CC BY
53
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА... 43
УДК 616-006.81-085.37-092.9:577.112.6.08
А.Н. Хочанский
ВЛИЯНИЕ ГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА НА ДИНАМИКУ РОСТА ОПУХОЛИ МЕЛАНОМЫ B16 И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ МЫШЕЙ ЛИНИИ С57BL
ФГБУ «НИИМЧ» РАМН, Москва
Контактная информация
Хочанский Андрей Николаевич, аспирант лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии адрес: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3; тел. +7(910)436-43-14 e-mail : [email protected]
Статья поступила 13.08.2013, принята к печати 01.11.2013
Резюме
В статье изложены результаты экспериментальных исследований эффективности гептилгликозида мура-милдипептида в качестве противоопухолевого иммунотропного препарата in vivo. Исследование проведено на мышах линии С57В1. Животным экспериментальных групп была трасплантирована меланома B16 в дозе 1*105 клеток. Действующее вещество вводилось в трех дозировках (1 мкг/животное, 5 мкг/животное, 25 мкг/животное) в профилактическом и терапевтическом режимах. ТРО до 74 % и УПЖ до 28 % отмечались в группе с введением действующего вещества в дозе 5 мкг/животное в терапевтическом режиме. Полученные данные указывают на целесообразность использования ГепМДП в качестве адъювантного средства для лечения злокачественных новообразований в сочетании с противоопухолевыми цитостатиками, цитокинами и таргет-ными препаратами.
Ключевые слова: МДП, С57В1, В16, агликон.
A.N. Khochanskiy
THE INFLUENCE OF HEPTIGLYCOSIDE MURAMYLPEPTIDE ON THE DYNAMICS OF THE GROWTH OF B16 TUMOR IN C57BL MICE MODEL
FSBI «Scientific Research Institute of Human Morphology» RAMS, Moscow
Abstract
This article discusses the results of experiment concerning the efficiency of Heptylglycoside of MDP as immu-notropic anti tumor drug in vivo. The experiment has been conducted using mice of C57BL line as experimental animals. The animals of experimental groups were inoculated by cells of melanoma B16 in quantity 1*105 cells per animal. The experimental compound has been entered into animals with the range of three doses (1 ^g/animal, 5 ^g/animal, 25 ^g/animal) in therapeutic and prophylactic modes. The suppression of the growth of the tumor up to 74 % in comparison with the control group has been detected in the group of experimental animals which has been subjected to treatment by experimental compound in therapeutic mode with dose of injection equal to 5 ^g/animal. The results of this experiment suggest the practicability of use of Heptylglycoside of MDP as adjuvant medical agent for support of chemotherapeutic cytostatic drugs for treatment of malicious tumors
Key words: MDP, C57B1, B16, aglycon.
Введение
Пептидогликан является одним из главных структурных компонентов клеточной стенки грампо-ложительных и грамотрицательных бактерий и служит не только в качестве каркаса стенки, но и в качестве локуса прикрепления различных сигнальных молекул. Базовой структурной единицей пептидог-ликана является дисахарадная цепь, состоящая из N ацетилглюкозамина и М-ацетилмурановой кислоты [9]. Различные дисахаридные цепи в составе пепти-догликана связаны аминокислотными цепями, состоящими из 5 аминокислот, связывающими лак-тильные группы молекул М-ацетилмурановой кислоты, входящих в разные цепи.
Минимальным компонентом пептидоклика-на, имеющим биологическую активность, является МДП, состоящий из М-ацетил мурановой кислоты и двух аминокислот. Последние исследования указывают, что основным рецептором, взаимодействующим с МДП, является N002 рецептор, То11-подобный интерцитоплазматический рецептор, синтезирующийся как в иммунокомпетентных
клетках, так и в эпителиальных клетках. Синтетические агонисты NOD2 производные МДП имитируют фрагмент пептидогликана бактериальной клетки и действуют как эффективный адъювант, который индуцирует клеточный иммунитет. Противоопухолевый эффект МДП связывается с активацией антигенпрезентирующих клеток (макрофагов и дендритных клеток). На этом основании делается вывод о перспективности применения МДП для адъювантной терапии иммуночувствительных форм злокачественных новообразований и, в частности, меланомы [5]. Иммуностимулирующее действие МДП проявляет непосредственное влияние на опухолевую прогрессию, оказывая антиметатстатиче-ское действие [3].
Основными путями поиска новых иммуно-тропных соединений на основе модификаций МДП являются модифицирование пептидного компонента и добавление гидрофильных групп к сахаридно-му кольцу. Как показали предыдущие исследования [4], гликозидные модификации МДП обладают им-мунотропной активностью по отношению к эффекторам врожденного иммунитета in vitro, что позво-
ляет рассматривать их как перспективные препараты для адьюватной терапии опухолей. Ранее нами было показано, что гептилгликозидное производное мурамилдипептида оказывает выраженное стимулирующее действие на цитотоксическую противоопухолевую активность натуральных киллеров [2].
Поэтому целью настоящего исследования было изучение противоопухолевой активности ГепМДП на мышах с привитой меланомой В16.
Материалы и методы
Исследования проведены на 160 мышах, самцах линии С57В1, массой 18-22 г. Мышей содержали на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов, со свободным доступом к корму и питьевой воде.
Действующее вещество было любезно предоставлено А.Е. Земляковым (кафедра органической и биологической химии химического факультета Таврического национального университета имени В. И. Вернадского).
Клетки меланомы В16 были трансплантированы животным подкожно в область грудной клетки в количестве 1х105 клеток, разведенных в 0,1 мл питательной среды 199. В опытах был использован 5-й пассаж опухоли in vivo.
ГепМДП вводился внутрибрюшинно в дозах 1 мкг; 5 мкг; 25 мкг на животное в 2-х режимах (профилактический и терапевтический).
1. Однократное введение за 24 ч до перевивки опухоли (профилактический режим).
2. Первое введение за 24 ч до перевивки опухоли, затем каждые 24 ч в течение 3х суток после перевивки опухоли, в дальнейшем каждые трое суток до гибели животных (терапевтический режим).
В исследование были включены следующие группы по 20 животных:
I. контрольная №1 (интактным животным вводился физиологический раствор);
II. контрольная №2 (животным с опухолью вводился физиологический раствор);
III. ГепМДП вводился в дозе 1 мкг/ животное в профилактическом режиме;
IV. ГепМДП вводился в дозе 5 мкг/ животное в профилактическом режиме;
V. ГепМДП вводился в дозе 25 мкг/ животное в профилактическом режиме;
VI. ГепМДП вводился в дозе 1 мкг/ животное в терапевтическом режиме;
VII. ГепМДП вводился в дозе 5 мкг/ животное в терапевтическом режиме;
VIII. ГепМДП вводился в дозе 25 мкг/ животное в терапевтическом режиме.
Критериями оценки действия препаратов были СПЖ, ТРО, изменение функциональной активности центральной нервной системы животных, определенное путем измерения норкового рефлекса и рефлекса вертикальной стойки животных на 10 и 20 сутки после трансплантации опухоли, визуальный анализ легких погибших животных с целью определения наличия метастазов опухоли.
ТРО было определено на основании измерения линейных размеров подкожной опухоли с вычислением объема опухоли (V). Эффективность проведенного лечения была оценена по степени ТРО, которая вычислялась по формуле:
TPO
- V
V.,
-X 100%
Выживаемость животных была вычислена как отношение количества умерших животных к живым животным, выраженное в процентах. Интегральный показатель - УПЖ.
Определение норкового рефлекса и вертикальных стоек было применено для количественного измерения функциональной активности центральной нервной системы животных.
Животные помещались на поверхность, имеющую отверстия. Попытка животного изучить отверстие расценивалась как проявление норкового рефлекса, в то время как принятие животным вертикального положения служило подтверждением рефлекса вертикальной стойки. Поведенческие реакции определялись у 6 животных, случайно выбранных из каждой группы, на протяжении 90 секунд на каждое животное на 10 и 20 сутки после перевивки опухоли.
Каждое погибшее животное подвергалось вскрытию с целью определения наличия метастазов опухоли в легких.
Все манипуляции с лабораторными животными выполнены в соответствии с Международными рекомендациями по проведению медикобиологических исследований с использованием животных [1; 6].
Статистическая обработка данных проводилась с вычислением средних арифметических и их доверительных интервалов при р < 0,05. Для оценки достоверности результатов использовался параметрический критерий статистической обработки данных по методу Стьюдента (t-test) и критерий хи-квадрат компьютерной программы «Biostat».
Результаты и обсуждение
Как следует из табл. 1, однократное введение ГепМДП за 24 ч до перевивки опухоли не вызывало статистически значимых отличий в продолжительности жизни животных опытной группы по сравнению с контрольной серией.
Достоверное УПЖ животных достигалось при многократном введении (терапевтический режим) испытуемого вещества в дозе 5 мкг/ животное (УПЖ 28 %). При введении ГепМДП в дозе 1 мкг/животное в терапевтическом режиме статистически значимых отличий от контрольной серии не выявлено. Увеличение дозы вещества до 25 мкг/животное имело тенденцию к уменьшению продолжительности жизни на 7 %.
Достоверный и дозозависимый уровень ТРО отмечался на 10 сутки после имплантации опухоли при терапевтическом режиме введения действующего вещества (табл. 2). При этом в дозах 5 мкг/животное и 25 мкг/животное максимальный эффект ТРО достигал 57 % и 74 % соответственно. При воздействии указанных доз тестируемого соединения ТРО опухоли было отмечено также на 20 сутки наблюдения.
Как следует из табл. 3, введение действующего препарата не влияло на динамику изменений поведенческих реакций животных на фоне роста опухолей и не приводило к проявлению общетоксического действия.
В ходе исследования не было выявлено статистически значимого влияния действующего вещества на метастазирование опухоли в легкие. Однако отмечалась тенденция к снижению метастази-рования меланомы В16 у животных, получавших ГепМДП в дозах 5 мкг/животное и 25 мкг/животное (табл. 4).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ГЕПТИЛГЛИКОЗИДА МУРАМИЛДИПЕПТИДА... 45
Tаблица 1
Влияние ГепМДП на СПЖ животных с привитой меланомой B16
Группа СПЖ, сут УПЖ, %
Контроль 27,3і 1,6 -
Профилактический режим
ГепМДП 1мкг /жив. 27,8і 1,3 1
ГепМДП 5 мкг /жив. 26,9 і 0,9 -1,4
ГепМДП 25 мкг /жив. 28,0 і 1,7 2
Tерапевтический режим
ГепМДП 1мкг /жив. 27.6 і 1,2 1
ГепМДП 5 мкг /жив. 38,4 і3,0 28
ГепМДП 25 мкг /жив. 25,2 і 1,1 -7
Tаблица 2
Влияние ГепМДП на TFQ и объем опухоли в условных единицах (%, TFQ)_____________________________
Группа Количество суток после трансплантации опухоли
10 15 20
Профилактический режим
Контроль 510 і 114 724і 142 3516і298
ГепМДП 1 мкг /жив. 498 і74 (2 %) 800і97 (10%) 3214і119(8%)
ГепМДП 5 мкг /жив. 542і102 (-6%) 756і178 (- 4 %) 4006 і227 (-14%)
ГепМДП 25 мкг /жив. 578і118 (-13%) 719і202 (0,6%) 3432 і347 (2 %)
Tерапевтический режим
ГепМДП 1 мкг /жив. 266і 89 (48%)* 900і 93 (-24 %) 3000і354 (14%)
ГепМДП 5 мкг /жив. 221і58( 57%)* 723 і221 (0,13%)* 1819і319 (48%)*
ГепМДП 25 мкг /жив. 128і42 (74%)* 560 і 136 (23 %) 1875і 89 (47%)*
*статистически достоверные изменения при р < 0,05
Tаблица 3
Динамика норкового и поискового рефлексов у экспериментальных животных
1 сутки 10 сутки 20 сутки
Группа Рефлекс
Норковый Поисковый Норковый Поисковый Норковый Поисковый
Интактные животные 19 і 3 8 і 4 17 і 3 8 і 2 17 і3 9 і 2
Контроль 18 і 4 6 і 2 8 і 1 3 і 1 4 і 2 1 і 2
Профилактический режим
ГепМДП 1 мкг/жив. 17 і 2 9 і 1 6 і 2 4 і 3 3 і 1 2 і 2
ГепМДП 5 мкг/жив. 18 і 1 8 і 2 7 і 3 3 і 1 2 і 2 1 і 2
ГепМДП 25 мкг/жив. 18 і 2 7 і 1 5 і 1 3 і 1 2 і 1 1 і 1
Tерапевтический режим
ГепМДП 1 мкг/жив. 16 і 2 7 і 2 7 і 1 2 і 1 4 і 2 1 і 1
ГепМДП 5 мкг/жив. 18 і 3 8 і 1 6 і 2 2 і 2 5 і 1 1 і 1
ГепМДП 25 мкг/жив. 19 і 1 6 і 2 9 і 1 5 і 2 6 і 1 3 і 3
Tаблица 4
Количество животных с метастазами в экспериментальных группах___________________________________
Группа % животных с метастазами
Контроль 35 %
Профилактический режим
ГепМДП 1 мкг/жив. 25 %
ГепМДП 5 мкг/жив. 35 %
ГепМДП 25 мкг/жив. 30%
Tерапевтический режим
ГепМДП 1 мкг/ жив. 35 %
ГепМДП 5 мкг/жив. 50%
ГепМДП 25 мкг/жив. 50%
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что ГепМДП вызывает статистически значимое и дозозависмое торможение роста меланомы В16 при введении в терапевтическом режиме и приводит к УПЖ животных с привитой меланомой равному 28 % при воздействии вещества в дозе 5 мкг/животное. Также было показано наличие влияния ГепМДП на метастазирование опухоли в легкие и отсутствие изменений в поведенческих реакций животных экспериментальных групп. Наши предыдущие исследования показали, что в опытах in vitro ГепМДП усиливает киллерную активность лимфоци-
тов периферической крови здоровых доноров [4]. Вышеизложенное позволяет предположить, что наблюдаемый противоопухолевый эффект обусловлен стимуляцией эффекторов противоопухолевого иммунитета, в частности натуральных киллеров. Эти результаты позволяют рассматривать ГепМДП наряду с другими мурамилпептидами в качестве перспективного адъювантного средства, стимулирующего врожденное звено противоопухолевого иммунитета для лечения злокачественных новообразований в сочетании с противоопухолевыми цитостатиками, цитоки-нами и таргетными препаратами [8; 9].
Литература
1. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 18 марта 1986).
2. Земляков А.Е., Калюжин О.В., Киселевский М.В. и др. Р-Диалкилметилгликозиды N-ацетилмурамоил-L-аланил-Э-изоглутамина: синтез, протективное антиинфекционное и цитотоксическое действие // Биоорганическая химия. - 2008. - Т. 34, № 1. - C. 114-20.
3. Киселевский М.В., Доненко Ф.В., Ахматова Н.К. и др. Микробные иммуномодуляторы усиливают цитотоксичность мононуклеарных лейкоцитов человека и уменьшают метастазирование Легочной карциномы Льюиса у мышей // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. -№ 6. - С. 35-40.
4. Киселевский М.В., Хочанский А.Н., Земляков А.Е., Калюжин О.В. Влияние В-гликозидов мурамилди-пептида на NK-активность мононуклеаров человека // Российский биотерапевтический журнал. -2011. - Т. 10, № 1. - С. 31.
5. Fujimura T., Yamasaki K., Hidaka T. et al. A synthetic NOD2 agonist, muramyl dipeptide (MDP)-Lys (L18) and IFN-p synergistically induce dendritic cell maturation with augmented IL-12 production and suppress melanoma growth // J. Dermatol Sci. - 2011. - 62(2). - P. 107-15.
6. International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals (Geneve, 1990).
7. Petrova E.E., Simonova M.A., Komaleva R.L. et al. GMDP augments antitumor action of the CP/TNFalpha combination in vivo // Biomed. Pharmacother. - 2010. - 64(4). - P. 240-8.
8. Li X., Yu J., Xu S. et al. Chemical conjugation of muramyl dipeptide and paclitaxel to explore the combination of immunotherapy and chemotherapy for cancer // Glycoconj J. - 2008. - 25(5). - P. 415-25.
9. Osawa C., Liu Y.J., Kobayashi K.S. Muramyl dipeptide and its derivatives: peptide adjuvant in immunological disorders and cancer therapy // Curr. Bioact. Compd. - 2011. - 7(3). - P. 180-97.
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ГепМДП - гептилгликозида мурамилдипептида
TРO - торможение роста опухоли
СПЖ - средняя продолжительность жизни
МДП - мурамилдипептид
УПЖ - увеличение продолжительности жизни
MDP - muramyl dipeptide
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
