CC BY
34
ВЛИЯНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ОСТАТКОВ ТРИПТОФАНА НА КАТАЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЛУТАМИН(АСПАРАГИН)АЗЫ ИЗ PSEUDOMONAS AURANTIACA
ТТ.БЕРЕЗОВ, А.В.ЖАРИ КОВ А, В.А.ЗАНИН, Г.В.ТЮТРИНА
Кафедра биохимии. Российский Университет дружбы народов Москва, J17198, ул. Миклухо-Маклая, 8. Медицинский факультет
Изучали изменение каталитических свойств глутамин(асиара1ин)азы ич Pseudomonas aurantiaca Я75 (ГА) в зависимости от степени модификации (окисления) остатков триптофана в молекуле фермента. Для модификации этих остатков была использована высокоспецифичная система: перекись водорода-диоксан-бикарбонатный буфер 8,5. а также о-нитрофенилсульфенилхлорид. Модификации подвергались только остатки триптофана; причем условия опытов позволяли провести последовательное окисление практически rccx остатков в молекуле фермента. Было показано, что модификация лишь одного остатка триптофана уже приводила к почти полной инактивации фермента по отношению к субстратам. Полученный результат свидетельствует о существенной роли триптофана в акте катализа и дает возможность предположить, что 1 из 8 триптофановых остатков, имеющихся в составе фермента, может входить в активный центр ()>срмента, непосредственно участвуя в реакции, или находится в ближайшем окружении активного центра, стабилизируя каталитически активную конформацию фермента.
Глутамин(аспарагин)аза (КФ 3.5.1.38) обладает высокой каталитической активностью по отношению к двум субстратам - /.-аспарагину и /.-глутамину, вызывая гидролиз амидной группы субстратов. Фермент представляет несомненный клинический и теоретический интерес в плане возможного использования в качестве противоопухолевого препарата и в плане выяснения механизма действия бимолекулярных ферментов.
В данной работе преследовалась цель определения механизма действия фермента, в частности, выяснения вклада отдельных остатков аминокислот в акте катализа. Эти полученные результаты могут способствовать пониманию роли отдельных аминокислот в структуре активного центра или его ближайшего окружения.
Ранее было показано, что фотосенсибилизированное окисление глуга-мин(аспарагин)азы из Pseudomonas fluorescens (ГА) сопровождается потерей активности фермента (1). Известно, что при фотоокислении белка наиболее легко окисляются остатки гистидина, метионина, триптофана, тирозина и цистеина. Варьируя условия проведения этой реакции, можно получить различную степень окисления тех или иных аминокислотных остатков в молекуле белка. Однако при любых условиях проведения опытов добиться раздельного окисления триптофана и гистидина не удавалось. При модификации фермента фотоокислением окислялось до 50% остатков гистидина и до 25% остатков триптофана.
В данной работе были использованы методы специфического окисления остатков триптофана в молекуле глутамин(аспарагин)азы из Pseudomonas aurantiaca, позволившие получить постепенное и последовательное окисление различного количества триптофановых остатков на молекулу фермента (1,0; 3,72; 7,42 и 8,0 остатков). В ходе изучения модификации триптофана было показано, что окисление лишь одного остатка приводит к почти полной потере активности фермента (остаточная активность составляла менее 8% от исходной по отношению к обеим субстратам).
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Источником фермента послужил экстракт из клеток Pseudomonas aurantiaca, разрушенных в замороженном состоянии. Очистка была проведена по ранее разработанной в нашей лаборатории методике с использованием колонокс;.Сефадексом и ГоуереН /УЖ-40 и HW—55 [2,3]. Полученная ГА гомогенна хроматографически и при гельэлектрофорезе. Ее удельная активность по отношению к аспарагину - 135 ед./мг белка и по отношению к глутамину - 190 ед./мг белка.
Остатки триптофана ГА модифицировали действием о-нитрофенилсуль-фенил-хлорида (Л/м-хлорил) [6].
1. К раствору белка 5 мг/мл в 30%-й уксусной кислоте, pH 3,5, при перемешивании добавляли раствор реагента в ледяной уксусной кислоте (2- или 5-кратный мольный избыток). Через 1,5 - 2,5 ч модифицированный продукт подвергали гель-фильтрации на Сефадексе С-25 в 1%-ой уксусной кислоте и лирфилизировали.
2. Белок выдерживали в 50%-й уксусной кислоте в присутствии 5 М мочевины с 40-кратным избытком реагента. Через 2 ч избыток реагента удаляли на колонке с Сефадексом С-25 в 1%-й уксусной кислоте. Степень сульфитирования белка определяли спектрофотометрически при 365 нм, исходя из значения £365=40ОО М'1 см'1 (для Л^-триптофана) [6].
Остатки триптофана окисляли в системе перекись водорода-диоксан-0,5 М бикарбо-натный буфер, pH 8,5 [5]. Концентрация диоксана составляла 10%, концентрация перекиси водорода изменялась от 2 до 20 мМ. ГА инкубировали в указанной системе при температуре 4 и 20 градусов по Цельсию. Через определенные интервалы регистрировали УФ-спектры и отбирали аликвоты для определения активности ГА. Кроме того, модификацию проводили смесью с использованием 0,5 М ацетатного буфера, pH 2,8. Низкомолекулярные компоненты удаляли на колонках с Сефадексом <5-25 в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,0. Для модификации контрольного раствора Л-триптофана использовали систему перекись водорода-диоксан-0,5 М бикарбонатный буфер, pH 8,5.
Измерения проводили на спектрофотометре БресоЫ М-40 в кюветах с длиной оптического пути 1 см.
Концентрацию белка определяли по методу Лоури и по величине абсорбции при 280 нм, используя значение А = 9,8.
Активность ГА определяли методом Несслера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Из данных литературы известна высокая модифицирующая избирательность используемых реагентов по отношению к остаткам триптофана при обработке ряда белков [5, 6]. Остальные аминокислотные остатки при этом не модифицируются.
При добавлении к раствору белка в 30%-ой уксусной кислоте 2-кратного мольного избытка /У/»--хлорида за 1,5 часа происходит модификация только одного остатка триптофана на молекулу белка, остаточная активность фермента не более 8% по сравнению с исходным. В растворе 50%-ой уксусной кислоты в 5 М мочевине с 40-кратным избытком реагента было блокировано 7,42 остатка триптофана. В случае блокирование этих остатков, по-видимому, имеет место нарушение пространственной структуры макромолекулы ГА. Получается, что по реакционной способности остатки триптофана не равноценны в макромолекуле ГА.
Для изучения избирательности блокирования отдельных остатков триптофана ГА исследовали различные буферные системы с диапазоном pH от 2,85 до 7,0. Оказалось, что в кислой среде реакция протекает с большей скоростью и при высоких концентрациях >1рБ-хлорида фактор времени нивелируется. При 5-кратном избытке реагента удалось модифицировать только 3,72 остатка триптофана на молекулу ГА с полной потерей каталитической функции фермента. Таким образом, при низкой концентрации реагента был блокирован один остаток триптофана с почти полной потерей активности фермента (остаточная активность менее 8% от исходной). В более жестких условиях было блокировано только 3,72 остатка триптофана, в то время, каю в присутствии 5 М мочевины и при высокой концентрации реагента удалось модифицировать 7,42 остатков.
В контрольных опытах с добавлением в пробы ^-триптофана было обнаружено, что при комнатной температуре и концентрации перекиси водорода 2 мМ триптофан полностью окисляется за 1 ч. Изучение кинетики этой реакции показало, что она соответствует кинетике первого порядка и практически не зависит от температуры в избранном диапазоне от 4 до 20 градусов. Константа скорости реакции при концентрации перекиси водорода 2 мМ при 4 градусах равна 2,4*10'2 /мин, а при 20°С - 2,5*10'2/мин. Значительно изменяется константа скорости реакции при изменении концентрации перекиси водорода; она равна 4,0*10"2 /мин при концентрации 20 мМ Н202.
Спектрофотометрйческим методом [4] было определено, что в молекуле ГА имеется 8 остатков триптофана. При окислении этих остатков полоса поглощения, соответствующая 280 нм в УФ-спектре ГА, уменьшается. Поэтому за количественными изменениями блокирования остатков триптофана следили по УФ-спектрам ГА при 280 нм. Изучение кинетики этих изменений при инкубации в системе'перекись водорода-диоксан-бикарбонатный буфер, содержащей разные концентрации перекиси водорода, позволили прийти к заключению,что триптофановые остатки вероятнее всего различны по свойствам в отношении их реакционной способности к окислению. Их можно разделить на три группы. При низкой концентрации перекиси водорода (2 мМ) окисляется только один остаток триптофана, а при высокой (20 мМ) окисляются практически все 8 остатков за 1 ч. В последнем случае окисление происходит быстро и разница в Свойствах остатков триптофана в макромолекуле ГА по отношению к окислителк) нивелируется.
Полученный результат свидетельствует о существенной роли триптофана в акте катализа и дает возможность предположить, что I из 8 триптофановых остатков, имеющихся в составе фермента, может входить в активный центр фермента, непосредственно участвуя в реакции, или находится в ближайшем окружении активного центра ГА, стабилизируя каталитически активную конформацию фермента.
В дальнейших исследованиях предполагается более детальное изучение свойств остатков триптофана ГА для выяснения вопроса об участии этих остатков в структуре активного центра или об их участии в стабилизации гидрофобной части макромолекулы фермента.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козлов Е.А., Цветкова Т.А., Гребенщикова О.Г. Роль некоторых аминокислотных остатков в каталитической активности дезамидазы АГ из Pseudomonas // Бюлл зкснерим. биологии и медицины. 1982. XCIV. С 41-42.
2. Лебедева З.И., Березов Т.Т., Орехович В.Н. Глутампп(асмарагин)аза из Pseudomonas aurantiaca ВКМВ - 548 // Биохимия. 1981.46. С. 85-91.
3. Тютрина Г.В. Исследование роли е-аминогруппы лизина в глутамин(аспарагин)азе из Pseudomonas aurantiaca // В сб.: "Энзимология опухолей"/ Под ред. Березова Т Т. М.: изд-во УДН им. П.Лумумбы, 1985. С. 127-133.
4. Edelhoch Н. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrozine in proteins. //Biochemistry. 1967. 6. N 7. P. 1948-1954.
5. Hachimori Yu., Horinishi H., Kurihara K., Shibata K. States of amino acid residues in proteins. V. Different reactivities with H202 of tryptophan residues in lysozyme, proteinases and zymogens // Biochim. et biophys. acta. 1964. №93. P. 346-360.
6. Scoffone E., Fontana A., Rocchi R’ O-nitrophenilsulfenil chloride for modification of the tryptophan residues // Biochemistry. 1968. 7. N 3. P. 971-9Ж
EFFECT OF CHEMICAL MODIFICATION OF TRYPTOPHAN RESIDUES ON THE CATALYTIC ACTIVITY OF GtUTAMIN(ASPARAGIN)ASE FROM PSEUDOMONAS AURANTIACA
T,T. BEREZOV, A.V. ZHAR1KOVA, V.A. ZANIN, G.V. TIOUTRINA ;
Department of Biochemistry, Russian Peoples'Friendship University Moscow, 117198. Miklukho-'Mukiaya, 8. Medical faculty
Changes in catalytic properties ofglntamin(aspsragin)asc fr6m Pseudomonas aurantiaca 875 depending On the degree of modification (oxidation) of tryptophan residues in the enzyme molecule were analyzed. For such a modification the high specific system was applied: hydrogen peroxide:dioxan:bicarhonat buffer (pH 8.5) and o-nitrophenylsulfenil chloride. The experimental conditions allowed to measure the modification from 1 to 8 tryptophan residues (practically all of them) in I M of enzyme molecule. Experimental data show that modification only one tryptophan residues leads to the almost complete inactivation of enzyrne activity in relation to the substrates. Data obtained suggest on the essential significant of tryptophan in catalytical reaction; it-means; that one from eight tryptophan residues takes part, either in the structure of enzyme and correspondingly catalyze directly the reaction or in structure of nearest environment of active site stabilizing the catalytical active conformation of enzyme molecule.
