CC BY
81
Биологическая активность гликозидных производных Ы-Ацети л му рам и л-1_-Ал ан и л-О-Изоглутамина
А.В.Караулов, О.В.Калюжин, А.Е.Земляков Московская академия им. И.М.Сеченова, Москва, Россия; НИИ Морфологии человека РАМН, Москва, Россия; Таврический национальный университет им. В.И.Вернадского,
Симферополь, Украина
Введение
N’-aцeтилмypaмил-L-aлaнил-D-изoглyтaмин (мурамил дипептвд, МДП), представляет собой компонент пеп-тидогликана группы А клеточной стенки ряда бактерий [25]. МДП является минимальным компонентом, обусловливающим иммуностимулирующий эффект полного адъюванта Фрейнда и способным заменить в его составе микобактерию туберкулеза [19]. Препятствиями к клиническому применению МДП являются его пирогенная активность, связанная как с прямым действием на центральную нервную систему, так и с индукцией выработки эндогенных пирогенов (интерлейкина-1 (ИЛ-1), фактора некроза опухоли (ФНО) и др.) [25,26], и быстрое выведение из организма вследствие высокой гидрофильное™ [18]. Для преодоления этих препятствий разработаны различные носители, такие как лшюсомы [20] и нанокапсулы [28], снижающие пирогенность мурамшшептидов, облегчающие доставку внутрь иммунокомпетентных клеток и увеличивающих время их циркуляции в оргнизме. Кроме того, было синтезировано большое количество производных МДП, многие из которых при сохранении выраженной иммунотропной активности были лишены пирогенносги [обзоры 11,16,25]. Отдельные мурамилпептиды (Ромур-твд, Мурабутвд, мурамилтрипептид-фосфатидилэтанола-мин), в том числе отечественный препарат Ликопид [5,6], нашли клиническое применение.
Хотя некоторые подходы к синтезу биологически активных мурамшшептидов описаны [25], вопрос о предпочтительных направлениях поиска высокоэффективных низкотоксичных дериватов МДП в теоретическом аспекте до конца не решен.
Целью настоящей работы было изучение биологической активности оригинальных гликозидных производных мурамилдипептида, отличающихся по физико-химическим свойствам, структуре агликона и конфигурации гликозид-ной связи, для определения предпочтительных направлений синтеза высокоэффективных иммуномодуляторов из этой химической группы и создания нового иммунотроп-ного препарата.
1. Синтез гликозидов МДП
Для введения модифицирующих компонентов в структуру N-ацетилмурамил- L-ала! мл-О-изоглутамина с целью увеличения его иммуномодулирующей активности использован гликозидный центр молекулы [2,3]. Выбор гли-козидного способа модификации с созданием О-гликози-дов продиктован рядом соображений. Во-первых, закрепляется конфигурация у С-1 и следовательно в водных растворах не образуется аномерная смесь, характерная для МДП и его производных со свободным гидроксилом. Во-вторых, упрощается методика синтеза гликопептида за счет исключения стадии постановки и удаления временной защиты аномерного гидроксила. В-третьих, обеспечивается большая устойчивость в биологических средах мурамил-пептидов с липофильными агликонами по сравнению с липофильными сложными эфирами МДП.
Нами синтезированы гликозиды, различающиеся по структуре агликона: Р-бутилгликозид-МДП (р-С4МДП), (3-гексилгликозид-МДП (0-С6МДП), Р-гептилгликозид-МДП (Р-С7МДП), (3-октилгликозцд-МДП (|3-С8МДП), (3-циклогек-силгликозид-МДП ((3-цихлогексил-МДП), Р-адамш ггилгаи-козид-МДП ((3-адаМДП), Р-фенилгликозид-МДП (Р-фенМДП), Р-фенэтилгликозвд-МДП (Р-фенэтилМДП), (3-нафтилгликозид-МДП (Р-нафгил-МДП). Кроме того, для оценки влияния конфигурац ии аномерного центра О-гли-козидов МДП на их биологическую активность были синтезированы также а-гептил-МДП (а-С7МДП), а-циклогек-сил-МДП гликозиды.
2. Иммуномодулирующая активность гликозидов мурамилдипептида в модельных тест-системах in vitro и in vivo
Задачей этого этапа исследования являлось определение в модельных тест-системах in vitro и in vivo наиболее биологически активных веществ из вышеуказанных гликозидных производных МДП. Исследование проведено в соответствии с утвержденными Министерством здравоохранения РФ методическими рекомендациями по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ [17].
Изучено влияние мурамилпептидов на спонтанную и индуцированную Т- и В-клеточными митогенами пролиферацию мышиных спленоцитов и выработку ими ИЛ-2, а также действие производных МДП на продукцию ИЛ-1
і и ФНО перитонеальными макрофагами. Поскольку ис-
пытываемые соединения незначительно отличаются по молекулярной массе, проведено их сравнительное изучение в эквиграммовых, а не в эквимолярных концентрациях. Препараты тестировались в 3 серийных 10-кратных разведениях в концентрациях 1,10 и 100 мкг/мл. В тест-систему в качестве референс-контроля вводили МДП в этих же концентрациях.
* Кроме того, в модели сепсиса, вызванного внутрибрю-
шинным введением Salmonella typhimurium, исследовано влияние препаратов на резистентность мышей к бактери-4 альной инфекции.
2.1. Действие гликозидов МДП на пролиферацию лимфоцитов
При исследовании производных МДП на пролиферацию лимфоцитов изучено влияние препаратов на спонтанное клеточное деление и их комитогенное действие с субоптимальными дозами Т- и В-клеточных митогенов: конканавалина-А (Кон-А) и липополисахарида (ЛПС) соответственно.
Субопгимальные дозы ЛПСи Кон-А для комитогенно-го теста были подобраны эмпирически таким образом, чтобы индекс пролиферации (ИП) составлял 30-50% от показателей клеточного деления, вызванного оптимальными дозами митогенов. В результате предварительной серии экспериментов и для ЛПС, и для Кон-А выбрана доза 1 мкг/мл.
Таблица 1. Влияние производных МДП (10 мкг/мл) на спонтанную и стимулированную субоптимальными
дозами Кон-А и ЛПС пролиферацию спленоцитов мышей C57BL/6
Производные МДП (10 мкг/мл) Спонтанная пролиферация Кон-А (1 мкг/мл) ЛПС (1 мкг/мл)
Контроль 1±0,2 11,8±1,1 5,3±0,6
МДП 3,1±0,3* 19,1±1,2* 9,9±1,1*
в-С4МДП 3,2±0,4* 19,3±1,8* 10,5±1,3*
в-С6МДП 3,8±0,4* 20,5±2,9* 11,0±1,0*
в-С7МДП 4,2±0,3*t 25,2±l,7*t 13,4±0,9*f
в-С8МДП 4,3±0,4*f 24,8±2,0*f 13,6±l,2*t
а-С7МДП l,8±0,2*t 13,0±l,8t 7,2±1,1|
в-АдаМДП 3,9±0,2*f 25,0±2,2*t 14,l±l,3*t
в-Циклогексил-МДП 2,9±0,4* 19,9±2,6* 10,2±1,0*
а-Циклогексил-МДП l,9±0,2*t 13,8±l,7t 6,5±0,9t
в-ФенМДП 4,0±0,3*t 23,7±2,l*t 13,0±l,5*t
в -ФенэтилМД П 3,0±0,3* 20,6±2,4* 8,9±1,0*
в-НафтилМДП 2,6±0,4* 19,8=4.8* 9,7±1,2*
В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. Цифры в таблице представляют средние арифметические индексов пролиферации (п-3) ± стандартное отклонение.
* -Достоверность различия с контролем - р <0,05.
/■ -Достоверность различия с МДП (референс-конт-ролем) -р<0,05.
Все испытываемые препараты в широком диапазоне доз стимулировали спонтанную пролиферацию лимфоцитов in vitro. Для большинства препаратов оптимальной для стимуляции клеточного деления в культуральной среде была концентрацией 10 мкг/мл (табл. 1). Обнаружено, что а-гликозиды МДП уступали по активности как Р-гли-козидным аналогам, так и немодифицированному МДП. Среди Р-гликозидов наибольшую активность проявили препараты Р-С7МДП, Р-С8МДП, Р-адаМДП, Р-фенМДП. В большинстве экспериментов они превышали по активности МДП. Эти же дериваты МДП обладали наибольшей комитогенной активностью с субоптимальными дозами Кон-А и ЛПС. Другие Р-гликозиды вызывали сходную с МДП активацию митоген-ш щуцированного клеточного деления. а-Гликозиды МДП во всех дозах не оказали существенного влияния на стимулированную Т- и В-клеточными митогенами пролиферацию лимфоцитов. Д ля обоих исследованных а-гликозвдов можно отметить лишь тенденцию к активации пролиферации в концентрации 10 мкг/мл.
2.2. Действие мурамилпептидов на продукцию интерлейкина-2
Важным показателем функционального состояния Т-лимфоцитов является их цитокин-продуцирующая активность. ИЛ-2 представляет собой один из ключевых цито-кинов, вырабатываемых Т-лимфоцитами, преимущественно CD4+ Thl. ИЛ-2 является важнейшим фактором пролиферации всех Т-клеток, активирует дифференциров-куТЫ иТ-киллеров, стимулирует деление и функцию ЕК, стимулирует синтез В-клетками IgM, IgG и IgA.
Учитывая центральную роль ИЛ-2 во многих гомеостатических и защитных иммунных реакциях, представлялось интересным изучить влияние исследуемых дериватов МДП на продукцию указанного лимфокина.
Нами исследована способность мурамилпептидов индуцировать продукцию ИЛ-2 (точнее, ИЛ-2-подобных факторов) мышиными спленоцитами, а также действие этих веществ на выработку ИЛ-2 спленоцитами, стимулированными субоптимальной дозой поликлонального активатора Т-клеток-Кон-А (1 мкг/мл).
Содержание ИЛ-2 в супернатанте стимулированных спленоцитов определяли по способности усиливать пролиферацию индикаторных клеток, в качестве которых использовали либо 96-часовые Кон-А-бласты, либо клетки ИЛ-2-зависимой линии CTLL [17].
Из таблицы 2 видно, что все тестируемые производные МДП в той или иной степени стимулировали продукцию ИЛ-2-подобных факторов, индуцированную Кон-А. Наибольшую активность в этом плане проявили Р-гликозиды с алифатическими (Р-С4МДП, Р-С6МДП, Р-С7МДП, Р-С8МДП), карбоциклическими (Р-циклогексилМДП, (3-адаМДП) и фенольными (фенМДП и Р-фенэтилМДП) аг-ликонами. Эти соединения превосходили по стимулирующему влиянию на продукцию ИЛ-2 немодифицирован-ный МДП. Другие Р-гликозиды МДП достоверно не отличались по активности от референс-контроля (МДП), хотя индексы пролиферации клеток CTLL и Кон-А-бластов в ответ на образцы ИЛ-2, индуцированного комбинацией этих Р-гликозидов и Кон-А, в большинстве случаев были выше, чем при использовании МДП+Кон-А.
>-
U
а-Гликозиды обладали достоверно меньшей способностью по стимуляции ИЛ-2, чем немодифицированный МДП
В следующей серии экспериментов мы изучили способность дериватов МДП индуцировать продукцию ИЛ-2 неактивированными мышиными спленоцитами.
Таблица 2. Влияние гликозидов МДП на продукцию ИЛ-2 спленоцитами мышей С57В1./6, стимулированными Кон-А (1 мкг/мл)
(ИЛ-2 определяли в тест-системе с СТЩ
Производные МДП Концентрация производных МДП
1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл
Контроль 12,7±1,5 - -
МДП 18,1±2,2* 22,8±2,8* 19,5±2,0*
В-С4МДП 17,6±2,0* 28,9± 1,8*| 24,9±2,3*t
в-С6МДП 21,8±1,8* 29,7±2,1*1' 25,6±3,1*|
В-С7МДП 20,9±1,8* 30,3±3,3*| 26,4±3,2*|
в-С8МДП 22,1±2,5* 29,5±2,7*| 25,5±2,5*1'
а-С7МДП 14,7±1,7 16,9±2,1*| 18,1*2,6*
в-АдаМДП 21,9±1,8* 31,1±3,9*| 26,4±2,9*|
в-Циклогексил-МДП 22,3±2,1* 29,8±2,8*| 24,7±3,3*
а-Циклогексил-МДП 15,0±1,6 18,4±2,5* 16,9±2,7
в-ФенМДП 20,8±2,2* 29,9±3,3*Т 25,7±2,4*|
в-ФенэтилМДП 19,7±2,0* 30,7±3,5*| 23,9±1,5^
в-НафтилМДП 16,9±1,6* 25,3±3,7* 19,1±2,4*
В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. Цифры в таблице представляют средние арифметические индексов пролиферации клеток линии СТЬЬ(п-З) ±стандаргшюеотклонение.
* - Достоверностьразличия с контролем -р<0,05.
-Достоверностьразличия с МДП (референс-конт-ролем) -р<0,05.
24-часовая предобработка спленоцитов различными мурамилпептидами по-разному влияла на выработку ИЛ-
2. В тест-системах и с клетками СТЬЬ (табл. 3), и с Кон-А-бластами показано, что немодифицированный МДП во всех дозах вызывает лишь статистически недостоверную тенденцию к индукции синтеза ИЛ-2. Сходную тенденцию проявляли и а-гликозиды МДП в высоких концентрациях (100 мкг/мл). В более низких концентрациях (1 и 10мкг/мл) а-гликозиды не изменяли фоновой продукции ИЛ-2 неактивированными лимфоцитами.
Что касается (3-гликозидов, то (3-С6МДП, |3-С7МДП, (3-С8МДП, (3-циклогексилМДП, (3-адаМДП и (3-фенМДП в большинстве случаев вызывали выработку ИЛ-2, достоверно превышавшую фоновую секрецию этого лимфо-кина в контроле. Активность ИЛ-2 в образцах, индуцированных (3-фенэтилМДП, была выше контроля только в тест-системе с клетками СТ1Х (табл. 3). {3-С4МДП и |3-на-фтилМДП проявляли лишь тенденцию к стимуляции продукции ИЛ-2.
Сравнение эффектов а-гликозидов и (3-гликозвдов с ре-ференс-контролем в тест-системе с Кон-А-бластами показало, что (3-С7МДПв концентрации 10мкг/мл, |3-С8МДП в концентрации 100 мкг/мл, (3-адаМДП (1 мкг/мл) статистически значимо превышали действие немодифицирован-ного МДП (данные не представлены).
При тестировании супернатантов спленоцитов на содержание ИЛ-2 с использованием клеток СТТХ выявлено, что достоверно сильнее, чем МДП, индуцировали продукцию ИЛ-2 следующие гликозиды: Р-С6МДП(10и 100 мкг/мл), (3-С7МДП(1,10и 100мкг/мл), (3-С8МДП(1 и 100мкг/мл),(3-адаМДП (10 и 100 мкг/мл) и (3-фенМДП (100 мкг/мл).
Таким образом, продемонстрирована способность ряда дериватов МДП индуцировать и усиливать продукцию ИЛ-2 лимфоцитами. Это в первую очередь касается (3-гликозвдов МДП (Р-С6МДП, (3-С7МДП, |3-С8МДП, (3-цик-логексилМДП, Р-адаМДП и (3-фенМДП), которые превосходили по активности немодифицированный МДП. Вышесказанное говорит об увеличении биологической активности МДП при его стуктурной модификации с созданием (3-гликозвдов. В противоположность этому, а-глико-зидирование вело к снижению активности МДП.
Полученные данные коррелируют с результатами оценки влияния этих производных МДП на пролиферативную активность лимфоцитов. В этом нет ничего удивительного. Известно, что в процессе пролиферативного ответа лимфоцитов на митогены после стимулирующего сигнала через определенный интервал времени происходит выработка и рецепция ИЛ-2. Последние события играют ключевую роль при вовлечении лимфоцитов в пролиферативный цикл.
Конечно, существуют и другие ростовые факторы и сигналы, определяющие митоген-индуцированную пролиферацию. Тем не менее, можно заключить, что стимуляция производными МДП как спонтанной, так и индуцированной митогенами пролиферации, в значительной степени связана с усилением этими веществами продукции ИЛ-21Ъ1-лимфоцитами.
Таблица 3. Оценка способности мурамилпептидов индуцировать выработку ИЛ-2 спленоцитами мышей С57В1./6 (ИЛ-2 определяли в тест-системе с СТТ1.)
Производные МДП Концентрация производных МДП
1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл
Контроль 5,1±1,1 - -
МДП 6,3±0,8 8,4±1,6* 6,9±1,0
в-С4МДП 6,8±1,2 10,5±1,5* 7,0±1,3
в-С6МДП 8,9±1,5* 12.&Ы, 2^ 10,3±1,1*+
в-С7МДП 9,3± 1,1*1 12,7±1,0*| 10,6±1,4*Т
в-С8МДП 9,1±1,3*| 13,1±1,6* 10,1±1,3*1
а-С7МДП 5,3±0,8 5,6±0,9 6,3±1,2
в-АдаМДП 7,6±0,8* 13,5±2,1*| 9,9±1,2*|
в-Циклогексил-МДП 7,9±1,1* 11,3±2,0* 7,5±0,8*
а-Циклогексил-МДП 4,9±0,7 4,7±1,0| 5,9±1,1
в-ФенМДП 8,2±0,9* 9,6±1,1* 10,3±1,2*|
в-ФенэтилМДП 6,4±0,8 8,5±0,9* 7,6±0,8*
в-НафтилМДП 7,1±1,1 6,8±1,0
В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. Цифры в таблице представляют средние арифметические индексов пролиферации клеток линии СТЬЬ (п=3) ± стандартное отклонение.
* -Достоверность различия с контролем -р<0,05.
1- -Достоверность различия с МДП (референс-конт-ролем) -р<0,05.
Очевидно, индукция и стимуляция мурамилпептида-ми продукции ИЛ-2 в использованных нами тест-системах связаны как с прямым влиянием производных МДП на клетки-продуценты (преимущественно Th 1 -лимфоциты), так и опосредованным действием на них через макрофаги, продукты которых (в частности, ИЛ-1) стимулируют не только продукцию ИЛ-2, но и рецепцию этого цитокина лимфоцитами.
2.3. Действие мурамилпептидов на продукцию макрофагами ФНО и ИЛ-1
Одной из важных функций макрофагов является продукция цигокииов, инициирующих и регулирующих многие биологические процессы в организме, в том числе защитные реакции на внедрение инфекционных агентов и опухолевую трансформацию клеток.
Ключевыми и, вероятно, наиболее плейотропными цитокинами, секретируемыми моноцитами/макрофагами, являются ИЛ-1 иФНО-а[14].
В связи с этим, мы исследовали способность гликози-дов МДП регулировать продукцию этих монокинов перитонеальными макрофагами in vitro. Так как производные МДП действуют синергично с ЛПС по индукции продукции ИЛ-1 и ФНО, в раде экспериментов в культуральную среду, помимо тестируемых мурамилпептидов, добавляли ЛПС в субоптимальной концентрации (20 нг/мл). Так же, как и на предьщущих этапах исследования, в качестве референс-контроля использовался МДП. Изучение влияния мурамилпептидов на продукцию монокинов проводили по методу [27]. ИЛ-1 тестировали с использованием в качестве индикаторных клеток мышиных тимоцитов [29], ФНО - по лизизу ФНО-чувсгвительных клеток L929 [21].
Индукторами выработки ИЛ-1 являлись все испытываемые препараты в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/мл (табл. 4). Наибольшей активностью в индукции выработки указанного монокина обладали (3-алкилглико-зиды МДП (Р-С6МДП Р-С7МДП, Р-С8МДП) и (3-циклогек-сил-МДП. В большинстве случаев они превышали МДП по стимулирующему влиянию на продукцию этого цитокина. Р-АдаМДП проявил более высокую в сравнении с МДП активность только в концентрации 1 мкг/мл, а Р-фе-н этил МДП - в концентрации 100 мкг/мл. Другие Р-глико-зиды существенно не отличались по активности от референс-контроля, а а-гликозвды были менее активными.
Результаты изучения сочетанного действия мурамилпептидов и ЛПС в субоптимальной концентрации на продукцию ИЛ-1 представлены в таблице 5. Максимальную биологическую активность все дериваты МДП проявили в концентрации 10 мкг/мл. Увеличение концентрации до 100 мкг вело к некоторому снижению стимулирующего влияния на выработку ИЛ-1. Также как и в предыдущем случае, высокую активность проявили Р-алкилгликозиды МДП (Р-С4МДП, р-с6мдп, Р-С7МДП, Р-С8МДП), Р-цик-логексил-МДП и Р-адаМДП. Кроме того, Р-фенМДП превышал эффект немодифицированного МДП. Препараты (3-фенэтилМДП и Р-нафтилМДП стимулировали продукцию монокина сильнее референс-контроля только в высокой концентрации (100 мкг/мл). а-Гликозиды и в этой модельной тест-системе уступали по активности МДП.
Таблица 4. Действие производных МДП на продукцию ИЛ-1 мышиными (С57В176) перитонеальными макрофагами.
Производные МДП Концентрация производных МДП
1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл
Контроль 2,3±0,6 - -
МДП 6,7±0,9* 8,4±1,0* 3,8±0,5*
в-С4МДП 9,2±1,4* 10,5±1,8« 5,0±0,6*
в-С6МДП 11,1±1,2*| ll,6±l,l*t 6,5±l,2*t
в-С,МДП 9,9±l,7*f 12,4±l,2*t 6,9±l,0*t
в-С8МДП 10,6±l,9*t ll,3±l,4*t 4,3±0,7*
а-С7МДП 3,4±0,8| 5,4±],1*| 3,3±0,8
в-АдаМДП 10,1±1,0*| 9,4±0,9* 2,9±0,9
в -Циклогексил-МДП 10,9±0,9»t 12,3±l,4*f 3,7±1,1
а-Циклогексил-МДП 5,2±1,1* 5,3±0,9*t 4,1 ±0,7*
в-ФенМДП 6,8±0,8* 7,6±1,8* 5,2±0,8*
в-ФенэтилМДП 7,3±1,4* 9,5±1,6* 6,l±l,2*t
в-НафтилМДП 6,9±0,6* 6,8±1,4* 4,8±0,7*
В таблиц представлены данные 3-х независимых экспериментов. Цифры в таблице представляют средние арифметические индексов пролиферации тимоцитов на образцыИЛ-1 (п=3) ±стандартное отклонение.
* -Достоверностьразличия с контролем -р<0,05. t -Достоверностьразличия с МДП (референс-конт-ролем) -р<0,05.
Таблица 5. Действие производных МДП на продукцию ИЛ-1 мышиными (С57В1_/6) перитонеальными макрофагами в сочетании с субоптимальной дозой липополисахарида (20 нг/мл).
Производные МДП Концентрация производных МДП
1 мкг/мл 10 мкг/мл 100 мкг/мл
Контроль (ЛПС 20 нг/мл) 3,1±0,6 - -
МДП 8,8±1,1* 11,3±1,4* 4,9±0,7*
В-С4МДП 12,3±1,5*| 15,3±l,7*f 10,l±0,9*j
в-С6МДП 1 l,9±0,9*t 15,7±l,5*t 8,2±l,l*f
В-С7МДП 12,8±l,4*t 17,4±2,l*f 9,8±l,3*f
в-С8МДП 13,2±l,6*f 17,2±l,9*f 10,2±l,9*t
а-СуМДП 4,6±0,9f 7,3±l,2*t 6,9±1,2*
в-АдаМДП 14,0±l,5*f 18,l±2,3*t 8,7±0,8*t
в -Циклогексил-МДП 12,4±l,l*t 16,3±l,8*f 6,7±1,4*
а-Цикпогексил-МДП 6,4±l,0*t 8,9±1,2* 4,1±0,7*
в-ФенМДП 11,8±1,7* 15,9±l,9*t 9,5±l,7*f
в-ФенэтипМДП 7,9±1,5* 11,4±1,0* 9,7± 1,6*|
в-НафтилМДП 8,1 ±0,9* 9,8±2,1 * 8,l±l,4*f
В таблице представлены данные 3-х независимых экспериментов. Цифры в таблице представляют средние арифметические индексов пролиферации тимоцитов на образцыИЛ-1 (п-3) ± стандартное отклонение.
*-Достоверностьразличия с контролем -р<0,05. t -Достоверность различия с МДП (референс-конт-ролем) -р<0,05.
В нашей работе исследование продукции ФНО под влиянием мурамилпептидов существенно не изменило
представления об их макрофаг-активирующем действии, полученного в результате изучения влияния этих веществ на выработку ИЛ-1.
Самыми мощными стимуляторами секреции ФНО были Р-С7МДП, |3-С8МДП, (3-адаМДП и Р-фенМДП, которые во многих случаях оказывались достоверно (р<0,05) более эффективными, чем немодифицированный МДП. В сочетании с ЛПС, кроме вышеуказанных препаратов, действие комбинации МДП+ЛПС превышали (3-С6МДП (1 мкг/мл) и b-циклогексил-МДП (10 мкг/мл).
Р-С7МДП и а-циклогексилМДП в отдельности и в сочетании с ЛПС уступали по биологической активности референс-контролю (МДП или МДП+ЛПС соответственно).
Таким образом, проведенные нами испытания ряда оригинальных гликозидных аналогов МДП позволили сделать следующий вывод: в модельных тест-системах in vitro, характеризующих функциональную активность Т- и В-лим-фоцитов, а также макрофагов, а-гликозиды значительно уступали по активности и немодифицированному МДП, и (3-гликозидным аналогам. Последние, в частности (3-С6МДП, (3-С7МДП, Р-С8МДП, Р-циклогексилМДП, Р-адаМДП и Р-фенМДП, превышали по стимулирующему влиянию на иммунокомпегентные клетки МДП, который использовался в качестве референс-контроля во всех тест-системах in vitro.
2.4. Влияние гликозидов мурамилдипептида на резистентность к бактериальной инфекции
Для завершения выбора наиболее перспективных иммуномодуляторов из группы гликозидных производных МДП с целью их дальнейшего углубленного исследования мы изучили влияние этих веществ на резистентность мышей к бактериальной инфекции.
Ближайшие «соседи« вещества Р-С7МДП по количеству атомов углерода в алифатическом агликоне (Р-С6МДП и Р-С8МДП) в сравнении с ним не имели преимуществ в оказании биологических эффектов в моделях in vitro. Отличаясь от Р-С7МДП только одним атомом углерода в линейной углеводородной цепи агликона, они облад ают сходными физико-химическими свойствами и, очевидно, существенно не отличаются по биологической активности от Р-С7МДП. В связи с этим, препараты Р-С6МДП и Р-С8МДП были исключены из дальнейшего скрининга на этапе исследований in vivo.
Для оценки влияния мурамилпептидов на резистентность к бактериальной инфекции использовали модель с внутрибрюшинным заражением мышей F, (СВА х C57B1V
6) штаммом S. typhimurium № 415 в дозе, вызывающей 100% гибель животных в контроле. Эта доза подбиралась эмпирически в предварительной серии экспериментов и составляла 100 LD^.
Однократное внутрибрюшинное введение различных гликозидов МДП за 24 часа до заражения культурой
S. typhimurium по-разному влияло на выживаемость экспериментальных животных.
В той или иной степени все производные МДП оказывали профилактический эффект, дозозависимо снижая летальность инфицированных мышей. Наименее активными оказались а-С7МДП и а-циклогексил-МДП. Не одна
Таблица 6. Действие производных МДП на резистентность к внутрибрюшинному заражению S. typhimurium в дозе 100 LD^
Препарат Доза (мкг/мышь) Выживаем ость* (%) EDse (мг/кг)
1 2 3 4
Контроль - 0 -
МДП (референс-контроль) 200 73,3±5,8 3,93
20 53,3±5,8
2 33,3±5,8
р-с4мдп 200 76,7±5,8 5,01
20 36,7±5,8f
2 16,7*15,3
р-с,мдп 200 86,7±11,5 2,57
20 66,7±5,8t
2 56,7±5,8t
а-С7МДП 200 43,3±20,8 5,33
20 36,7±5,8t
2 30±10
Р-АдаМДП 200 83,3±5,8 2,39
20 76,7±5,8f
2 63,3±5,8t
Р-Циклогексил-МДП 200 76,7±5,8 3,46
20 60±10
2 36,7±5,8
а-Циклогексил-МДП 200 56,7±5,8f 5,58
20 46,7±5,8
2 6,7±5,8t
0-ФенМДП 200 83,3±5,8 2,65
20 66,7±15,3
2 56,7±20,8
Р-ФенэтилМДП 200 73,3±11,5 3,52
20 66,7±11,5
2 26,7±5,8
р-НафтилМДП 200 76,7±5,8 3,46
20 60±10
2 36,7±5,8
В таблице представлены типичные данные трех независимых экспериментов.
* - Цифры в указанной колонке таблицы представляют средние арифметические выживаемости животных (п-3) ± стандартное отклонение.
f -Достоверность различия с МДП (референс-конт-ролем) в соответсвующей дозе -р<0,05.
из использованных доз этих двух препаратов не обеспечивала 60% выживание животаых - критического показателя, позволяющего рассматривать испытываемое вещество как иммунотропное средство в соответсвии с методическими рекомендациями по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ [17]. МДП и его Р-гликозидные аналоги по крайней мере в одной из примененных доз превышали 60% рубеж выживаемости. Препараты Р-С7МДП и Р-адаМДП в дозах 2 и 20 мкг/мышь оказались более эффективными в сравнении с МДП в тех же дозах (р<0,05), тогда как Р-С4МД П (20 мкг/мышь) усгу-
пал ему по способности стимулировать резистентность животных к бактериальной инфекции. (3-ФенМДП во всех ' дозах вызывал большее в процентном отношении, чем
МДП, выживание инфицированных мышей, но различия с референс-контролем в этих случаях были статистически не достоверными. Другие препараты по своей активности существенно не отличались от немодифицированного гликопегтщца.
Этот экспериментальный блок подтвердил полученные в модельных тест-системах in vitro данные, касающиеся существенных отличий биологической активности а-и (3-гликозвдных аномеров. Присоединение агликонов в (3-' положении вело к увеличению активности МДП, так как
а-гликозидирование снижало ее. Вероятно, активной формой мурамилдипептида является соединения с (3-конфи-« гурацией аномерного гидроксила, что объясняет мень-
шую по сравнению с (3-гликозидами МДП иммуностимулирующую активность свободного мурамилдипептида, который в водных растворах находится в виде смеси а- и (3-гликозидных аномеров.
Среди (3-гликозидов наиболее перспективными представляются (3-С?МДП, (3-адаМДП и (3-фенМДП.
Ранее нами показано, что (3-С?МДП в широком диапазоне доз стимулировал пролиферацию в смешанной культуре лимфоцитов, усиливал цитотоксическую активность естественных киллеров по отношению к опухолевой линии УАС-1, активировал генерацию аплоспецифических цитоксических Т-лимфоцитов, стимулировал продукцию ИЛ-1 и ФНО перитонеальными макрофагами [12,23]. Практически во всех тест-системах его эффекты превышали действие немодифицированного МДП и ряда его производных.
Исходя из вышесказанного, именно (3-СуМДП (глиму-рид) был выбран для разностороннего изучения, направленного на определение перспектив и возможности его клинического применения.
3. Распределение [14С]-меченого
[З-гептилгликозид-МДП по органам и тканям
после внутривенного и перорального * введения
Исследование распределения меченого гликопептида
по органам и тканям проводили по методу [18,22].
Через 10 минут после внутривенной инъекции смеси
немеченого и [|4С]-меченого |3-С7МДП в дозе 100 мкг наи-
большая концентрация препарата наблюдалась в крови.
Существенная радиоактивность была выявлена в печени,
почках и легких. Через 30-60 минут после внутривенного введения гликопептида концентрация препарата в крови, а
затем и в других органах начинала снижаться одновременно с подъемом концентрации в моче. К четвертому часу определенная часть препарата задерживалось в печени, несколько меньше в почках. В других органах отмечались лишь следовые количества вещества. Через 24 часа содержание препарата в организме не превышало 2% от общей радиоактивности.
Динамика изменения концентраций (3-С,МДП во внутренних органах и биологических жидкостях говорит о преимущественном выведении препарата из организма через почки с мочой. Это совпадает с литературными дан-
ными по изучению фармакокинетики мурамилпептидов [18,22]. Сравнение этих данных с результатами, полученными нами, показывает, что меченый глимурид ((3-С7МДП) существенно длительнее задерживался в тканях, чем его гидрофильные аналоги.
Изучение динамики распределения [14С]-|3-С7МДП по организму после приема per os выявило существенные различия от таковой после внутривенной инъекции.
В течение первых 30 минут после перорального применения глимурида значительное количество меченого соединения обнаруживалось только в желудке и кишечнике. Через 1 час радиоактивность в желудочно-кишеч-ном тракте начинала существенно снижаться и одновременно повышаться в других органах. Наибольшая концентрация препарата вне желудка и кишечника отмечена в печени на второй час после приема глимурида. Через 24 часа в организме оставалось около 10% от введенной радиоактивной метки.
В целом надо отметить большее время циркуляции препарата в организме при пероральном приеме глимурида в сравнении с внутривенным введением, что связано с постепенным всасыванием соединения в желудочно-кишечном тракте. Это объясняет и отсутствие резких пиковых концентраций препарата в крови и органах с последующим спадом, что отмечалось при внутривенном введении глимурида.
Пероральный путь введения препарата и соответствующая ему динамика распределения вещества в организме выглядят благоприятными для оказания иммуномодулирующих эффектов, а отсутствие высоких пиковых концентраций в системной циркуляции позволяет предположить отсутствие выраженного пирогенного действия, вызванного быстрым поступлением в кровоток больших доз мурамилпептида.
4. Влияние (З-гептилгликозид-МДП на клеточный и гуморальный иммунитет in vivo
Этот блок работы, направленный на оценку влияния препарата на клеточные и гуморальные реакции у мышей, обладающих разной генетически детерминированной иммунореактивностью, проводили по методу [17].
4.1. Действие [З-гептилгликозид-МДП на гумораль- I ный иммунитет
Влияние (З-гептилгликозид-МДП на гуморальное звено иммунной системы оценивалось по его действию на образование антител (агглютининов) к эритроцитам барана у мышей двух оппозитно реагирующих линий (СВ А и C57BL/6). При этом изучали его влияние как на индуктивную, так и на продуктивную фазы этого ответа. В первом случае (препарат вводили одновременно с антигеном) уже на 4 сутки отмечено повышение уровня антител и в контроле, и во всех тест-группах мышей [7]. У животных высо-кореагирующей линии СВ А, получавших (3-гептилглико-зид-МДП, на 4-7-е сутки существенных различий в сывороточной концентрации антител в сравнении с контролем не отмечено. На 14-йдень титры антител былидосговерно ниже, чем в контрольной группе животных. Однако, повышенный уровень антител в этой группе сохранялся до 21-х суток исследования, в то время как у мышей конт-
рольной группы, иммунизированных эритроцитами барана, отмечено в этот срок резкое падение титров антител.
У низкореагирующих мышей С57ВЬ/6 отмечено статистически достоверное повышение концентрации агглютининов в группе мышей, получавших мурамилпептид в дозах 200 мкг/мышь (4 и 21 сутки) и 20 мкг/мышь (7 сутки). В других случаях титры антител были также в целом выше, чем контрольные значения, однако из-за индивидуальных вариаций эти различия были статистически не значимыми.
Следует отметить, что препарат у высокочувствительной к эритроцитам барана линии мышей обусловливал во всех случаях более длительное сохранение повышенного уровня антител, в то время как у мышей низкореаги-рующей линии отмечено существенное повышение уровня антител от введения высоких доз (20 и 200 мкг/мышь) (3-гептилгликозид-МДП. Это повышение сохранялось в течение 21 суток только после введения 200 мкг препарата.
При оценке действия (3-гептилгликозид-МДП на продуктивную фазу иммунного ответа (препарат вводили на 3-и сутки после иммунизации) обнаружены в целом сходные с вышеописанными закономерности изменения продукции гемагглютининов как у выскореагирующих мышей, так и у низкоотвечающих на эритроциты барана (табл.
7). Однако, имелись и некоторые отличия. В этом случае была заметна явная тенденция к снижению титра антител на 4-7-е сутки у высокоотвечающих животных, а у оппо-зитно реагирующих мышей препарат в более широком диапозоне доз усиливал антителообразование на протяжении всего эксперимента.
Таблица 7. Влияние 3-гептилгликозид-МДП на продуктивную фазу антителообразования
Линия Мышей Доза препарата (мкг) Титр антител
Сроки взятия крови
4 сутки 7 сутки 14 сутки 21 сутки
СВА 200 77±29 102+35 179+70* 38114*
20 102+35 90+35 5 54±57* 90+35*
0,2 141+70 115+27 307+114 58114*
контроль 170186 170186 4261170 1610
норма 16±0
С57ВІ76 200 141±70* 154+57* 115129* 179170*
20 90+35 179+70* 102135* 102135*
0,2 77±29 90±35 115129* 83+43
контроль 48±22 48±22 64+0 6410
норма 4±0
Каждое значение в таблице представляют собой среднее арифметическое (п-5) ± стандартное отклонение. Показаны результаты 1 типичного из 3 независимых экспериментов.
* -Достоверность различия с контролем (р<0,05).
Таким образом, Р-гетилгликозид-МДП оказывал влияние и на индуктивную, и на продуктивную фазу антителообразования. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что у мышей высокореагирующей на эритроциты барана линии СВА препарат преимущественно
снижал титры антител в течение первых 14 дней, однако способствовал сохранению повышенного уровня продукции гемагглютининов до 21 -го дня после иммунизации эритроцитами барана. У низкоотвечающих мышей С57В176 Р-гептилгликозид-МДП стимулировал продукцию антител в течение всего эксперимента. Изменение антителобра-зования в разные сроки после иммунизации (с 4-го по 21 -й день) свидетельствует о способности препарата регулировать продукцию как 1§М, так и ^О, хотя действие на выработку последнего, очевидно, более выражено.
4.2. Действие Р-гептилгликозид-мурамилдипептида на проявление реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ)
О влиянии Р-гептилгликозид-МДП на клеточное звено иммунитета судили по действию на реакцию ГЗТ. Так же, как и при оценке влияния препарата на гуморальное звено, исследование проводили на мышах оппозитно реагирующих на эритроциты барана линий СВА и С57В176 [7]. При этом оценивали действие препарата на стадии сенсибилизации и разрешения. С этой цепью Р-гептилгикозид-МДП в дозах 0,2,20 и 200 мкг/мышь вводили внутривенно одновременно с сенсибилизирующей или с разрешающей дозами антигена. При введении мурамилпептида одновременно в сенсибилизирующей дозой эритроцитов барана у мышей линии СВА происходило уменьшение выраженности реакции ГЗТ в сравнении с контролем (рис. 1). Максимальный угнетающий эффект отмечен у препарата в дозе 20 мкг/мышь. Наоборот, у мышей линии С57В176 наблюдалось увеличение индекса реакции при использовании Р-гептилгикозид-МДП в широком диапозоне доз (рис. 2). Можно заключить, что у двух оппозитно реагирующих линий мышей препарат оказывал разнонаправленное влияние на процесс образования клона антиген-спе-цифических Т-лимфоцитов. Причем характер этого влияния определялся генетически обусловленной иммуноре-акгивносгью животных. У низкореагирующих мышей гли-мурид обусловливает иммуностимулирующий эффект на эту стадию Т-клеточного ответа, а его введение высокореагирующей линии мышей оказывает супрессирующее действие.
Внутривенная инъекция разных доз гликопептида одновременно с разрешающей дозой антигена также влияла на выраженность реакции ГЗТ (данные не представлены). У низкореагирующих мышей отмечено усиление проявления реакции мурамилпептидом во всех использованных дозах. У высокоотвечающих животных индекс реакции ГЗТ снижался. Указанные эффекты препарата, вероятно, обусловлены изменением способности антиген-специфических Т-лимфоцитов при встрече с антигеном (эритроцитами барана) продуцировать провоспалительные цигокины.
В целом, введение Р-гептилгикозид-МДП в стадию разрешения давало сходный эффект на реакцию ГЗТ с его введением в фазу сенсибилизации за исключением одного отличия: у мышей высореагирующей линии СВА препарат угнетал реакцию в дозах 0,2 и 20 мкг при внутривенной инъекции одновременно с сенсибилизирующей дозой эритроцитов барана, и в дозах 20 и 200 мкг - при введении в стадию разрешения.
Таким образом, продемонстрирована способность препарата оказывать на клеточный и гуморальный иммунитет разнонаправленные дозозависимые эффекты, определяющиеся исходной иммунореактивносгью организма. Характер этих эффектов говорит о том, что глимурид правильнее классифицировать не как иммуностимулятор в узком понимании этого термина, а как иммуномодулятор.
5. Влияние перорального и внутривенного введения Р-гептилгликозид-мурамилдипептида на выживаемость животных с экспериментальной сальмонеллезмой септикотохсемией
Выше показана высокая эффективность глимурида (Р-С7МДП) и ряда других гликозидов МДП в стимуляции неспецифической резистентности в модели сепсиса, вызван-
• - ного внутрибрюшинным заражением культурой S.
typhimurium. В указанной модели исследуемые препараты вводились также интраперитонеально за 24 часа до заражения. Вероятно, продемонстрированный нами выраженный профилактический эффект препаратов связан не только с резорбтивным эффектом и с системной активацией звеньев неспецифической резистентности, но и в значительной степени с локальной стимуляцией местных защитных механизмов в брюшной полости. С нашей точки зрения, пероральный и внутривенный способы применения Р-С7МДП выглядят как наиболее реальные и обоснованные пути введения в случае его клинического использования для системной стимуляции противоинфек-ционного иммунитета. Поэтому представлялось целесообразным исследовать влияние перорального и внутривенного введения глимурида на неспецифическую резистентность организма в модели септикотоксемии, вызванной внутрибрюшинным введением Salmonella typhi [8].
Культуру S. typhi (Ту2 4446), суспендированную в 5% муцине, в дозе, равной 100 LD^, вводили беспородным белым мышам внутрибрюшинно через 24 часа после применения Р-С7МДП в/в или per os в дозах: 0,2; 2; 20 и 200 мкг/мышь.
Обращает на себя внимание значительное усиление ^ глимуридом сопротивляемости мышей к микробной ин-
вазии, что проявлялось существенным снижением гибели животных (табл. 8). Интересно, что максимальный профилактический эффект оказал пероральный прием препарата в дозе 20 мкг/мышь - выживание 80% животных. Это свидетельствует о высокой системной иммуномодулирующей активности Р-С7МДП при применении per os, что коррелирует с описанными выше данными о достаточно хорошей усвояемости глимурида из желудочно-кишечного тракта. Внутривенное введение характеризовалось несколько большим диапазоном эффективных доз в сравнении с пероральным приемом. Препарат в дозе 0,2 и 2 мкг/ мышь повышал выживаемость животных до 60% при внутривенном ведении и до 20% при приеме per os. В последнем случае эффект был статистически не достоверным. Увеличение дозы глимурида при обоих видах введения до 200 мкг/мышь не привело к повышению профилактического действия в сравнении с 20 мкг/мышь.
На основании полученных результатов произведен расчет ED50: при пероральном введении препарата -
0,75±0,1 мг/кг, при внутривенном введении - 0,2 мг/кг.
Обсуждение
Результаты настоящей работы говорят, что Р-гликози-дирование МДП ведет к увеличению биологической активности гликопептида. Наоборот, а-гликозиды во всех используемых нами тест-системах in vitro и in vivo обладали меньшей активностью в сравнении с МДП.
Наши предыдущие исследования показали, что Р-С7М ДП превосходил по иммуностимулирующей активности в модельных тест-системах in vitro и по способности проникать через модельные и клеточные мембраны своего более липофильного гомолога Р-С16МДП [12,13,23].
Настоящие данные показывают преимущества Р-С7МДП и над более гидрофильным гомологом Р-С4МДП. Это подтверждает высказанное ранее предположение о том, что определенное сочетание гвдро- и липофильных свойств Р-С7МДП представляет собой принципиальное качество, позволяющее этому препарату воздействовать на основные звенья иммунитета эффективнее, чем его более гидрофильные и липофильные аналоги [9,13].
Таким образом, можно сформулировать одно из предпочтительных направлений поиска высокоэффективных иммуномодуляторов-мурамилпептидов: синтез Р-О-гли-козидов, в которых биологически активные группы сочетаются с амфифильносгью молекулы в целом.
Таблица 8. Влияние глимурида на резистентность мышей к внутрибрюшинному заражению Б. 1урЫ (103 микробных клеток/мышь)
Метод введения глимурида Доза (мкг) Гибель животных (%) Выжившие животные, %
1-й день 2-й день 3-й день 4-й день 5-й день
Контроль (физр-р per os) 40 60 - - - 0
Контроль (физр-р в/в) 40 30 20 10 - 0
per OS 200 40 20 - - - 40*
20 20 - - - - 80*
2 20 - - - - 20
0,2 40 40 - - - 20
Внутривенно 200 60 - - - - 40*
20 20 20 - - - 60*
2 20 20 - - - 60*
0,2 - 40 - - - 60*
В таблице представлены данные одного типичного из 3-х независимых экспериментов. Каждая группа животных включала 10 особей.
* -Достоверность различия с контролем - р<0,05.
Полученные нами данные, а также результаты предыдущих исследований иммуномодулирующего действия Р-гептилгикозид-МДП in vitro и in vivo [10,12,23], говорят о перспективности клинического применения данного препарата. Существенным положительным моментом явля-
ется высокая эффективность не только при внутривенном введении, но и при приеме per os, что расширяет возможные формы его применения.
В1997 году Р-гептилгикозид-МДП как активный компонент парафармацевтического препарата Глимурид успешно прошел испытания в Центре гигиенической сертификации пищевой продукции при институте питания РАМН и рекомендован к клиническому применению Фармакологическим государственным комитетом Российской Федерации как средство профилактики и комплексного лечения заболеваний, сопровождающихся вторичной иммунной недостаточностью. В настоящее время проходят его клинические испытания при вирусных, бактериальных и паразитарных инфекциях, ведутся исследования целесообразности его использования в реабилитации онкологических больных, получающих полихимиотерапию после радикального удаления опухоли.
Несмотря на то, что из трех наиболее перспективных (3-гликозидов (Р-С1МДП, (3-фенМДП и (3-адаМДП) только один препарат (3-С7МДП в настоящей работе был выбран для углубленного экспериментального и клинического изучения, мы считаем целесообразным и интересным продолжение исследование и двух других гликопептидов: (3-фенМДП и Р-адаМДП.
Трициклическая структура агликона (3-адаМДП обладает максимальной гидрофобностью при минимальных размерах, что безусловно влияет на способность гликопептида взаимодействовать с биомембранами, а также в значительной степени определяет внутриклеточное движение вещества. В молекуле адамантана атомы углерода имеют такое же пространственное строение, как в кристаллической решетке алмаза. Углеводород адамантан не растворим в воде, но растворяется в липидном слое клеточных мембран [2]. Соприкасаясь с живой клеткой, он изменяет физическое состояние клеточных мембран, повышая их проницаемость. С этим связано использование адамантановых радикалов для улучшения проникновения лекарственных препаратов внутрь клетки и повышения их фармакологической активности. Известно, что многие соединения, имеющие в своем составе адамантановые радикалы, проявляют высокую биологическую активность. Такие препараты, как мидантан, бромантан, кеман-тан, обладают одновременно противовирусной, противоопухолевой, иммунотропной и детоксицирующей активностью, а также широким спектром нейротопных эффектов [1].
Пожалуй не менее интересен для расширенного изучения и (3-фенМДП. Этот препарат оказался наиболее биологически активным из группы арилгликозидов и ари-лалкилгликозидов МДП. Структуры, схожие с агликонами гликопептидов указанной группы входят в состав многих биологически активных веществ, таких как витамин К, уби-хинон (коэнзим Q) и др. Предстоит ответить на вопрос: являются ли эти структуры биологически активными центрами молекулы или лишь выполняют роль гидрофобного якоря. И в том, и в другом случае целесообразно продолжение исследований иммунотропной активности и терапевтических эффектов Р-фенМДП в моделях опухолевых и инфекционных заболеваний.
Также, с нашей точки зрения, внимания заслуживает Р-циклогексилМДП, хотя карбоциклический агликон этого вещества не вызвал столь значительного увеличения биологической активности гликопептида, как карбоцепной агликон препаратов (3-С6МДП, Р-С?МДП и Р-С8МДП. Однако, в тест-системах in vitro Р-циклогексилМДП стимулировал продукцию ИЛ-1 и ФНО мышиными перитонеальными макрофагами эффективнее немодифицированно-го МДП. При этом его действие по выраженности было сходно с гликозидами с алифатическими цепями аглико-нов. В литературе имеются указания на то, что карбоцик-лические структуры могут увеличить биологическую активность мурамилпетидов. Так, оригинальный карбоциклический аналог нор-МДП, лишенный пирогенности, предохранял мышей от иммуносупрессивного действия циклофосфамида и увеличивал неспецифическую резистентность к грибковым инфекциям [24]. Кроме того, этот препарат активировал функции Т- и В-лифоцитов и макрофагов и стимулировал дифференцировку В-клеток в плазмоциты.
Таким образом, Р-гликозиды МДП представляют собой группу химических веществ, обладающих широким спектром биологических эффектов и являющихся перспективными в плане создания на их основе иммуномодулирующих лекарственных средств.
Разработка новых иммунотропных препаратов и методов регуляции иммунных реакций является важнейшей задачей, стоящей перед учеными медико-биологических направлений. На большом клиническом и экспериментальном материале продемонстрирована целесообразность включения методов направленной иммунокоррекции в тактические схемы лечения многих заболеваний [15]. В связи с этим представляется крайне актуальным определение предпочтительных направлений синтеза высокоэффективных иммуномодуляторов.
69+5,2
12 3 4
Рисунок 1. Влияние глимурида на проявление реакции ГЗТ при введении одновременно с сенсибилизирующей дозой антигена (ЭБ) мышам высокореагирующей линии СВА
Цифрами по оси абсцисс обозначены группы животных: 1 - контроль, 2 - (5-гептипгикозид-МДП (глимурид) (0,2 мкг), 3 - /З-гептилгикозид-МДП (20 мкг), 4 - /З-геп-тилгикозид-МДП (200мкг).
Показаны результаты 1 типичного из 3 независимых экспериментов. Каждое группа животных включала 10 особей.
* Достоверность различия с контролем (р<0,05).
12 3 4
Рисунок 2. Влияние глимурида на проявление реакции ГЗТ при введении одновременно с
сенсибилизирующей дозой антигена (ЭБ) мышам низкореагирующей линии С57В1./6
Цифрами по оси абсцисс обозначены группы животных: 1 - контроль, 2 - \5-гептилгикозид-МДП (глимурид) (0,2мкг), 3 - $-гептилгикозид-МДП (20мкг), 4- [3-геп-тилгикозид-МДП (200мкг).
Показаны результаты 1 типичного из 3 независимых экспериментов. Каждое группа животных включала 10 особей.
* Достоверность различия с контролем (р<0,05).
Литература
1. Арцимович Н.Г., Галушкина Т.С., Фадеева Т.А. Адамантаны - лекарства XXI века. Int. J. Immuno-rehabilitation. - 2000. - Vol. 2(1). P. 54-60.
2 Багрий Е.И. Адамантаны: получение, свойства, применение. -М.: Наука. -1989.
3. Земляков А.Е. Мурамоилпептиды: синтез и биологическая активность. Автореф. дис... док. хим. наук. - Одесса. - 2000.
4. Земляков А.Е., Чирва В.Я. Синтез гликозидных аналогов №ацегилмурамоил-Ь-аланил-0-изоглутамина. Химия природн. соедин. -1987. - № 5. - С. 714.
5. Иванов В.Т., Андронова Т.М., Несмеянов В.А. идр. Механизм действия и клиническая эффективность иммуномодулятора глюкозаминилмурамил дипептида (ликопи-да). Клиническая медицина. - 1997.-№3.-С. 11-15.
6. Иванов В.Т., Хаитов P.M., Андронова Т.М., Пине-гинБ.В. Ликопид (ГМДГТ) - новый отечественный высокоэффективный иммуномодулятор для лечения и профилактики заболеваний, связанных со вторичной иммунной недостаточностью. Иммунология.-1996.-№2.-С.4-6.
7. КалюжинО.В., ЗахароваН.С., БрицинаМ.В. идр. Иммуномодулирующая активность (3-гептилгликозид-му-рамилдипептида in vivo. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - Т. 128. -№11.-С. 553-554.
8. Калюжин О.В., Калюжин В.В., А.Е.Земляков и др. Стимуляция неспецифической резистентности мышей (3-
гептилгликозид-мурамилдипептидом. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. - 1999. - Т. 127. - № 5. - С. 543-545.
9. КалюжинО.В.,КарауловА.В.Поискпредпочтитель-ных направлений синтеза и разработка новых высокоэффективных иммуномодуляторов-мурамилпептидов. В книге «Успехи клинической иммунологии и аллергологии» под ред. А.В.Караулова. - Т. 1. - М. - 2000. - С. 252-258.
10. Калюжин О.В., Мулик Е.Л., Сергеев В.В. идр. Применение Р-гептилгликозид-мурамилдипептида в экспериментальной терапии генерализованных бактериальных инфекций. Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия,-2000.-№4.-С. 73-77.
11. Калюжин О.В. Производные мурамилдипептида в эксперименте и клинике. Журн. микробиол. -1998. - № 1. -С. 104-108.
12. КалюжинО.В., ФуксБ.Б., Бовин Н.В. идр. Иммуномодулирующая активность новых производных мурамилдипептида in vitro. Бюл. экспер. биол. -1994. - Т. 117. - № 5. -С. 510-513.
13. КалюжинО.В.,ФуксБ.Б.Влияниещдро-липофиль-ного баланса производных мурамилдипептида на их взаимодействие с биомембранами и включение в клетки. Бюл. экспер. биол. -1996. - Т. 122. - № 12. - С. 658-661.
14. Караулов А.В., Калюжин О.В. Цитокины: биологическое действие и клиническое применение. В книге «Успехи клинической иммунологии и аллергологии» под ред. А.В.Караулова.-Т. 1.-М.-2000.-С. 193-205.
15. Караулов А.В., Сокуренко С.И., Калюжин О.В., Ев-сегнеева И.В. Направленная регуляция иммунных реакций в профилактике и лечении заболеваний человека. Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2000. -№1.-С. 7-13.
16. ПинегинБ.Ф., Андронова Т.М., КарсоноваМ.И. Препараты мурамилдипептидового ряда - иммунотроп-ные лекарственные средства нового поколения. Int. J. Immunorehabilitation. -1997. - N. 6. - С. 27-34.
17. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.Ф., Зебрев А.И. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ. В книге «Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ». - М.: ИИА «Ремедиум». - 2000. - С. 257-263.
18. Ambler L., Hudson A.M. Pharmacokinetics and metabolism of muramyl dipeptide and nor-muramyl dipeptide (3H-labelled) in the mouse. Int. J. Immunopharmacol. -1984. -Vol. 6.-P. 133-139.
19. Ellouz E., Adam A., Cioburi R. & Lederer E. Minimal structural requirements for adjuvant activity of bacterial peptidoglican derivatives. Biochem. Biophys. Res. Commun. -1974.-Vol. 59.-P. 1317-1325.
20. Fidler I.J., Kleinerman E.S. Clinical application of phospholipid liposomes containing macrophage activators for therapy of cancer metastasis. Adv. Drug. Deliv. Rev. -1994.-Vol. 13(3).-P. 325-340.
21. Fish H., Gifford G.E. In vitro production of rabbit macrophage tumor cell cytotoxin. Int. J. Cancer. -1983. - Vol. 32.-P. 105-112.
22. Fogler W.E., Wade R., Brundlsh D.E., Fidler I.J. Distribution and fate of free and liposome-encapsulated
[3H]nor-MDP dipeptide and [3H]muramyl tripeptide phosphatidylethanolamine in mice. J. Immunol. -1985. - Vol. 135 (2).-P. 1372-1377.
23. Kalyuzhin O.V., Zemlyakov A.E. & Fuchs B.B. Distinctive immunomodulating properties and interactivity with model membranes and cells of two homologous muramyl dipeptide derivatives. Int. J. Immunopharmacol. -1996. - Vol. 18 (11).-P. 651-659.
24. Kikelj D., Pecar S., Kotnik V. et al. N-[trans-2-[[2'-(acetylamino)cyclohexyl]oxy]acetyl]-L-alanyl-D-glutamic acid: a novel immunologically active carbocyclic muramyl dipeptide analogue. J. Med. Chem. - 1998. - Vol.41 (4). -P.530-9.
25. Kotani S., Tsujimoto M., Koga T. et al. Chemical structure and biological activity relationship of bacterial cell walls and muramyl peptides. Federat. Proc. - 1986.-Vol. 45 (11).-P. 2534-2540.
26. Kotani S., Watanable Y., Shimono T. et al. Correlation between the immunoadjuvant activities and pyrogenicities of synthetic N-acetylmuramyl peptides or amino acids. Biken J.-1976.-Vol. 19(1).-P. 9-13.
27. Lovett D., Kozan B., Hadam M. et al. Macrophage cytotoxicity: interleukin 1 as a mediator of tumor cytostasis. J. Immunol. -1986. - Vol. 136 (1). - P. 340-347.
28. Morin C., BarrattG.,FessiH.etal. Improved intracellular delivery of muramyl dipeptide analog by means of nanocapsules. Int. J. Immunopharmacol.-1994.-Vol. 16(5/ 6).-P. 451-456.
29. Uede T., Kocda Y., Ibayashi Y. et al. Functional analysis of mononuclear cells infiltrating into tumors. II. Differential ability of mononuclaer cells obtained from various tissues to produce helper factors that are involved in the generation of cytotoxic cells. J. Immunol. - 1986. - Vol. 135 (5). - P. 3243-3251.
