CC BY
52
[¡К^ззшщЖ
ВОЛГОГРАДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
ежеквартальный научно-практическии журнал
Главный редактор
B. И. Петров, академик РАМН Зам. главного редактора
М. Е. Стаценко, профессор
РЕДАКЦИОННАЯ КОЛЛЕГИЯ
А. Р Бабаева, профессор А. Г. Бебуришвили, профессор
A. А. Воробьев, профессор
C. В. Дмитриенко, профессор
B. В. Жура, доцент
М. Ю. Капитонова, профессор (научный редактор)
C. В. Клаучек, профессор
Н. И. Латышевская, профессор В. Б. Мандриков, профессор И. А. Петрова, профессор
B. И. Сабанов, профессор Л. В. Ткаченко, профессор
C. В. Туркина (ответственный секретарь)
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ
А. Б. Зборовский, академик РАМН (Волгоград)
Н. Н. Седова, профессор (Волгоград)
A. А. Спасов, чл.-кор. РАМН (Волгоград)
B. П. Туманов, профессор (Москва)
Г. П. Котельников, академик РАМН (Самара)
П. В. Глыбочко, чл.-кор. РАМН (Москва)
В. А. Батурин, профессор (Ставрополь)
1 (33)
ЯНВАРЬ-МАРТ 2010
9771994948340
УДК: 616.379-008.64-085.252.349:616-003.9
ВЛИЯНИЕ ГИМНЕМОВЫХ КИСЛОТ НА ГИБЕЛЬ И РЕПАРАЦИЮ р -ЭНДОКРИНОЦИТОВ ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОМ ДИАБЕТЕ
В. Б. Писарев \, Г. Л. Снигур, А. А. Спасов*, М. П. Воронкова*, А. Е. Буланов*
Кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии ВолГМУ, лаборатория морфологии и иммуногистохимии Волгоградского научного центра РАМН*, Российский НИИ Здоровья, Москва**
Введение экстракта гимнемовых кислот предотвращает повреждение р-эндокриноцитов панкреатических островков при стрептозотоцин-индуцированном диабете. Гимнемовые кислоты частично ингибируют апоптоз и ускоряют процессы репаративной регенерации р-эндокриноцитов.
Ключевые слова: сахарный диабет, р-эндокриноциты, апоптоз, регенерация, стрептозотоцин.
THE INFLUENCE OF GYMNEMA ACIDS ON CELL DEATH AND REPARATION OF (3-CELLS ON STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETES MELLITUS
V. B. Pisarev, G. L. Snigur, A. A. Spasov, M. P. Voronkova, A. E. Bulanov
Inoculation of Gymnema acids extract prevents damage of pancreatic islets of p-cells in models of streptozotocin-induced diabetes mellitus. Gymnema acids partially inhibit apoptosis and increase regeneration of p-cells. Key words: diabetes mellitus, pancreatic p-cells, apoptosis, regeneration, streptozotocin.
Ранняя инвалидизация и высокая летальность от поздних осложнений возводят сахарный диабет (СД) в ранг глобальной медико-социальной проблемы здравоохранения многих стран мира [3]. Одним из приоритетных направлений современной фармакологии является создание новых антидиабетических средств. При этом существующий алгоритм лечения СД, особенно II типа, не всегда является оптимальным способом коррекции гипергликемии и развития осложнений. Ведется активный поиск гипогликеми-ческих препаратов с новыми механизмами действия: секретогенов, сенситайзеров инсулина, ингибиторов скорости продукции глюкозы печенью и др. Одним из перспективных направлений является поиск модуляторов инкретинов: GIP (глюкозозависимый инсу-линотропный полипептид) и GLP-1 (глюкагоноподоб-ный пептид-1 ), которые регулируют активность секреции b-клеток путем оптимизации синтеза инсулина и способствуют пролиферации b-клеток, новообразованию панкреатических островков, а также угнетают апоптоз. Установлено, что некоторые растительные экстракты, в частности гимнемы лесной (Gymnema sylvestre), обладают выраженными гипогликемичес-кими свойствами [4].
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Изучение лекарственного патоморфоза и особенностей репаративной регенерации р-эндокриноцитов панкреатических островков при их повреждении стреп-тозотоцином на фоне введения гимнемовых кислот
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили на белых крысах-самцах, массой 300—340 г, разделенных на группы: 1 — интактная (n = 10), 2 — стрептозотоцин-индуцирован-
ный СД (n = 10) и 3 — стрептозотоцин-индуцирован-ный СД на фоне введения гимнемовых кислот (n = 10). Во 2-й и 3-й опытных группах моделировали тяжелый СД (глюкоза крови выше 15 ммоль/л) ежедневным в/в введением стрептозотоцина (Sigma) в дозе 20 мг/кг в течение 5 дней. В 3-й группе перорально вводили экстракт гимнемовых кислот в дозировке 280 мг/кг, 2 раза/сутки. Животные контрольной группы и с моделью СД получали питьевую отстоянную воду в аналогичном объеме (протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом, решение № 43-2006). Спустя три недели, соблюдая принципы гуманного отношения, животных выводили из эксперимента. Ткань поджелудочной железы фиксировали в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4) и заливали в парафиновые блоки. На роторном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5—6 мкм. Производили окрашивание гематоксилином и эозином по общепринятой гистологической методике [5]. Для иммуногистохимического исследования использовали поликлональные антитела к инсулину (DakoCytomation), протеинам p53 (DakoCytomation) и Bax (BD Pharmingen); монокло-нальные антитела к ядерному антигену пролифери-рующих клеток — PCNA (клон PC10), к белку Ki-67 (клон MIB-5), к каспазе 3 (клон JHM62, Novocastra), к рецептору TRAIL — родственный фактору некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд (клон 27B12, Novocastra), белку MDM2 (клон 1B10, Novocastra) и протеину Bcl2 (клон sc-7382, Santa Cruz). Иммуноги-стохимическое исследование проводили по протоколу фирм производителей (HIER) с использованием систем детекции «LSAB» и «En Vision» и хромогеном — диаминобензидином. Характер иммуногисто-
химической реакции оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски и количества окрашенных клеток по шкале Allred D. C., et al. (1998).
Морфометрический анализ проводили с помощью программы анализа изображений «ВидеоТест-Морфо-4». Определяли индексы апоптоза и пролиферации (число ß-клеток панкреатических островков с признаками апоптоза и пролиферации на 100 %). Статистическую обработку данных проводили в программе «MS Excel» с расчетом базовых статистических показателей (M, m) и использованием парного t-критерия Стьюдента при достоверности p < 0,05 [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В контрольной группе отмечалось типичное гистологическое строение поджелудочной железы. В панкреатических островках ß-эндокриноциты располагались преимущественно в центре. Выявлялась выраженная цитоплазматическая экспрессия инсулина. В отдельных ß-клетках отмечалась слабая или умеренная ядерная экспрессия факторов пролиферации: PCNA-позитивные клетки составляли 3 %, Ki-67-позитивные — 1,5 %. Экспрессия Bax была негативной во всех клетках. Определялось слабое позитивное цитоплазматическое окрашивание к протеину Bcl-2. В ядрах единичных ß-клеток определялась слабая экспрессия белка p53. Большинство ядер ß-клеток позитивно окрашивались антителами к белку MDM2. Цитоплазматическая экспрессия кас-пазы 3 и TRAIL носила слабо выраженный характер в единичных ß-эндокриноцитах (табл. 1). Апоптотичес-кий индекс составлял 4,1 % (табл. 2).
У крыс со стрептозотоцин-индуцированным СД определялся выраженный отек междольковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров. В коллабированных панкреатических островках отмечалась умеренная лимфоцитарная инфильтрация. В большинстве островков отмечались выраженные деструктивные изменения ß-клеток и разрастание соединительной ткани. Инсулин-позитивные клетки располагались поодиночке или в виде мелких скоплений в центральных отделах островков. Отмечалась их гипертрофия с выраженной экспрессией инсулина и умеренной экспрессией факторов пролиферации: PCNA-позитивные клетки составляли 9 %, Ki-67-по-зитивные — 2,3 %. Экспрессия протеинов p53, Bax, MDM2 и Bcl-2 была слабая в единичных клетках. Отмечалась выраженная экспрессия TRAIL и каспазы 3 в большинстве ß-эндокриноцитов (табл. 1). Происходило достоверное увеличение ß-эндокриноцитов, находящихся в состоянии апоптоза, по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2).
В группе животных со стрептозотоцин-индуци-рованным СД, получавших экстракт гимнемовых кислот, в панкреатических островках сохранялась умеренная лимфоцитарная инфильтрация, полнокровие
капилляров и деструктивные изменения ß-эндокри-ноцитов. Единичные островки были полностью скле-розированы. Отмечалась умеренно выраженная гипертрофия ß-эндокриноцитов центральных отделов островков с выраженной экспрессией инсулина. Мелкие островки без признаков воспаления и деструкции располагались в тесной связи с выводными протоками. Среди ацинарных клеток определялись единичные инсулин-позитивные клетки или их скопления. Экспрессия факторов пролиферации носила выраженный характер: PCNA-позитивные клетки составляли 13,1 %, Ki-67-позитивные — 3,2 %. Также отмечались PCNA-позитивные и Ki-67-позитивные клетки эпителия протоков и единичные клетки, расположенные в ацинарной ткани и в непосредственной близости от островков. Экспрессия протеинов p53, Bcl-2 была слабая и Bax негативная. Умеренная экспрессия протеина MDM2 отмечалась в большинстве клеток островков Лангерганса. Экспрессия каспазы 3 и TRAIL отмечалась в единичных ß-эндокриноцитах (табл. 1). Количество ß-клеток в состоянии апоптоза по сравнению с животными с СД достоверно уменьшалось (табл. 2).
Таблица 1
Иммуногистохимические характеристики ß-эндокриноцитов по Allred D. C., et al. (1998)
Интенсивность экспрессии Количество клеток
Интактная СД СД + ГК Интактная СД СД + ГК
Инсулин +++ +++ +++ +++ + ++
p53 - + + - + +
PCNA + ++ +++ + + ++
Ki-67 + ++ +++ + + ++
Каспаза 3 + +++ ++ + ++ +
TRAIL + +++ ++ + ++ +
Bax - + - - + -
Bcl2 + - + + - +
MDM2 ++ + ++ +++ + ++
Таблица 2 Индексы апоптоза и пролиферации ß -эндокриноцитов
Группы Пролиферативный индекс по PCNA, % Пролиферативный индекс по Ki-67, % Апоптотиче-ский индекс
Интактная 3,0 ± 0,2 1,5 ± 0,3 4,1 ± 0,2
СД 10,1 ± 0,7* 2,3 ± 0,1* 35,2 ± 2,9*
СД + ГК 13,1 ± 1,9 3,2 ± 0,2** 13,3 ± 1,1**
* Достоверно по отношению к интактной группе; ** достоверно по отношению к группе с СД.
Известно, что при токсическом действия стреп-тозотоцина на р-клетки происходит фрагментация ДНК в результате ее алкилирования, а также образование токсических соединений — супероксид аниона, пероксинитрита и оксида азота. Грубые необратимые повреждения ДНК и внутриклеточных структур сопровождаются развитием некроза р-эндокри-ноцитов. Наравне с деструктивными изменениями в островках Лангерганса удается обнаружить активацию запрограммированной клеточной гибели, так
Выпуск 1 (33). 2010
39 ^^^^
UseiropGs
называемый апоптоз, пусковым моментом которого служат нелетальные повреждения ДНК, повреждение мембран митохондрий и действие на клетку внешних стимулов [9].
Вне зависимости от причины активации апоп-тоза ключевое место в его развитии занимает семейство цистеиновых протеаз, так называемые кас-пазы, которые образуют разветвленный каскад, взаимно активируя друг друга. В результате взаимодействия каспазного каскада активируется эффек-торная каспаза 3, которая вызывает расщепление внутриклеточных белков и влечет гибель клетки [6, 8]. Выраженность апоптотического индекса и распространенность площади некрозов позволяют оценить степень повреждения ткани поджелудочной железы и наравне с биохимическими показателями (уровень гликемии, гликозилированный гемоглобин и др.) могут служить критерием степени тяжести экспериментального СД.
Расчет индекса пролиферации выявил достаточно низкую активность р-эндокриноцитов в контрольной группе животных, что согласуется с литературными данными о медленном обновление клеточной популяции островков Лангерганса [2]. При моделировании СД и гибели большей части р-клеток достоверное увеличение индекса пролиферативной активности обусловлено активацией репаративных процессов. Из экспериментальных данных следует, что гимнемовые кислоты обладают выраженным стимулирующим действием на процессы клеточной репарации, что вполне согласуется с опытом зарубежных исследователей. Пролиферация не только островко-вых р-клеток, но и экспрессия маркеров клеточного деления в ацино-инсулярных клетках и клетках эпителия протоков рассматривается как активация клеток предшественников р-эндокриноцитов [11]. Однако вопрос о существовании клеток предшественников эндокриноцитов по-прежнему остается открытым. Ряд исследователей рассматривают в качестве таких клеток камбиальные клетки протоков поджелудочной железы [7]. Другие считают, что клетки предшественники эндокриноцитов присутствуют не только в системе протоков поджелудочной железы, но также определяются вокруг островков и способны транс-дифференцироваться в р-эндокриноциты. Эти клетки встречаются крайне редко — 1 клетка на 3000—9000 клеток, и их гистогенез остается не выясненным [11].
Экспрессию ядерного антигена пролиферирую-щих клеток не всегда можно рассматривать как достоверный признак пролиферации, так как данный антиген обладает продолжительным периодом разрушения (около 20 часов) и экспрессируется в G0 фазе клеточного цикла и при репарации ДНК клеток [10]. В связи с этим более достоверным для расчетов индекса пролиферации следует считать экспрессию протеина №-67.
Усиление репаративных процессов р-кпеток, обусловленное введением гимнемовых кислот, объясняется наличием инкретиномиметического эффекта, то есть стимуляцией GLP-1, который, как известно, регулирует баланс клеточной популяции островков Лангерганса за счет активации пролиферации и угнетения апоптоза. Однако конкретный механизм регуляции численности эндокриноцитов остается до конца не выясненным.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, пероральное введение гимнемовых кислот у крыс с экспериментальным СД не препятствует развитию деструктивных изменений в р-эндокриноцитах. Выявленные особенности патомор-фоза стрептозотоцин-индуцированного СД и репаративных процессов обусловлены инкретиноподобным действием гимнемовых кислот. Введение гимнемовых кислот существенно замедляет апоптоз, а также активирует репаративную регенерацию р-клеток при экспериментальном сахарном диабете.
ЛИТЕРАТУРА
1. Автандилов Г. Г. Основы количественной патологической анатомии. — М.: Медицина, 2002. — 240 с.
2. Акмаев И. Г. Руководство по гистологии (частная гистология органов и тканей) / Под ред. И. Г. Акмаева, В. Л. Быкова, О. В. Волкова. — В 2 т. — СПб: СпецЛит. — 2001. — 735 с.
3. Балаболкин М. И., Клебанова Е. М., Креминская В. М. Лечение сахарного диабета и его осложнений. Руководство для врачей. — М.: Медицина. — 2005. — 511 с.
4. Воронкова М. П. Противодиабетическая активность гимнемовых кислот: автореф. дис. ... доктора биол. наук. — Волгоград. — 2009. — 46 с.
5. Коржевский Д. Э. Краткое изложение основ гистологической техники для врачей и лаборантов-гистологов. — СПб. — 2005. — 48 с.
6. Мушкамбаров Н. Н., Кузнецов С. Л. Молекулярная биология. — М.: «МИА». — 2003. — 544 с.
7. Drucker D. J. // Endoc. — 2003. — Vol. 144, № 1. — Р. 5145—5148.
8. Nakayama T., Hattori M., Uchida K., et al. // Biochem J. — 2004. — Vol. 377,— № 2. — Р. 299—307.
9. Szkudelski T. // Physiol. Res. — 2001. — Vol. 50, №6. — P. 536—546.
10. Tirakotai W., Bian L. G., Bertalanffy H., et al. // Chinese Medical Journal. — 2004. — Vol. 117, № 12. — P. 1815— 1820.
11. Trucco M. // J. Clin. Investigation. — 2005. — Vol. 115, №1. — P. 5—12.
Контактная информация:
Снигур Григорий Леонидович — к. м. н., доцент кафедры патологической анатомии с секционным курсом и курсами патологии и морфологии ВолГМУ, [email protected]
СОДЕРЖАНИЕ
ЛЕКЦИЯ
Бабаева А. Р., Тарасов А. А., Безбородова Т. А., Захарьина О. А. КОНЦЕПЦИЯ СИСТЕМНОГО ВОСПАЛЕНИЯ В ПАТОГЕНЕЗЕ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ АНГИОПАТИИ 3
ОБЗОРНЫЕ СТАТЬИ
Стаценко М. Е., Туркина С. В. ПОРАЖЕНИЕ СЕРДЦА У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА:
ФАКТОРЫ РИСКА И МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ 9
Плохое В. Н., Барсуков В. Ю., Чеснокова Н. П., Селезнева Т. Д. НЕДОСТАТОЧНОСТЬ НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ РЕЗИСТЕНТНОСТИ И СПЕЦИФИЧЕСКИХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ ЗАЩИТЫ КАК ФАКТОР РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 15
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бирюков С. П., Шкарин В. В., Кожухова Н. П., Ярыгин О. А. ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ МЕДИЦИНСКИХ РАБОТНИКОВ ВОЛГОГРАДА 22
Фролова Е. В.
БЛОКАДА РЕНИН-АНГИОТЕНЗИН-АЛЬДОСТЕРОНОВОЙ СИСТЕМЫ: СРАВНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ КОМБИНИРОВАННОЙ ТЕРАПИИ КАРДОСТЕНОМ В СОЧЕТАНИИ С ЭНАЛАПРИЛОМ И ДИОВАНОМ В СОЧЕТАНИИ С ЭНАЛАПРИЛОМ У ПАЦИЕНТОВ С АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ ПЕРВОЙ СТЕПЕНИ В СОЧЕТАНИИ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ 26
Петров В. И., Рогова Н. В., Михайлова Д. О. ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСНОЙ ТЕРАПИИ БОЛЬНЫХ С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2-ГО ТИПА 28
Мандриков В. Б., Краюшкин А. И., Лиманская Н. И., Царапкин Л. В. МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПРОФИЛЬ И СОМАТОТИП ПРИЗЫВНИКОВ ВОЛГОГРАДСКОГО РЕГИОНА 33
Макляков Ю. С., Бицуев В. Г.,
Шарданов Н. А., Соколов О. Ю., Хоронько В. В.
ФАРМАКОЭКОНОМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЭФФЕКТИВНОСТИ
АНТИАРИТМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ
БЕТА-АДРЕНОБЛОКАТОРАМИ ПРИ ПОСТОЯННОЙ
ФОРМЕ ФИБРИЛЛЯЦИИ ПРЕДСЕРДИЙ 35
, Снигур Г. Л., Спасов А. А., П., Буланов А. Е. ВЛИЯНИЕ ГИМНЕМОВЫХ КИСЛОТ НА ГИБЕЛЬ И РЕПАРАЦИЮ р-ЭНДОКРИНОЦИТОВ ПРИ СТРЕПТОЗОТОЦИН-ИНДУЦИРОВАННОМ ДИАБЕТЕ 38
LECTURE
Babaeva A. R., Tarasov A. A.,
Bezborodova T. A., Zaharina O. A.
CONCEPT OF SYSTEMIC INFLAMMATION IN DIABETIC
ANGIOPATHY PATHOGENESIS 3
SURVEYS
Statsenko M. E., Turkina S. V.
CARDIAC LESION IN TYPE II DIABETIC PATIENTS:
RISK FACTORS AND MECHANISMS
OF DEVELOPMENT 9
Plohov V. N., Barsukov V. Yu.,
Chesnokova N. P, Selezneva T. D.
INSUFFICIENCY OF NONSPECIFIC
RESISTANCE MECHANISMS AND SPECIFIC
HOST-DEFENSE MECHANISMS AS BREAST CANCER
RISK FACTOR 15
ORIGINAL PAPER
Birukov S. P., Shkarin V. V,
Kozhuhova N. P., Jarygin O. A.
COMMON DISEASE INCIDENCE OF MEDICAL STAFF
IN VOLGOGRAD 22
Frolova E. V.
RENIN-ANGIOTENSIN-ALDOSTERON SYSTEM BLOCK: COMPARISON OF THE RESULTS OF COMBINED THERAPY WITH CARDOSTAN IN COMBINATION WITH ENALAPRIL AND WITH DIOVAN IN COMBINATION WITH ENALAPRIL IN PATIENTS WITH THE FIRST DEGREE ARTERIAL HYPERTENSION IN COMBINATION
WITH METABOLIC SYNDROME 26
Petrov V. I., Rogova N. V., Mikhailova D. O.
PHARMAECONOMIC ANALYSIS
OF THE EFFICACY OF COMPLEX THERAPY
FOR TYPE II DIABETIC PATIENTS 28
Mandrikov V. B., Krayushkin A. I., Limanskaia N. I., Tsarapkin L. V. MORPHO-FUNCTIONAL PROFILE AND SOMATOTYPE OF DRAFTEES IN VOLGOGRAD REGION 33
Makljakov J. S., Bitsuev V. G,
Shardanov N. A., Sokolov O. U., Horonko V. V.
PHARMACOECONOMIC ANALYSIS
OF EFFICIENCY OF ANTIARRHYTHMIC THERAPY
WITH BETA-ADRENOBLOCKERS IN CONSTANT
FORM OF ATRIAL FIBRILLATION 35
\Pisarev V. B., Snigur G. L., Spasov A. A, Voronkova M. P., Bulanov A. E. THE INFLUENCE OF GYMNEMA ACIDS ON CELL DEATH AND REPARATION OF ß-CELLS ON
STREPTOZOTOCIN-INDUCED DIABETES MELLITUS 38
Писарев В. Б. Воронкова М.
