CC BY
40
МОРФОЛОГИЯ
В. Б. Писарев], Г. Л. Снигур, А. А. Спасов*, М. П. Самохина*
Кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии* ВолГМУ
КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ ¡3-ЭНДОКРИНОЦИТОВ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ, ОБУСЛОВЛЕННАЯ АЛЛОКСАНОВОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ
УДК 616.37:616018.1-018
Авторами дано морфологическое обоснование цитотоксического действия аллоксана на р-клетки поджелудочной железы, уточнен механизм их гибели.
Ключевые слова: сахарный диабет, аллоксан, апоптоз, р-клетки.
Селективную деструкцию р-клеток панкреатических островков вызывают некоторые химические вещества хлорозотоцин, аллоксан, стрептозо-тоцин, ципрогептадин. Наиболее широкое применение для моделирования сахарного диабета у животных получили аллоксан и стрептозотоцин [6]. Данные вещества повреждают р-клетки человека и лабораторных животных (мыши, крысы, собаки) [7]. Моделирование различных по тяжести состояний нарушения углеводного обмена (явный сахарный диабет различной формы: инсулинозависимый и инсулинонезависимый, нарушенная толерантность к углеводам или скрытый диабет) зависит от применяемой в эксперименте дозы цитотоксинов.
Повреждающее действие р-цитотоксинов осуществляется посредством нескольких механизмов: формирование разрывов ДНК с последующей активизацией поли-АДФ-рибозо-синтетазы; угнетение активного транспорта кальция и кальмодулинак-тивированной протеинкиназы; генерация свободных радикалов кислорода, нарушающих эндогенные процессы защитной функции клетки.
Однако, несмотря на то, что аллоксан имеет многолетнюю историю применения, некоторые механизмы клеточного повреждения, обусловленного его введением, изучены не в полном объёме.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Уточнение механизмов клеточной гибели р-эн-докриноцитов панкреатических островков при введении аллоксана.
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили на 20 белых крысах-самцах массой 300—340 г., разделенных на
две группы. Животным опытной группы осуществляли однократную внутрибрюшинную инъекцию аллоксана в дозе 120 мг/кг. Контролем являлись интактные крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. Протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (решение № 43, 2006). Спустя 7 дней животных выводили из эксперимента, изготавливали микропрепараты поджелудочной железы по общепринятым гистологическим методикам с последующей окраской гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование выполняли на базе лаборатории морфологии и иммуногистохимии отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН. Были использованы моноклональные антитела к каспазе 3 (клон JHM62), протеину MDM2 (клон 1В10), NO-синтазе-З (клон RN5), TNF-anon-тоз индуцирующему лиганду (TRAIL, клон 27В12) (Novocastra, Великобритания) и белку Bcl-2 (клон sc-7382, Santa Cruz, США) и поликлональных антител к белкам р53 (DakoCytomation, Дания) и Вах (BD Pharmingen, США). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В группе интактных животных поджелудочная железа имела классическое гистологическое строение: дольки альвеолярно-трубчатого строения, разделенные тонкими прослойками соединительной ткани. Вблизи выводных протоков располагались островки Лангерганса. При иммуногистохимическом исследовании эндокриноциты панкреатических островков были негативны к окрашиванию на белки
МОРФОЛОГИЯ
ВЛэГПисарёв], г. Л, Снигур, А. А. Спасов*, М. П. Самохина*
Кафедра патологической анатомии, кафедра фармакологии* ВолГМУ
КЛЕТОЧНАЯ ГИБЕЛЬ (3-ЭНДОКРИНОЦИТОВ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ОСТРОВКОВ, ОБУСЛОВЛЕННАЯ АЛЛОКСАНОВОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТЬЮ
УДК 616.37:616018.1-018 __
Авторами дано морфологическое обоснование цитотоксического действия аллоксана на р-клетки поджелудочной железы, уточнен механизм их гибели.
Ключевые слова: сахарный диабет, аллоксан, апоптоз, р-клетки.
Селективную деструкцию р-клеток панкреатических островков вызывают некоторые химические вещества хлорозотоцин, аллоксан, стрептозо-тоцин, ципрогептадин. Наиболее широкое применение для моделирования сахарного диабета у животных получили аллоксан и стрептозотоцин [6]. Данные вещества повреждают р-клетки человека и лабораторных животных (мыши, крысы, собаки) [7]. Моделирование различных по тяжести состояний нарушения углеводного обмена (явный сахарный диабет различной формы: инсулинозависимый и инсулинонезависимый, нарушенная толерантность к углеводам или скрытый диабет) зависит от применяемой в эксперименте дозы цитотоксинов.
Повреждающее действие р-цитотоксинов осуществляется посредством нескольких механизмов: формирование разрывов ДНК с последующей активизацией поли-АДФ-рибозо-синтетазы; угнетение активного транспорта кальция и кальмодулинак-тивированной протеинкиназы; генерация свободных радикалов кислорода, нарушающих эндогенные процессы защитной функции клетки.
Однако, несмотря на то, что аллоксан имеет многолетнюю историю применения, некоторые механизмы клеточного повреждения, обусловленного его введением, изучены не в полном объёме.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ
Уточнение механизмов клеточной гибели р-эн-докриноцитов панкреатических островков при введении аллоксана.
МЕТОДИКА 'ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проводили на 20 белых крысах-самцах массой 300—340 г., разделенных на
две группы. Животным опытной группы осуществляли однократную внутрибрюшинную инъекцию аллоксана в дозе 120 мг/кг. Контролем являлись интактные крысы, содержавшиеся в стандартных условиях вивария. Протокол экспериментальной части исследования согласован с Региональным этическим комитетом (решение № 43, 2006). Спустя 7 дней животных выводили из эксперимента, изготавливали микропрепараты поджелудочной железы по общепринятым гистологическим методикам с последующей окраской гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование выполняли на базе лаборатории морфологии и иммуногистохимии отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН. Были использованы моноклональные антитела к каспазе 3 (клон JHM62), протеину MDM2 (клон 1В10), NO-синтазе-З (клон RN5), TNF-anon-тоз индуцирующему лиганду (TRAIL, клон 27В12) (Novocástra, Великобритания) и белку Bcl-2 (клон sc-7382, Santa Cruz, США) и поликлональных антител к белкам р53 (DakoCytomation, Дания) и Вах (BD Pharmingen, США). Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В группе интактных животных поджелудочная железа имела классическое гистологическое строение: дольки альвеолярно-трубчатого строения, разделенные тонкими прослойками соединительной ткани. Вблизи выводных протоков располагались островки Лангерганса. При иммуногистохимическом исследовании эндокриноциты панкреатических островков были негативны к окрашиванию на белки
Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН 4/2008
NO-синтаза-З, TRAIL, р53 и Вах. Единичные слабо Bcl-2-позитивные эндокриноциты располагались в центральных отделах островков. Большинство клеток островков Лангерганса имели позитивную ядерную окраску к протеину MDM2.
В группе животных с аллоксан-индуцирован-ным сахарным диабетом отмечался отек междоль-ковой соединительной ткани и полнокровие кровеносных капилляров поджелудочной железы. Определялся умеренный коллапс панкреатических островков. В эндокриноцитах, расположенных в центральных отделах островков, отмечались признаки деструкции. Наблюдалось негативное имму-ногистохимическое окрашивание (3-клеток к белкам р53, TRAIL и NO-синтазе-З. Слабо позитивно окрашивалась цитоплазма к протеину Вс1-2. Экспрессия белков каспазы 3 и Вах была умеренной в большинстве p-эндокриноцитов. В незначительной части клеток (расположенных преимущественно в периферических отделах островков Лангерганса) отмечалось умеренное ядерное окрашивание к белку MDM2.
Известно, что повреждение ДНК р-клеток панкреатических островков обусловлено избирательной цитотоксичностью аллоксана за счет образования активных форм кислорода и перекиси водорода, что приводит к окислению SH-rpynn белков. Открытым остается вопрос об участии оксида азота (N0) в цитотоксическом эффекте аллоксана, так как при низких концентрациях N0 в р-клетках ин-гибируются индуцибельные формы NO-синтазы и уменьшается повреждение ДНК [3].
Важным аспектом аллоксановой цитотоксич-ности является нарушение интрацеллюлярного гомеостаза кальция. В экспериментах in vitro и in vivo подтверждено увеличение концентрации ци-топлазматического кальция в клетках панкреатических островков при аллоксановом диабете. Избыточное поступление кальция из внеклеточной жидкости и его мобилизация из внутриклеточных депо обусловлена деполяризацией клеточных мембран и мембран митохондрий р-клеток [2, 7]. Грубое повреждение внутриклеточных структур свободными радикалами, окисление SH-групп белков и нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция сопровождается развитием некроза.
Однако существует и другой механизм гибели р-клеток —апоптоз. Одним из пусковых факторов апоптоза в результате действия сильных окислителей является повреждение ДНК или внутриклеточных мембран митохондрий. Ключевое положение в реализации механизмов клеточной гибели занимает белок р53 и семейство цитоплазма-тических протеаз — каспаз. Белок р53 является ключевым звеном в развитии апоптоза, однако существуют механизмы запрограммированной кле-
точной гибели без участия данного белка (механизм действия фактора некроза опухоли). Белок 1\ЮМ2 является антиапоптогеном и предохраняет клетку от запрограммированной гибели путем ин-гибирования синтеза протеина р53 и ускорения его распад в цитозоле [1].
Семейство каспаз образует разветвленный каскад, взаимно активирующий друг друга [8]. Активация каспазного каскада возможна с помощью сигнала, полученного от цитолеммы (каспа-за 8), или в результате митохондриальных факторов (каспаза 9). Каспазы 8 и 9 активируют эффек-торную каспазу 3, после чего процесс клеточной смерти оказывается необратимым [4].
Однако активация апоптоза возможна и без участия каспазного каскада. Гиперэкспрессия белка-промотора апоптоза Вах приводит к дестабилизации мембран митохондрий и индуцирует апоптоз. Проницаемость мембран митохондрий для кальция регулируется белками семейства Вс1-2/Вах. Протеин Вс1-2 оказывает ингиби-рующее действие на апоптоз за счёт снижения проницаемости мембран, а Вах наоборот активирует апоптоз, так как увеличивает проницаемость. Таким образом, митохондриальная ветвь апоптоза может активироваться протеином Вах с дальнейшей активацией только эффекторной каспазы-3 [5].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, реализация цитотоксическо-го эффекта аллоксана происходит за счёт развития двух процессов: некроза и апоптоза. Действие свободных радикалов и окисление БН-групп белков приводит к грубому деструктивному процессу— некрозу, а апоптоз активируется за счёт нарушения гомеостаза кальция и дестабилизации мембран митохондрий с последующей активацией каспазного каскада без участия белка р53.
ЛИТЕРАТУРА
1. Мушкамбаров Н. Н., Кузнецов С. Л. Молекулярная биология. — М.: «МИА», 2003. — 544 с.
2. ElsnerM., TiedgeM., Gu/cfteWceB.,etal.//Diabetologia.— 2002.-Vol. 45. — № 11. - P. 1542-1549.
3. Kroncke K. D., Fehsel K.t SommerA., et al. II Biol. Chem. Hoppe-Seyler. - 1995. Vol. 376. —№ 3-P. 179-185.
4. Nakayama Т., Hattori M., Uchida K., et al. II Biochem J. — 2004. Vol. 377. — № 2.-P. 299-307.
5. Selvakumaran M., Lin H, K., Miyashita Г., et al. II Oncogene.-1994.-Vol. 9, —№ 6.-P. 1791-1798.
6. Srinivasan K., Ramarao P. II Indian J. Med. Res. —2007. — Vol. 125. — № 3.-P. 451 —472.
7. SzkudelskiТ. II Physiol, Res, — 2001. — Vol. 50.-№ 6.-P. 536-546.
' 8, Wilson В., Mochon E, BoxerL. II Moi. Ceii. Biol. -1996. -Vol. 16. — № 10.-P. 5546-5556.
