CC BY
37
РОЛЬ ОСТАТКОВ ТИРОЗИНА В КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГЛУТАМИН(АСПАРАГИН)АЗЫ ИЗ PSEUDOMONAS AURANTIACA 875
Г,В. ТЮТРИНА, А.В. ЖАРИКОВА, В.А. ЗАНИН, Т.Т. БЕРЕЗОВ
Кафедра биохимии, Российский университет дружбы народов,
Москва, 117198. ул. Миклухо-Маклая д. 8. Медицинский факультет
Исследовали роль остатков тирозина в реакции дезамидирования глутамина и аспарагина ферментом -глутамин(аспарагин)ачой (ГА) из Pseoudomonas aurantiaca 875. Для модификации остатков тирозина белок обрабатывали тетранигрометаном в различных условиях проведения реакции (концентрации реагента, температуры, времени обработки и присутствия стабилизаторов фермента). Было показано, что в состав молекулы входят 28 остатков тирозина. По реакционной способности взаимодействия с тетранитрометаном их можно разделить на три группы: расположенные на поверхности фермента и легко доступные для модификации; частично экранированные и полностью экранированные, экспонированные внутрь молекулы, недоступные для нитрования даже в самых жестких условиях проведения реакции. Для проявления активности ферментом существенными оказались три тирозиновых остатка из восьми, расположенных на поверхности макромолекулы фермента. Модификация этих остатков снижала активность фермента на 85% от исходной активности ГА. Такой результат свидетельствует о том, что, по крайней мере, 1 остаток тирозина должен входить в состав активного центра фермента, а остальные важны для стабилизации активной конформации фермента.
Фермент /,-аспарагиназа (А-аспарагин-амидогидролаза (КФ 3.5.1.1), катализирующий реакцию дезамидирования аспарагина, эффективно используется для лечения острых лимфобластных лейкозов лимфо- и ретикулобластом. Как лекарственный препарат этот фермент выпускается в Германии (краснитин фирмы Bayer) и в Японии (лейназа фирмы Kyowa).
Из некоторых микроорганизмов выделена другая дезамидаза - L-глутамин(аспарагин)аза (ГА) [3, 4]. Возможно этот фермент, вызывающий
дезамидирование двух амидов: как глутамина, так и аспарагина, может оказаться более эффективным противоопухолевым средством и позволит расширить круг опухолей, поддающихся ферментативному лечению.
С другой стороны, одновременное действие по отношению к двум субстратам может облегчить работу по изучению механизма действия фермента и по выяснению строения активного центра фермента. Знание структуры активного центра и механизма действия фермента может способствовать разработке модифицированных и стабилизированных форм фермента с целью повышения противоопухолевой активности или изменения иммунологических свойств фермента. Кроме того, расшифровка механизма действия ферментов создает предпосылки для конструирования низкомолекулярных модельных систем, обладающих активностью аналогичной активности фермента. :
РаНее было показано, что ГА из Pseudomonas boreopolis 526 обладает выраженным цитостатическим действием в отношении ряда лимфолейкозов [3] и противолейкозным действием в опытах на мышах [4].
Для выяснения механизма действия фермента первостепенное значение имеет определение свойств отдельных функциональных групп аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента, групп и радикалов, непосредственно участвующих в акте катализа.
Одним из методов определения функциональных групп, входящих в состав активного центра фермента, является их химическая модификация путем избирательного ■ блокирования отдельных аминокислотных остатков в условиях, исключающих структурную денатурацию белка.
В предыдущих исследованиях по изучению механизма действия ГА из Pseudomonas aurantiaca 875 было показано, что блокирование остатков гистидина и лизина не приводило к существенному снижению дезамидазной активности. Это позволило сделать
вывод о том, что ни лизин, ни гистидин не входят в состав активного центра ГА как нуклеофильные агенты. В то же время результаты указывали, что часть остатков лизина, по-видимому, имеет значение для формирования активного центра, являясь структурообразующими элементами [5].
Задачей настоящей работы было изучение ферментативной функции модифицированной ГА из Pseudomonas aurantiaca 875, в частности, выявление роли остатков тирозина в реакции дезамидирования субстратов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Фермент получен из клеток Pseoudomonas aurantiaca 875, предварительно обработанных ацетоном, по ранее описанному методу [2, 5]. Полученная ГА хроматографически гомогенна, имеет удельную активность 135 ед./мг белка по аспарагину и 195 ед./мг белка по глутамину. Препарат фермента имел одну полосу на диск-электрофореграмме и один пик при изоэлектрофокусировании - изоточка 5,72±0.05 [5].
Количество остатков тирозина определяли спектрофотометрическим титрованием [1]. Для этого 1 мг фермента в 1 мл 0,01N НС1 титровали 0,295 N раствором NaOH с фиксированием результатов на спектрофотометре каждые 20 секунд.
Остатки тирозина в ГА (5 мг белка) нитровали тетранигрометаном в 5 мл 50мМ трис-ЯС/-буфера, pH 8,0. Реактив добавляли в виде 11% раствора в абсолютном спирте [6]. Реакцию останавливали удалением тетранитрометана хроматографией на колонке с Toyeperl HW-40 или с Сефадексом G-25 в 0,05М фосфатном буфере, pH 7,0. Для стабилизации фермента в отдельных опытах в реакционную смесь добавляли глутамат натрия до концентрации 0,05 М. Число нитротирозиновых остатков в белке определяли спектрофотометрически при 275 и 428 нм при pH 8,0, исходя из того, что молярный коэффициент поглощения нитротирозиновых остатков равен £428 =4200, а тирозиновых остатков е27< =2640.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В ходе спектрофотометрического титрования раствора глутамин(аспарагин)азы в 0,01 н HCI 0,295 н. раствором NaOH было установлено, что молекула ГА имеет в своем составе 28 остатков тирозина. Аналогичные результаты при определении количества остатков тирозина в молекуле ГА были получены в опытах с использованием 7М мочевины.
При обработке фермента тетранитрометаном в спектре ГА по мере взаимодействия остатков тирозина с реагентом проявлялось полоса поглощения при 428 нм, соответствующая 3-нитротирозиновому производному тирозина. Это давало возможность спектрофотометрически оценить во времени степень нитрования тирозиновых остатков в ферменте. Для изучения скорости и степени нитрования ГА использовали широкий интервал концентраций реагента от 0.1 до 15.0 мМ. Результаты этого опыта представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты нитрования остатков тирозина ГА тетранитрометаном в зависимости от его концентрации (3,6 мкМ Г А, pH 8.0, комнатная температура)
Концентрация тетранитрометапа (мМ) Время (ч) Количество нитротирозина (моль/моль ГА)
0.1 24 7,64
0.5 24 12.16
5,0 2 15,28
15.0 2 (24) 16,20(16,12)
Из полученных результатов следует, что при концентрации тетранитрометана 0,1мМ наблюдается относительно медленное нитрование тирозиновых остатков. За 24 часа экспозиции в таких условиях нитрованию подверглись 8 остатков тирозина, фермент при этом почти полностью терял активность по отношению к аспарагину и глутамину (остаточная активность не превышала 4-6 % от исходной). Следовательно, из 28 остатков тирозина, имеющихся в молекуле ГА, 8 остатков не экранированы, находятся на поверхности фермента и легко доступны воздействию тетранитрометаном. Была отмечена также некоторая разница в способности взаимодействия с тетранитрометаном у этих 8 относительно быстро нитрующихся остатков тирозина. Так, 3 из них нитровались в течение 1 часа со значительной параллельной потерей активности фермента. Активность ГА в реакционной среде составляла 15-16 % от исходной.
Еще 8 остатков тирозина удавалось модифицировать при увеличении концентрации тетранитрометана в реакционной среде до 5 мМ, за 2 часа экспозиции. Дальнейшее увеличение концентрации нитрующего агента (до 15 мМ) и времени обработки от 2 до 24 часов не меняло результатов нитрования. Можно предположить, что эти остатки экранированы остатками других аминокислот и не доступны воздействию тетранитрометана. Таким образом, можно заключить, что в составе ГА имеется значительное количество остатков тирозина, которые не модифицируются в выбранных довольно жестких условиях опытов, но когда еще нет полного нарушения пространственной структуры макромолекулы Г А.
Скорость титрования остатков тирозина, расположенных на поверхности фермента, возрастает с повышением температуры (табл. 2). Как уже отмечали, при взаимодействии глутамин(аспарагин)азы с 0,1 мМ тетранитрометана в течение 1 часа приводило к модификации трех тирозиновых остатков. С увеличением времени проведения реакции до 24 часов их число возрастало до 8 и в,дальнейшем не менялось.
Таблица 2
Влияние температуры на быструю фазу реакции нитрования остатков тирозина ГА (3,6 мкМ ГА; 0,1 мМ тетранитрометана)
Температура, С0 Количество нитротирозина, моль/моль ГА к,10\ с4 Активность в % по отношению к исходной
20 2.88 1.71 <15
30 4.20 2.13 4
45 7.92 9.50 0
Как следует из табл. 2, с увеличением температуры в реакционной смеси до 45°С не удавалось модифицировать в ГА более восьми тирозиновых остатков в молекуле фермента.
Таким образом, из полученных результатов следует, что остатки тирозина ГА по способности взаимодействовать с тетранитрометаном могут быть разделены на три группы: свободно экспонированные во внешнюю среду; частично экранированные; экспонированные внутрь белковой молекулы. Поскольку нитрование части легко доступных остатков тирозина приводило к резкому снижению активности ГА по отношению к обоим субстратам, можно предположить, что некоторые из них входят в состав активного центра. Другая часть остатков тирозина - частично доступная для нитрования - может быть не менее важной для поддержания нативной пространственной структуры фермента
л?.;’..)?-;--:: Литература
1. Березов Т.Т. и др. Выделение и йсследование физико-химических свойств противоопухолевых бактериальных ферментов L-лизин-а-оксидазы и глутамин(аспарагин)азы // В сб. “Медицина” (Ред. кол.: Тихонов А.Н., Садовничий В.А. и др.) I М.: Изд-во МГУ. 1994, 1, с. 9-13 (Программа
“Университеты РОССИИ”).
2. Лебедева З.И., Березов Т.Т., Орехович В.Н. Глутамин(аспарагин)аза из Pseudomonas aurantiaca ВКМВ -548 //Биохимия, 1981,46, с. 85-91.
3. Пехов А.А.; Жукова О.С., Занин В.А, Добрынин: Я.В., Березов Т Т.. Влияние препаратов глутамин(аспаранин)азы из микроорганизмов на синтез ДНК в опухолевых клетках // Бюлл.эксперим.
. биол. и мед. 1983, XCV1. №9, с. 83-84. t 4, Пехов А.А., Занин В.А., Козлов А.М., Юрченко А Я.. Березов Т Т.. Биологические свойства глутамин(аспарагин)азы из Pseudomonas boreopolis 526 // Бюлл. жсперим. биол. и мед 1986, СИ. №7. С 71-75.
5 Тклрина Г.В. Исследование роли е-амино1 руины лизина в глутамин(аспарагин)азе из Pseudomonas aurantiaca // В сб.: "Энзимология опухолей"/ Под ред. Березова Т.Т. М.: Изд-во УДН им. Г1. Лумумбы, 1985. С. 127-133.
6. Goto К., Takahashi N.. Muracyi Т. //J. Biochtm.,1971. 70. N I, p. 157-164.
THE ROLE OF TYROSINE RESIDUES IN CATAI.YTK.U, ACTIVITY OF GUITAMIN(ASPARAGIN)ASE
FROM PSEUDOMONAS AURANTIACA 875
G.V. T10UTR1NA, A.V. ZHARIKOVA, V.A. ZANIN, T.T. BEREZOV.
Department of Biochemistry, Peoples Friendship University
Moscow, 117198. Miklukho-Maklaya, 8. Medical Faculty
The significance of tyrosine residues of enzyme from Pseudomonas aurantiaca 875 which catalyses deamidation reaction of glutamine and asparagine was studied For the tyrosine residues modification the protein was treated by tetranitromethane in different conditions of reaction ( reagent concentration, temperature, time and the presence of enzyme stabi 1 izators).It was shown that there are 28 tyrosine residues in one mole of enzyme. According to reaction capability of interaction between enzyme and tetranitromethane the residues may be divided into 3 groups: partly screened, fully screened, and exposed in intramolecular structures which were unaccessible for nitration reaction even in a very rough conditions. For the developing of enzyme activity three tyrosine residues from eight on outer surface of protein molecule were essential. Modification of these residues could decreased the enzyme activity up to 85 percent from initial state. Such a results suggest that at least one tyrosine residue must included in the active site of enzyme, while others are probably important for the stabilization of protein conformation.
