CC BY
113
Временная организация биологических свойств Candida albicans
Т.Х. Тимохина, к.б.н., М.В. Николенко, к.м.н., В.В. Варницы-на, к.м.н., Тюменская ГМА; Н.Б. Перунова, к.м.н., О.В. Бухарин, д.м.н., чл.-корр. РАН, ИКВС УрО РАН, Оренбург
Хронобиологические исследования закономерности организации жизнедеятельности биологиче-
ских систем во времени представляют несомненный интерес, т.к. многие процессы в природе протекают с достаточно чёткой периодичностью. Это свидетельствует о том, что биоритмы являются универсальным и важнейшим свойством жизни и способом существования живых организмов [1, 2, 3].
Большинство исследований временной биологической активности живых клеток было проведено на примере растений, животных и человека. Однако единичные экспериментальные данные указывают на наличие околосуточных и циркануальных (окологодовых) ритмов физической активности у дрожжевых и плесневых грибов [3, 4].
Поскольку биоритмологический подход к изучению биологических свойств микроорганизмов может способствовать выяснению механизмов адаптации возбудителей к изменяющимся условиям существования, интерес представляют материалы по изучению хроноинфраструктуры грибковых патогенов. Учитывая вышеизложенное, целью нашей работы явилось определение суточных биоритмов пролиферативной, фос-фолипазной и адгезивной активности Candida albicans.
Экспериментальные исследования in vitro проводили на модели музейного штамма С. albicans 24433 АТСС и клинического изолята С. albicans 192, выделенного из кишечника пациента с диагнозом «кандидоз». Данные культуры обладали типичными для своего вида морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами. Для биохимической диагностики применяли ассимиляционный колориметрический тест «Auxacolor 2» фирмы Bio-Rad. Культуры дрожжевых грибов выращивали в бульоне Сабуро при 37 °С в течение 24 часов, что соответствовало начальному этапу фазы стационарного роста микроорганизмов. Исследования проводились в зимнее время года (IV фаза Луны) в течение суток с четырёхчасовым интервалом.
Биоритмы пролиферативной активности микроорганизмов изучали по оригинальной методике, разработанной авторами [1]. Микробную взвесь C. albicans стандартизировали до 1,0 ед. (McFarland) на приборе «Densi-La-Meter» («Lachema», Чехия). Для определения общего микробного числа (ОМЧ) посев производили по методу Дригальского, активность фосфолипазы А2 определяли титрометрическим способом [5], адгезивную способность — по методу В.И. Бри-лиса с соавторами [6].
Для выявления синхронизации суточного ритма, его фазовой стабильности и оценки ритмометрических параметров (мезора, амплитуды, акрофазы и периода ритма) использовали
метод наименьших квадратов [7]. Под мезором понимали статистическую величину среднего значения показателей изучаемого признака, игнорирующую случайные отклонения в виде резких подъёмов и спадов величины. Акрофа-за — момент времени, соответствующий регистрации максимального значения показателя. Амплитуда — величина наибольшего отклонения показателя от мезора, что отражало мощность ритма, период ритма (Т) — продолжительность одного полного цикла [8]. Биологические ритмы по частоте колебаний классифицировали на ультрадианные ритмы (длина периода до 20 час.) и циркадианные (околосуточные) ритмы (длина периода 20—28 час.) [9]. Результаты обработаны статистически по Стьюденту.
При оценке временных параметров у штамма C. albicans 24433 АТСС установлены достоверные циркадианные (околосуточные) биологические ритмы всех изучаемых показателей (р<0,05) с высокими значениями амплитуды колебаний. Сопоставление ритмометрических параметров различных уровней интеграции позволило выявить «фазовый портрет» биологических свойств исследуемого штамма (табл. 1).
Установлено, что культура C. albicans 24433 АТСС проявляла максимальную адгезивную активность в вечернее время (16.00), а минимальные значения свойства регистрировались в ночные (00.00) и дневные (12.00) часы. Показатели количества колониеобразующих клеток грибов и активности фосфолипазы находились в противофазе с показателями адгезии (г = -0,24 и r = -0,57 соответственно). Через 16 часов (в 8.00) дрожжевые грибы активно секретиро-вали фермент фосфолипазу, тогда как в остальное время суток активность данного фермента агрессии была незначительна. Фосфолипазная активность сменялась фазой максимального логарифмического роста деления микроба. Суточная динамика пролиферации характеризовалась стабильной акрофазой в дневные часы — 12.00 и батифазой в вечернее время — 16.00.
У клинического изолята С. albicans 192, в отличие от музейного штамма, наблюдали де-синхроноз всех изучаемых показателей. Преобладал ультрадианный (12-часовой) вклад ритма с 8-часовыми гармониками. Отмечено достоверное повышение амплитуды колебаний адгезивной активности (р<0,05). Ритмометрические параметры
1. Расположение акрофаз показателей биологической активности С. albicans в течение суток
Время появления ак рофаз биологической активности (час.)
Штаммы Пролиферативная активность Адгезия Фосфолипазная активность
С. albicans 24433 АТСС 12.00 16.00 08.00
00.00 00.00
С. albicans 192 08.00 24.00 12.00
16.00 24.00
пролиферации характеризовались повышением мезора и снижением амплитуды (р<0,05).
Среднесуточная активность фермента и амплитуда у клинического варианта не изменялись по сравнению с музейным штаммом.
В исследовании выявили синхронизацию акрофаз изучаемых показателей у грибов, выделенных от больного. Совпадало время максимальной активности фосфолипазы и скорости деления (00.00 часов) (г = +0,33), а также время усиленной адгезии и активности фермента (16.00) (г= +0,31).
Проведённые исследования показали, что музейный штамм С. albicans 24433 АТСС обладал стабильным ритмом биологической активности и был наиболее активен в дневное время (с 8.00 до 16.00 часов). В этот период времени грибы были способны адгезироваться к поверхности, активно размножаться и секретировать фермент фосфолипазу за пределы клетки, катализируя гидролитическое расщепление жирных кислот в фосфолипидах. Известно, что образующиеся при этом продукты гидролиза—лизофосфати-ды — являются высокотоксичными соединениями, способствующими разрушению клеточных мембран организма хозяина [10], обеспечивая, таким образом, пенетрацию и инвазию грибковых патогенов.
В отличие от музейной культуры, у клинического штамма С. albicans 192 отмечен высокий резерв адгезивной активности, а также установлено сглаживание ритма, повышение мезора при большом снижении амплитуды колебаний пролиферации, что подтверждает максимальное напряжение данной функции у грибов [8, 11].
Установленный циркадианный период ритма и стабильные значения мезора и амплитуды биологической активности свидетельствуют о высокой вариабельности грибковых па-
тогенов. Анализ процессов, формирующих пространственно-временную организацию музейных и клинических штаммов C. albicans, выявил рассогласование околосуточных ритмов всех исследуемых свойств грибов, что может быть связано с перестройкой их физиологической активности в течение суток.
Полученные данные о наличии биологических ритмов у штаммов C. albicans расширяют представления о биологии грибковых патогенов и способствуют использованию биоритмологического подхода в изучении биологических свойств микроорганизмов при выяснении механизмов адаптации возбудителей к изменяющимся условиям существования.
Литература
1. Маркина В.В., Кузин С.М. Роль механизмов саморегуляции в синхронизации клеток и формировании ритмов пролиферативной активности // Мат. первого российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ, 2008. С. 36—37.
2. Иванов С-.В., Мороков В.А., Герасимова Н.Д., Попова В.А., Бланк М.А., БланкО.А.Хроноэпидемиология — инструмент доказательной медицины // Мат. первого российского съезда по хронобиологии и хрономедицине с международным участием. Владикавказ, 2008. С. 26—27.
3. Halberg F. Chronobiological glossary of the International society for the study of biological rhythms / F. Halberg, G.S. Katinas // Internat. J. Chronobiol. 1973. Suppl. 1. P. 31—63.
4. Кашуба Э.А. и др. Способ диагностики госпитальных штаммов № 2285258 от 10 октября 2006 г. Бюл. №28.
5. ТужилинС.А., СалуэньяА.И. Метод определения активности фосфолипазы Ат в сыворотке крови // Лабораторное дело. №6. 1975. С, 334-336.
6. 1убин Д.Г., 1убин Г.Д. Хроном сердечно-сосудистой системы на различных этапах онтогенеза человека. Тюмень, 2000. 176 с.
7. Methods for cosinorrhymometry /W. Nelson, Y.L. Tong, J.K. Lee et al. // Chronobiologia. 1979.'Vol. 6, N.4. P. 305-323.
8. Хронобиология и хрономедицина: руководство / под ред. Ф.И. Комарова. М.: Медицина, 2002. 400 с.
9. Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер А.А. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов // Лабораторное дело. 1984. №4. С. 210-212.
10. Суплотов С.Н., Журавлева Т.Д. Адаптация человека к авиаполетам. Липопероксидация в эритроцитах и её регуляция. Методы лабораторной диагностики. Тюмень: ООО «Печатник», 2009. 104 с.
11. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Цавкелова Е.А. Колониальная организация и межклеточная коммуникация у микроорганизмов // Микробиология. 2000. Т. 69. №3.
