважды получавших ХГч в дозе как 25, так и 50 ЕД, на всех сроках наблюдения выявлено не было (табл. 3). Тем самым продемонстрировано дозозависимое действие гормона: ХГч в дозах 150 и 75 ЕД за короткие сроки в большей степени препятствует развитию онкоза-висимого иммунодефицита и способствует нормализации состояния Т-клеточного звена иммунитета крыс-опухоленосителей при ЛСП, чем дозы 25 и 50 ЕД.
является дозозависимым: среди изученных нами доз ХГч доза 75 ЕД наиболее эффективна в отношении торможения митотической активности опухолевых клеток и индукции в них апоптоза, а также в отношении нормализации относительного количества CD4+-мононуклеарных клеток периферической крови крыс.
ЛИТЕРАТУРА
1. Говалло В.И., Дубровский А.В. Длительное наблюдение больных раком легкого с метастазами после операции и иммунологического лечения // Вопр. Он-кол. - 1981. - № 6. - С. 69-73.
2. Димитров Д.Я. Хориальный гонадотропин человека / Пер. с болгарского И.П. Папазова. М.: Медицина, 1979. - 143 с.
3. Солопаева И.М. Хорионический гонадотропин в онтогенезе и онкогенезе (по материалам двух научных открытий и одной научной гипотезы): монография. Нижний Новгород: изд-во «РАСТР-НН», 2007. - 284 с.
4. Braunstein C.D., Camadar V., Snaminathan N., Nade ME. Widespread Distribtion Gonadotropin-like substance in normal Tissues // J. Clin. Endocrin. - 1979. - 49(6). - P .917-25.
5. Feldman T.S., Seiler R., Chio S. W. et al. In vitro effects and clinical evaluation of a human chorionic gonadotropin preparation in acute leukemia // Leukemia. -1998. - 12(11). - P. 9-55.
Таблица 3
Влияние ХГч на количество CD4+-MOHOHy^eapHbix клеток в периферической крови крыс-опухоленосителей
Группа крыс Относительное содержание CD4+-MOHOHyKreapHbix клеток
Время после перевивки опухоли, сут
4 5 8 11
4. Интактная 45,8±5,6
5. Контрольная 23,8±4,8* 21,9±3,9* 35,5±4,4 23,8±1,1*
6. 25 ЕД ХГч на 3-й и 7-е сут после перевивки 22,7±4,8* 25,3±6,5* 29,5±2,2* 27,7±3,2*
7. 50 ЕД ХГч на 3-й и 7-е сут после перевивки 28,3±5,5* 21,5±1,8* 32,5±4,9 30,9±2,6*
8. 75 ЕД ХГч на 3-и и 7-е сут после перевивки 37,7±4,1 38,6±2,8** 46,7±5,8 24,9±2,4*
*р<0,05 - достоверные отличия относительно интактной группы; **р<0,05 - достоверные отличия относительно контрольной группы
выводы
Можно заключить, что ХГч способен губительно и комплексно воздействовать на развитие опухоли. Так, под влиянием ХГч тормозится митотическое деление опухолевых клеток, рост опухоли и ее вас-куляризация, а также индуцируется апоптоз опухолевых клеток. Кроме того, гормон действует на Т-клеточное звено иммунитета. Он нормализует относительное количество CD4+-мононуклеарных клеток периферической крови, что способствует коррекции онкозависимого иммунодефицита. Действие гормона
6. Harris P. Treatment of Kaposi’s sarcoma and other manifestations of AIDS with human chorionic Gonadotropin // Lancet. - 1995. - 346. - P. 118-9.
7. Lunardi-Iscandar Y., Bryant J.L., Zeman R.A. et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnacy hormone // Nature. -1995. - 375. - P. 64-8.
8. Meyden N.N., Menlendii R.P., Leusden H.A.J. Formatoin of HCG in the human Fetaplacentation Unit // Europ. J. Obstet. Gynec. - 1979. - 9(5). - P. 313-6.
9. Parash S., Gill M.D., Lunardi-Iskandar Y. et al. The effect of preparation of human chorionic Gonadotropin on AIDS-related Kaposi’s sarcoma // Massachusetts Medical Society. - 1996. - 335(176). - P. 1261-9.
10. Pfeffer U., Bissacchi D., Morini M. et al. Human chorionic gonadotropin inhibits Kaposi's sarcoma angiogenesis, matrix metalloprotease activity and tumor growth // Endocrinology. - 2002. - 143 (8). - P. 3114-21.
11. Themmen A.P.N., Huhtaniemi I.T. Mutations of gonadotropins and gonadotropin receptors: elucidating the physiology and pathophysiology of pituitary-gonadal function // Endocrine Reviews. - 2000. - 21(5). - P. 551-83.
12. Yoshimoto J., Wolfen A.R., Hirose F. et. al. Human chorionic Gonadotropin-like Material Present in normal Human Tissues // Amer. J. Obstet. and Gynec. -1979. - 134(7). - P. 729-33.
Поступила 02.11.2007.
