CC BY
18зиологическую активность, т.е. Candida индифферентна по отношению к ассоциантам. В то время, как клинические изоляты дрожжей, полученные от больных острой кандидозной инфекцией, были чувствительны к действию бактериальных продуктов, причем метаболиты грамнегативной микробиоты усиливали патогенный потенциал грибов. По-видимому, при снижении колонизационной резистентности макроорганизма происходило ослабление регулирующего действия его на биоритмы грибов, и биорегуляторами физиологических функций выступали микросимбионты. В этом проявляется одна из важнейших закономерностей адаптационного процесса.
Обнаруженные изменения биологических ритмов пролиферативной активности, патогенных и персистентных свойств (протеазной, каталазной, гемолитической, антилизо-цимной активности) S. aureus, E. coli, P. aeruginosa под воздействием экзометаболитов ассоциативной микробиоты отражают адаптационные возможности патогенов, биологические ритмы которых подстраиваются к новой среде обитания в целях максимальной возможности микроорганизма адаптироваться к окружающей среде путем синхронизации его собственных ритмов с внешними циклами (Романов Ю.А., 2005).
Таким образом, выявленные изменения хроноинфраструктуры биологических ритмов микроорганизмов бактериально-грибковыми метаболитами ассоциантов отражают напряженность биологической системы, которая, по всей видимости, неизбежна в процессе формирования межмикробных взаимоотношений, т.е. биологические свойства возбудителей полностью определяют жизнеспособность, степень патогенности, а также адаптационные возможности микроорганизма.
Работа выполнена при грантовой поддержке фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 15-3-4-36 «Механизмы микробной регуляции ассоциативного симбиоза при инфекции».
ЛИТЕРАТУРА
1. Валиева М.В., Хетагурова Л.Г., Хуберцова Н.О., Тагаева И.Р. Биологические ритмы физиологических функций у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом. Владикавказский медико-биологический вестник. 2006 — 2007, 6 (11- 12): 16-20.
2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
3. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. М., Триада-Х, 2000.
4. Тимохина ТХ., Санников А.Г., Варницына В.В., Соколовский Н.А. Автоматизированная система «Косинор-анализа». Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932. Бюл. 2009, № 4.
5. Хетагурова Л.Г. Патофизиология десинхронозов. Владикавказский медико-биологический вестник. 2005, 5 (9): 32-40.
6. Nelson W., Tong YL., Lee J.K., Halberg F. Methods for cosinorrhytmometry. Chronobiologia. 1979, 6 (4): 305-323.
Контактная информация: Перунова Н.Б.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-59-08
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
М.В.Николенко, Т.Х.Тимохина, Я.И.Паромова
ВЛИЯНИЕ ФЛУКОНАЗОЛА НА ВРЕМЕННУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ CANDIDA ALBICANS
Тюменская государственная медицинская академия
Цель. Изучение влияния антимикотика флуконазола на временную организацию биологических свойств Candida albicans. Материалы и методы. Использовали клинические изоляты и музейный штамм С. albicans. Исследования проводили в течение суток с 4-часовым интервалом, определяя пролиферативную, адгезивную, морфологическую, про-теазную, каталазную, фосфолипазную активность. Результаты исследований обработаны статистически. Результаты. Установлена максимальная чувствительность к флуконазолу у музейного штамма С. albicans в дневное время, у клинических изолятов — в вечернее и ночное. После воздействия 1/2 минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата у музейной культуры изменились ритмы всех показателей с циркадианных на
ультрадианные. Препарат снижал мезор и амплитуду колебаний пролиферативной и адгезивной активности, но не влиял на хроноинфраструктуру морфогенеза и ферментов агрессии. Временные ряды биологической активности патогенных изолятов С. albicans после инкубации с флуконазолом характеризовались синхронизацией всех свойств в узком временном интервале с 07.00 до 11.00 и с 16.00 до 23.00 часов. Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о лабильности факторов адгезии и колонизации и стабильности факторов вирулентности у музейного варианта. Четкая синхронизация во времени всех факторов патогенности у клинических изолятов свидетельствует об экономии материальных и энергетических ресурсов, открывая перспективу использования хронобиоло-гического подхода в антибиотикотерапии кандидозов.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 30—35
Ключевые слова: хронобиология, флуконазол, биологическая активность грибов, Candida
albicans
M.V.Nikolenko, T.Kh.Timokhina, Ya.I.Paromova
EFFECT OF FLUCONAZOLE ON TEMPORAL ORGANIZATION OF BIOLOGICAL PROPERTIES OF CANDIDA ALBICANS
Tyumen State Medical Academy, Russia
Aim. Study the effect of fluconazole antimycotic on temporal organization ofbiological properties of Сandida albicans. Materials and methods. Clinical isolates and a museum С. albicans strain were used. The study was carried out for 24 hours with a 4 hour interval, determining proliferative, adhesive, morphological, protease, catalase, phospholipase activity. The results of the study were treated statistically. Results. Maximal sensitivity to fluconazole was established for the museum С. albicans strain during the day, in clinical isolates — in the evening and at night. After the effect of 1/2 minimal inhibitory concentration (MIC) of the preparation, the rhythms of all the parameters changed in the museum culture from circadian to ultradian. The preparation reduced mesor and amplitude of the oscillation of proliferative and adhesive activity, but did not have an effect on chrono-infrastructure of morphogenesis and aggression enzymes. The temporal rows ofbiological activity of pathogenic С. albicans isolates after the incubation with fluconazole were characterized by synchronization of all the properties in a narrow temporal interval from 07:00 to 11:00 and from 16:00 to 23:00 hours. Conclusion. The results obtained give evidence on the lability of adhesion factors and colonization and stability of virulence factors in the museum variant. A clear synchronization in time of all the pathogenicity factors of clinical isolates gives evidence on the economy of material and energy resources, opening a perspective of using the chronobiological approach in antibiotics therapy of candidoses.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 4, P. 30—35
Key words: chronobiology, fluconazole, biological activity of fungi, Candida albicans ВВЕДЕНИЕ
В связи с выраженной тенденцией к распространению кандидоза особую важность приобретает проблема его лечения. Сейчас традиционная медицина на своем вооружении имеет широкий спектр различных антимикотических препаратов. Механизм их фунги-цидного и фунгистатического действия заключен в нарушении синтеза эргостерола, в результате чего повышается проницаемость мембран клеток грибов и ингибируется их рост. С 1991 года в России широко используется флуконазол [10], который обладает высокой специфичностью и низкой частотой нежелательных эффектов [6]. По мнению клиницистов [15, 16] предупредить развитие антибиотикорезистентности у микромицетов практически невозможно. Поэтому изучение активности антимикотиков в течение суток открывает новые возможности для дальнейших исследований в направлении рациональ-
ной антибиотикотерапии. Цель исследования — изучить влияние флуконазола на временную организацию биологических свойств C. albicans.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для изучения активности грибов в течение суток использовали клинические изоляты С. albicans, выделенные из кишечника при кандидозе. Контролем служил депонированный эталонный штамм того же вида, полученный из американской коллекции типовых культур (АТСС) № 24433.
Видовую идентификацию грибов проводили по комплексу признаков: изучению внешнего вида колоний, хламидоспорообразованию, тесту на образование ростовых трубок, определению чувствительности дрожжевых организмов к антифунгальным препаратам методом дисков, ассимиляционной способности штамма [4]. Все изоляты выращивали на бульоне Сабуро. Для работы использовали 24-часовую культуру. Исследования проводились в течение суток с 4-часовым интервалом. Каждая временная точка включала 3 пробы. Экспериментально определяли пролиферативную [9], адгезивную [1], протеазную [11], каталазную [2], фосфолипазную активность [13] и морфологическую трансформацию из дрожжевой формы в мицелярную [4]. Музейный штамм перед исследованием инкубировали на кровяном агаре в течение суток в термостате при 37°C. Регулирующее действие флуконазола на биоритмы грибов исследовали диско-диффузионным методом и методом серийных разведений [5]. Выбор препарата обусловлен терапевтическим интересом к нему в медицинской практике. Максимальное разведение препарата, при котором наблюдалось отсутствие роста культуры, принималось как минимальная подавляющая концентрация (МПК). Субфунгиостатическая концентрация препарата равнялась 1/2 МПК. Экспериментально готовили 3 пробы: 1) опытная — в бульон Сабуро вносили рабочую концентрацию грибов (106 КОЕ/мл), добавляли водный раствор антимикотика в концентрации 0,25 мкг/мл для музейного штамма и 0,5 мкг/мл для культур, выделенных от больных людей, инкубировали в термостате при температуре 37°C в течение 18-20 часов; 2) контроль № 1 — бульон Сабуро и рабочая концентрация грибов (106 КОЕ/мл). Пробу использовали для определения исходного уровня биологических свойств исследуемых штаммов, в отношении которых изучали динамику свойств; 3) контроль № 2 — проверка стерильности питательного бульона.
Все результаты исследований обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента [3] и метода наименьших квадратов с целью поиска ритмов, оценивающих такие параметры как мезор — уровень среднего значения показателей изучаемого процесса; амплитуда — наибольшее отклонение показателя от мезора; акрофаза — точка времени в периоде, когда отмечалось максимальное значение исследуемого параметра [18]. Для выявления степени межиндивидуальной синхронизации ритмов использован популяционный косинор-анализ. Статистическая обработка проведена с использованием программ «Cosinor Ellipse 2006» [7] и «Косинор-анализ», адаптированной к микробиологическим исследованиям [14]. Анализируемые данные считали достоверными при значениях 95%.
РЕЗУЛ ЬТАТЫ
На первом этапе исследований выявлена чувствительность изучаемых культур к препарату. Диско-диффузионный метод позволил лишь косвенно судить о величине минимальной подавляющей концентрации, по которой можно отнести микроорганизм к одной из категорий чувствительности [5]. Методом серийных разведений как более чувствительным выявили различные периоды резистентности C. albicans к флуконазолу в течение суток. В ходе проведенного исследования установили, что максимальная чувствительность музейного штамма (минимальные значения подавляющей концентрации) зарегистрирована в дневное время: 12.00 — 16.00 часов (МПК=0,5 мкг/мл). Умеренная чувствительность к препарату наблюдалась в 08.00 и 20.00 часов (МПК=8 мкг/мл). Для подавления жизнедеятельности клинических изолятов грибов требовалась большая концентрация анти-микотика (МПК=1,0 мкг/мл). Патогенные штаммы проявляли максимальную чувствительность к флуконазолу в вечернее и ночное время, а в дневные часы зафиксирована резистентность к препарату (МПК=32 мкг/мл).
Во второй серии экспериментов флуконазол использовали в концентрации 1/2 МПК как стрессовый фактор, влияющий на биологические свойства грибов.
Амплитудно-фазовая характеристика биологических свойств музейного штамма (вверху) и клинических изолятов C. albicans (внизу) до (слева) и после (справа) воздействия флуконазола.
1) адгезия, 2) пролиферация, 3) морфогенез, 4) фосфолипаза, 5) протеаза, 6) каталаза. По окружности — время суток, часы.
Сопоставление основных ритмометрических параметров различного уровня интеграции позволило выявить амплитудно-фазовую стабильность биологических свойств микроорганизмов. Результаты для музейного варианта C. albicans представлены по времени максимальной патогенной активности с периодом равным суткам (рис. вверху).
После воздействия антимикотика у данной культуры изменились вклады ритмов всех изучаемых показателей с циркадианных (околосуточные) на ультрадианные (около 12-час). Такая ритмичность характерна для клинических изолятов, выделенных из биотопов больных кандидозом пациентов. Флуконазол у C. albicans АТСС изменял ритмометриче-ские показатели адгезии и пролиферации. В ходе исследований зарегистрирована инверсия ритма адгезии, то есть в период максимальной активности в контроле фиксировались минимальные значения в опыте. Экспериментально установлено снижение амплитуды и среднесуточных значений в 2,5 — 4 раза (р<0,05) как скорости роста и размножения, так и скорости прикрепления к поверхности. Однако препарат не влиял на хроноинфраструк-туру морфогенеза и ферментов агрессии. Полученные результаты могут свидетельствовать о лабильности факторов адгезии и колонизации у музейной культуры, которые первыми реагировали на стресс, факторы инвазии были более стабильные.
Временные ряды биологической активности патогенных изолятов С. albicans после инкубации с флуконазолом характеризовались синхронизацией всех свойств (рис. внизу).
3. ЖМЭИ 4 № 14-2015
33
У грибов сохранялись ультрадианные вклады ритмов всех показателей (р<0,05). Максимальная физиологическая активность регистрировалась только в утренние часы с 07.00 до 11.00 или в вечернее время с 16.00 до 23.00. Отмечены значительные временные интервалы отсутствия проявления биологических свойств (00.00 — 07.00 и 12.00 — 18.00). У грибов отмечено нивелирование суточной динамики адгезивной, пролиферативной, морфологической, протеазной и каталазной активности. Достоверно снижался мезор и амплитуда в 5,3 — 6,6 раза (р<0,05). Примечательно, что низкие концентрации препарата стимулировали фосфолипазную активность грибов, среднесуточные значения увеличились в 1,9 раза, а амплитуда в 3,4 раза по сравнению с контрольными показателями. Полученные результаты согласуются с данными некоторых авторов, обнаруживших ро-стостимулирующий эффект при воздействии низких концентраций химиотерапевтиче-ских препаратов [12].
ОБСУЖДЕНИЕ
Экспериментально установленные временные интервалы чувствительности и резистентности культур к антимикотикам открывают перспективы разработки рациональной анти-биотикотерапии кандидозов. В ходе исследования доказано, что при воздействии флуко-назола вклад ритма и амплитудно-фазовая характеристика изучаемых свойств не являются стационарными, что свидетельствует о высокой адаптационной способности микроорганизмов.
У клинических изолятов C. albicans наблюдалась четкая синхронизация во времени всех факторов патогенности, так как происходит экономия материальных и энергетических ресурсов в определенный временной период [8]. Взаимная синхронизация ритмов функциональных структур на фоне высокой лабильности процесса является универсальным механизмом адаптационного процесса, с помощью которого организм поддерживает гомеостаз в меняющихся условиях среды [17]. Естественная вариабельность параметров ритма позволяет лучше понять, каким образом в остающейся прежней структуре возникает новое содержание. Отличие и сходство нового и старого циклов ритма делят процесс развития биологической системы на отдельные отрезки, или кванты, и тем самым делают развитие квантовым, обеспечивая в нем единство непрерывности и дискретности при однонаправленном течении времени [8].
Л ИТЕРАТУРА
1. Брилис В. И., Брилене ТА., Ленцнер Х.П. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лабораторное дело. 1986, 4: 210-212.
2. Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Иванов Ю.Б. Способ выявления у бактерий ингибиторов каталазы микроорганизмов. Патент РФ № 2180353 от 10.03.2002.
3. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М., Практика, 1999.
4. Блинов Н.П., Васильева Н.В., Степанова А.А., Чилина LACandida. Кандидозы. Лабораторная диагностика. СПб, Коста, 2010.
5. Клиническая лабораторная аналитика. Под ред Меньшикова В.В. Агат-Мед, 2000.
6. Колбин А.С., Шабалов Н.П., Любименко В.А. и др. Профилактика поверхностной колонизации Candida spp. у недоношенных новорожденных. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатоло-гии. 2005, 4 (5-6): 44-50.
7. Нопин В.С., Корягина Ю.В. Автоматизированная система «Cosinor Ellipse». Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2006611345. Бюл. 2006, № 1.
8. Комаров Ф.И., Рапопорт С.И. Хронобиология и хрономедицина. М., Триада-Х, 2000.
9. Кашуба Э.А., Тимохина Т.Х., Курлович Н.А., Паромова Я.И., Варницына В.В., Хохлявина Р.М., Губин Д.Г., Козлов Л.Б. Способ диагностики госпитальных штаммов. Патент на изобретение № 2285258, 2006.
10. Перламутров Ю. Н., Ляпон А.О. Форкан в лечении кандидоза слизистой полости рта. Российский журнал кожных и венерических болезней. 2003, 1:57-58.
11. Практикум по микробиологии. Под ред. А.И. Нетрусова. М., Издательский центр Академия, 2005.
12. Сузина Н.Б., Мулюкин А.Л., Лойко Н.Г. и др. Тонкая структура мумифицированных клеток микроорганизмов, образующихся под влиянием химического аналога аутоиндуктора анабиоза. Микробиология. 2001, 70 (6): 776-784.
13. Суплотов С.Н., Журавлева Т.Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и ее регуляция. Методы лабораторной диагностики. Тюмень, Печатник, 2009.
14. Тимохина ТХ., Санников А.Г., Варницына В.В., Соколовский Н.А. Автоматизированная система «Косинор-анализа». Свидетельство РФ о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2009614932. Бюл., 2009, № 4.
15. Тихомиров А.Л., Сарсания С.И. Рациональная терапия кандидозного вульвовагинита. Трудный пациент. 2007, 5 (9): 21-24.
16. Хорошко Н.В., Давыдова Н.В., Ожерельева Н.Г. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. А.А. Воробьева. М., Медицинское информационное агентство, 2008.
17. Шмальгаузен И.И. Пути и закономерности эволюционного процесса. М., Наука, 1983.
18. Nelson W, Tong Y.L., Lee J.K. et al. Methods for cosinorrhymometry. Chronobiologia. 1979, 6 (4): 305323.
Контактная информация: Николенко М.В.,
460000, Оренбург, ул. Пионерская, 11, р.т. (3532)77-54-17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
Т.М.Уткина1, Л.П.Попова1, О.Л.Карташова1, Г.Д.Хазеева2, А.А.Халиуллина2
ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕТЕРМИНАНТЫ ПАТОГЕННОСТИ STAPHYLOCOCCUS AUREUS, ВЫДЕЛЕННЫХ У БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ НА ТЕРРИТОРИЯХ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ АНТРОПОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОЗДУШНОЙ СРЕДЫ
1Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза, Оренбург; 2Башкирский государственный медицинский университет, Уфа
Цель. Сравнительная фенотипическая и генетическая оценка патогенного потенциала штаммов Staphylococcus aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, проживающих на территориях с антропогенным загрязнением воздушной среды различной интенсивности. Материалы и методы. Объектом исследования явились S.aureus, выделенные трехкратно со слизистой оболочки переднего отдела носа 210 детей. Антикарнозиновую активность и образование биопленок определяли фотометрическим методом, антибиотикорезистентность — диско-диффузионным методом. Детекцию генов lukS, lukF, sec 3, clfA, clfB, agr и mecA, ассоциируемых с патогенностью S.aureus, осуществляли методом ПЦР. Результаты. Штаммы S.aureus, выделенные от детей, проживающих на территории с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, характеризовались антибиотикорезистентностью, более высокими значениями антикарнози-новой активности, в 2 раза чаще формировали биопленки с более высокими значениями признака. Гены clfA и clfB, детерминирующие колонизацию слизистых оболочек, и ген agr выявлены у всех исследованных штаммов S.aureus, гены lukF и sec 3 обнаружены у 20 — 40% штаммов, изолированных от детей, проживающих на обеих территориях. Генетические детерминанты mecA и lukS выявлены не были. Заключение. Золотистые стафилококки, выделенные от детей, проживающих на территории с высоким уровнем антропогенного загрязнения воздушной среды, характеризуются более высокими значениями изученных факторов персистенции и устойчивостью к антибиотикам. Генетические детерминанты патогенности выявлены у S.aureus, выделенных от лиц, проживающих на обеих территориях.
Журн. микробиол., 2015, № 4, С. 35—40
Ключевые слова: бактерионосители, Staphylococcus aureus, факторы персистенции, антибиотикорезистентность, генетические детерминанты патогенности, антропогенное загрязнение воздушной среды
