CC BY
50
ВЛИЯНИЕ ФАРМАКОТЕРАПИИ НА ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ БИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА
Д.Д. Сафина 1, СР. Абдулхаков 12, Т.В. Гоигорьева 1, М.И. Маркелова 1, Р.К. Исмагилова 1, Д.Р. Хуснутдинова 1, С.Ю. Маланин 1, А.В. Лайков 1, М.Н. Синягина 1, Р.А. Абдулхаков 2, В.М. Чернов 1
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Pharmacotherapy effect on genetic diversity of intestinal biocenosis
D.D. Safina 1, S.R. Abdulkhakov12, TV. Grigoryeva 1, M.I. Markelova 1, R.K. Ismagilova 1, D.R. Khusnutdinova 1, S.Yu. Malanin 1, A.V. Laikov 1, M.N. Siniagina 1, RA. Abdulkhakov2, V.M. Chernov1
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
Одним из наиболее частых нежелательных явлений на фоне эрадикационной терапии H. pylori является диарея, обусловленная нарушением состава кишечного биоценоза . Цель исследования — оценить генетическое разнообразие кишечного биоценоза у H. pylori-позитивных и H. pylori-негативных пациентов, а также влияние эрадикационной терапии на его количественный и качественный состав
Для анализа были использованы 78 образцов кала: 34 образца от H. pylori-позитивных пациентов до эрадикационной терапии, 34 — от тех же пациентов после окончания курса эрадикации, 10 образцов от H. pylori-негативных добровольцев (контрольная группа).
Из образцов кала выделяли тотальную ДНК и устанавливали ее нуклеотидную последовательность методом шотган-секвенирования На основании количества видов, качественного состава и индекса видового разнообразия Шеннона оценивали состав сообщества кишечной микрофлоры . Статистический анализ и визуализацию результатов анализа осуществляли в среде R .
Во всех группах образцов кала преобладающими оказались рода Bacteroides, Prevotella, Eubacterium, Roseburia, Faecalibacterium и Clostridium, однако, вариабельность представленности преобладающих фил Bacteroides и Firmicutes в контрольных образцах оказалась ниже по сравнению с H. pylori-позитивными пациентами до эрадикации и после проведенной терапии. Эрадикационная терапия приводила к уменьшению представленности родов Coprococcus, Bifidobacterium, Collinsella и увеличению количества Clostridium, Bacteroides, Coprobacillus и Flavonifractor. У половины пациентов эрадикационная терапия сопровождалась снижением как числа видов, так и индекса Шеннона, что свидетельствуют об уменьшении общего разнообразия и, как следствие, снижении устойчивости сообщества с возможным преобладанием отдельных видов . Полученные результаты позволяют предположить, что изменения состава биоценоза кишечника на фоне эра-дикационной терапии индивидуальны и обусловлены исходным состоянием кишечной микробиоты с преобладанием тех или иных ее представителей
Ключевые слова: биоценоз кишечника, H. pylori, эра-дикационная терапия, секвенирование ДНк
Diarrhea is one of the most frequent adverse events of H. pylori eradication therapy due to a violation of the intestinal microflora . The aim of the study was to assess intestinal microflora content in H. pylori-positive and H. pylori-negative patients, as well as the effect of eradication therapy on its qualitative and quantitative composition
78 stool samples were used for analysis: 34 samples from H. pylori-positive patients before eradication therapy, 34 — from the same patients after completion of eradication therapy, 10 samples from H. pylori-negative patients (control group).
A total deoxyribonucleic acid (DNA) was isolated from the stool samples by phenol extraction method, a nucleotide sequence of the isolated DNA was established by shotgun sequencing method . Composition of intestinal microflora community was evaluated based on the number of species, the qualitative composition and diversity Shannon index . Statistical analysis and visualization of the analysis results were carried out in R medium .
Bacteroides, Prevotella, Eubacterium, Roseburia, Faecalibacterium and Clostridium were predominant genus in all groups of faecal samples, however, representation variability of the prevailing phyls (Bacteroides and Firmicutes) was lower in the control samples than in H. pylori-positive patients before and after eradication therapy. Eradication therapy resulted in reduction of the Coprococcus, Bifidobacterium, Collinsella genera representation and increase in the number of Clostridium, Bacteroides, Coprobacillus and Flavonifractor.
In about half of the patients eradication therapy leads to a decrease of both the number of species and the Shannon index, which indicates a decrease in the overall diversity and, consequently, reduction of the stability of community, with a possible predominance of individual species .
These results suggest that changes in the intestinal microflora composition after H. pylori eradication therapy are individual and caused by initial condition of the intestinal microbiota with a predominance of its particular representatives
Keywords: gastrointestinal microbiome, H . pylori, eradication therapy, DNA sequence analysis .
Введение
Состоянию биоценоза желудочно-кишечного тракта отводится существенная роль в нормальной физиологии здорового человека . В настоящее время известно, что кишечная микробиота выполняет важные функции, такие как защита кишечника от колонизации патогенными микроорганизмами, нутри-тивная функция, участие в формировании иммунной защиты организма [1].
Несмотря на то, что состав микрофлоры является относительно стабильным, количественные и каче-
е-таП: sayarabdul@yandex . ги
ственные его изменения прямо или опосредованно влияют на общее состояние человека Нарушение состава и функций кишечного биоценоза может привести к ряду патологических состояний, таких как воспалительные заболевания, воспалительные поражения и язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, синдром мальабсорбции, атеросклероз, сахарный диабет, ревматоидный артрит, злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта, дерматиты, бронхиальная астма и другие аллергические заболевания [2—5].
С другой стороны, факторы внешней среды, диета и образ жизни могут приводить к количественным и качественным сдвигам в составе нормальной микробиоты кишечника [6]. Применение антибактериальных агентов с терапевтической, а иногда и с профилактической целью приводит к нарушению равновесия между хозяином и состоянием его микрофлоры [7].
Эрадикационная терапия, направленная на уничтожение H. pylori, не является исключением, поскольку сопряжена с необходимостью приема нескольких антибактериальных препаратов, и поэтому в ряде случаев приводит к возникновению нежелательных эффектов терапии, в том числе диареи
Кроме того, было показано, что именно применение пробиотических препаратов совместно с эрадикационной терапией может способствовать уменьшению частоты такого побочного явления, как диарея [8]. Именно диарея служит косвенным клиническим подтверждением возникновения нарушений кишечного биоценоза на фоне применения антибактериальных препаратов, в частности на фоне эрадикации H. pylori.
Несмотря на то, что в настоящее время не много работ, в которых изучалось влияние эрадикационной терапии инфекции H. pylori на состояние кишечного биоценоза, есть ряд оснований полагать, что микрофлора кишечника претерпевает разнообразные изменения на фоне эрадикации . Более того, в ряде исследований было продемонстрировано, что сама инфекция H. pylori может приводить к сдвигам в составе нормальной кишечной микрофлоры [9—13]. Так, изменения в составе микробиоты кишечника на фоне эрадикации H. pylori были продемонстрированы при применении как бактериологических [10, 11, 14, 15], так и молекулярно-генетических методов исследования [16].
Несмотря на довольно разнообразные результаты, полученные в исследованиях, в целом изменения кишечного биоценоза характеризуются снижением разнообразия; уменьшением числа облигатных анаэробных микроорганизмов, преобладающих в норме; преобладанием факультативных аэробов, часто вызывающих развитие оппортунистических инфекций Определённо неясным остается более принципиально важный вопрос «обратимости» этих изменений: носят ли они кратковременный или же долгосрочный, а, возможно, и необратимый характер [6, 16, 17]?
Целью нашего исследования было оценить генетическое разнообразие кишечного биоценоза у H. pyfori-позитивных и H. pylori-негативных пациентов с различной гастроэнтерологической патологией, а также влияние эрадикационной терапии на его количественный и качественный состав
Материал и методы
Характеристика пациентов
Образцы кала были отобраны у пациентов, включенных в исследование с учетом критериев включения/невключения .
критерии включения пациентов в исследование:
1) пациенты любого пола (мужчины и женщины) в возрасте от 18 до 75 лет;
2) наличие проведенной процедуры эндоскопической эзофагогастродуоденоскопии и определения H. pylori одним или несколькими методами в течение 1 мес до даты первичного визита;
3) добровольное согласие пациента на участие в исследовании
критерии невключения:
1) пациенты, у которых по результатам эндоскопического обследования обнаружены полипы или злокачественное образование желудка;
2) наличие в анамнезе сопутствующих состояний и заболеваний, которые могли бы привести к выраженным изменениям состава микрофлоры кишечника, таких как:
а) воспалительные заболевания кишечника;
б) синдром мальабсорбции, связанный с установленным заболеванием тонкой кишки, поджелудочной железы, др
в) онкологические заболевания любой локализации;
г) предшествующие операции на желудочно-кишечном тракте (кроме аппендэктомии);
д) прием некоторых лекарственных средств (им-муносупрессорных лекарств, цитостатиков, глюко-кортикостероидов, антибактериальных препаратов, пре- и пробиотиков) в течение 3 мес до момента включения в исследование;
3) прием ингибиторов протонной помпы (ИПП), препаратов висмута (висмута трикалия дицитрата) в течение 2 нед до момента включения пациента в исследование;
4) злоупотребление алкоголем, наркотическими веществами;
5) хронические заболевания внутренних органов (сердечно-сосудистые заболевания, заболевания дыхательной системы, печени, почек, эндокринные заболевания) в стадии декомпенсации;
6) инфекционные заболевания и паразитарные инфекции, в том числе ВИЧ, вирусные гепатиты, туберкулез;
7) наличие у пациента диареи (с частотой стула более 3 раз в день) в течение не менее 3 дней подряд на протяжении последнего месяца;
8) беременность или лактация;
9) невозможность или нежелание пациента соблюдать все процедуры исследования
В данный анализ включены результаты исследования генетического разнообразия кишечного биоценоза 44 пациентов (34 H. pyfor/'-позитивных и 10 H. pylori-негативных пациентов), соответствующих вышеуказанным критериям включения/невключения Возраст пациентов составил от 23 до 69 лет
Основными жалобами при первичном обращении к гастроэнтерологу были: изолированно болевой синдром в эпигастральной области наблюдался у 35,89% пациентов; только изжогу отмечало 20,51% пациентов; изолированно диспепсические жалобы наблюдались у 7,69% пациентов, жалобы другого характера (ощущение комка в горле, тошнота, горечь во рту, снижение аппетита) были отмечены 12,82% пациентов; при этом у 23,08% пациентов отмечалось жалобы смешанного характера
Показания для эрадикации H. pylori определялись положениями IV Маастрихтского Консенсуса [8] В нашем исследовании основными показаниями для эрадикации H. pylori были: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки (22,86%), язвенная болезнь желудка (5,71%), функциональная диспепсия (14,29%), эрадикация H. pylori у пациентов с планируемым длительным приемом ингибиторов протонной помпы (28,57%), желание пациента (25,71%), в 2,86% случаев эрадикация была проведена
близким родственникам больных раком желудка (2,86%).
Наличие H. pylori было диагностировано одним или несколькими (у 33,3% пациентов) методами . Основными диагностическими тестами были: быстрый уреазный тест (частота применения 37,5%), цитологическое исследование (30,36%), серологическое определение антител к H. pylori (16,07%), уреазный дыхательный тест (14,28%), определение антигена H . pylori в кале (1,79%).
Для эрадикации H. pylori использовали следующую схему: эзомепразол 20 мг, кларитромицин 500 мг, амоксициллин 1000 мг, висмута трикалия дицитрат 240 мг, 2 раза в день, per os, в течение 14 дней в сочетании с лактулозой 5 мг, per os, 1 раз в день, 14 дней . После завершения курса эрадикаци-онной терапии пациентам был рекомендован прием пробиотика (Bifidobacterium longum + Enterococcus faecium) 1 капсула 2 раза в день, per os, 14 дней .
Дизайн исследования
Все пациенты, включенные в исследование, были поделены на две группы: первая группа — H. pylori-позитивные (34 человека), вторая группа — H. pylori-негативные (10 человек) .
На первом визите всем пациентам проводили анализ жалоб, сбор анамнеза по специально разработанной анкете . У H. pylori-негативных пациентов был произведён однократный забор кала до начала лечения с целью изучения состава микробиоты кишечника . У H. pylori-позитивных пациентов забор кала проводился двукратно:
1)до начала эрадикационной терапии для определения исходного состава микробиоты кишечника;
2) после окончания эрадикационной терапии (через 14 ( + 5) дней от начала эрадикационной терапии), до начала терапии пробиотиком, для изучения влияния эрадикационной терапии на состав микро-биоты кишечника .
Забор кала производился пациентом в одноразовые флаконы, далее образцы замораживали и хранили при температуре -20°С для проведения метаге-номного анализа
Для анализа были использованы 78 образцов кала: 34 образца от H. pylori-позитивных пациентов до эрадикационной терапии, 34 — от тех же пациентов после окончания курса эрадикации, а также 10 образцов от H. pylori-негативных пациентов (контрольная группа) .
Методика анализа биообразцов
Из 150 мг замороженных образцов кала выделяли тотальную дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) методом фенольной экстракции [18]. Нуклеотидную последовательность выделенной ДНк устанавливали методом шотган секвенирования с использованием высокопроизводительного секвенатора SOLiD 5500 Wildfire, Applied Biosystems (США) [19].
Предварительная обработка геномных данных включала в себя фильтрацию низкокачественных ридов, коррекцию с помощью программы SAET и отбор высококачественных ридов . Таксономический состав микробиоты реконструировали путем картирования ридов на неизбыточный референсный каталог из 353 геномов микроорганизмов, характерных для микробиоты кишечника человека (каталог Human Microbiome Project [20] и дополнительные геномы
с NCBI FTP (ftp://ftp . ncbi . nlm . nih . gov/), с использованием программного пакета Bowtie [21]. Относительную представленность микроорганизмов в образце рассчитывали путем деления общей длины ридов, картированых на отдельный микробный геном, на размер этого генома, с последующей нормировкой на общую длину всех ридов, откартированных на геномы референсного каталога . В результате была получена исчерпывающая информация о составе биоценоза кишечника, включая патогенные, некуль-тивируемые и редкие (менее 0,1%) виды микроорганизмов . Статистический анализ и визуализацию результатов анализа осуществляли в среде R [22]. Разведочный анализ был проведен с использованием метода главных компонент также в среде R .
Оценку генетического разнообразия кишечного биоценоза проводили на основании трех параметров: количество видов, качественный состав и индекс видового разнообразия Шеннона в образцах от пациентов до и после курса эрадикации по сравнению с контрольной группой
Индекс видового разнообразия (индекс Шеннона) [23] вычисляли по формуле:
71
,
1 = 1
где pi — доля вида в сообществе; n — количество видов . Исходя из формулы, на величину индекса влияют, как количество видов в сообществе, так и равномерность их распределения, т е наибольшее значение индекса (при одинаковом количестве видов) получается при одинаковой численности всех видов в сообществе . При доминировании отдельных видов значение индекса уменьшается
Результаты и обсуждение
Во всех группах образцов кала преобладающими оказались рода Bacteroides, Prevotella, Eubacterium, Roseburia, Faecalibacterium и Clostridium (рис . 1) . Вариабельность представленности преобладающих фил Bacteroides и Firmicutes в контрольных образцах оказалась ниже по сравнению с H. pylori-позитивными пациентами: 47,1±16,7% и 48,9±16,23%, соответственно, против 45,3±23,8% и 46,9±21,0% до эрадикации и 51,7±23,2% и 44,1±21,4% после эрадикации, что может быть связано с влиянием H. pylori и антибактериальных препаратов на состав микрофлоры кишечника [11, 13].
После проведенной эрадикационной терапии наблюдали существенное уменьшение представленности родов Coprococcus (в 76,5% случаев), Bifidobacterium (64,7%), Collinsella (64,7%) . В то же время увеличивалось количество Clostridium (в 79,4% случаев), Bacteroides (70,5%), Copro-bacillus (67,6%), Flavonifractor (70,5%) По всей видимости, некоторые представители родов Clostridium, Bacteroides, Coprobacillus, Flavonifractor обладают резистентностью к применяемым антибиотикам, что приводит к увеличению их представленности (доли) в биоценозе кишечника на фоне эрадикационной терапии [14].
Для интегральной оценки влияния эрадикации H. pylori на состав биоценоза кишечника анализировали изменения индекса Шеннона и общего количества видов
%
55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 -5 -10
Рис. 1.
Количественное распределение бактерий (>1%) в составе биоценоза кишечника H. ру1оп-негативных пациентов (контрольная группа)
В отличие от группы контроля у И. ру1оп-положительных пациентов наблюдали более широкий диапазон вариаций, особенно в сторону уменьшения
индекса Шеннона, что может свидетельствовать о нестабильности сообщества микрофлоры кишечника пациентов и преобладании одного или нескольких видов над другими (рис . 2).
До эрадикации
После эрадикации
Среднее значение для лиц контрольной группы Диапазон значений для лиц контрольной группы
—Г"
2.0
—Г"
2.5
—Г"
3.0
-Г"
3.5
-4.0
Индекс Шеннона
Рис. 2.
Распределение индекса видового разнообразия микроорганизмов (индекса Шеннона) в исследуемых образцах
84
оригинальные исследования
В зависимости от выраженности и направленности изменения состава кишечного биоценоза и индекса Шеннона нами было выделено несколько типов возможных изменений на фоне эрадикационной терапии (табл. ) .
Так, например, в случаях 3 и 4 индекс Шеннона увеличивается за счет снижения численности ранее (до эрадикации) доминирующих представителей сообщества и/или возникшего преобладания ранее минорных представителей сообщества, обеспечивающих более равномерное распределение численностей отдельных видов микроорганизмов на фоне общего снижения количества видов (случай 3) или при неизменном количестве видов (случай 4). Уменьшение численности бактерий, негативно влияющих на работу кишечника (например, Clostridium, Bacteroides), и (или) увеличение численности представителей нормальной микрофлоры (например, Lactobacillus, Bifidobacterium) является положительной динамикой изменения сообщества как в случае 4, так и в случае 2, однако в случае 4, по-видимому, необходимо назначение препаратов, корректирующих состав микрофлоры кишечника
Как и ожидалось, наиболее частым вариантом изменения параметров кишечного биоценоза (у 17 пациентов из 34) является случай 1, когда снижается как число видов, так и индекс Шеннона. Это характеризует наименее благоприятные для сообщества изменения . Уменьшающиеся количество видов и индекс Шеннона свидетельствуют о снижении общего генетического разнообразия и, как следствие, снижение устойчивости сообщества к возможным неблагоприятным факторам
В целом отличия между бактериальными сообществами микрофлоры кишечника контрольной группы пациентов, И. ру!ог/-положительных пациентов до и после проведения эрадикационной терапии не сводятся к одному и нескольким четко выраженным признакам (рис 3)
Таким образом, изменения кишечного биоценоза на фоне эрадикации И. ру1ог зависят от многих факторов и носят комплексный индивидуальный характер . Полученные данные позволяют выявить разнообразные тенденции в изменении видового состава кишечной микробиоты в результате антибактериальной терапии, однако, для установления достоверной зависимости от начального статуса биоценоза кишечника необходим анализ большего количества образцов
Таблица. Варианты изменения параметров кишечного биоценоза после эрадикации
№ Индекс Шеннона* Количество видов* % случаев
1 уменьшается уменьшается 50
2 увеличивается увеличивается 23,5
3 увеличивается уменьшается 23,5
4 увеличивается не меняется 3
* — изменения по сравнению с параметрами до эрадикации .
10 -
см Е а
0 о-
-10
■ Контроль
Ж H. ру/ол-позитивные пациенты до эрадикации • H. ру/ол-позитивные пациенты после эрадикации
-
.V4
-5
0
Dim1 (9.2%)
Рис. 3. Многопараметрическое сравнение метагеномных данных образцов содержимого кишечника
5
5
оригинальные исследования
в5
Благодарности
Данное исследование выполнено при финансовой поддержке Министерства образования и науки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным на-
правлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» (Соглашение № 14.575.21.0076, Ю RFMEFI575I4X0076) с использованием оборудования Междисциплинарного центра коллективного пользования Казанского федерального университета (Ю RFMEFI59414X0003).
ЛИТЕРАТУРА:
I. Guarner F . Enteric flora in health and disease . Digestion 2MB; 73 (Suppl . 1): 5-12 .
2 . Tlaskalová-Hogenová H ., Stëpánková R . , Kozáková H . et al . The role of gut microbiota [commensal bacteria) and the mucosal barrier in the pathogenesis of inflammatory and autoimmune diseases and cancer: contribution of germ-free and gnotobiotic animal models of human diseases . Cellular & Molecular Immunology 2^11; В: 11Ü-2Ü .
3 . Fong I .W . The Role of Microbes in Common Non-Infectious Diseases . Publisher: Springer New York . Copyright Holder: Springer Science + Business Media New York . 2^14 . XIV, 1В5 .
4 . Sherbet G . Bacterial Infections and the Pathogenesis of Autoimmune Conditions . BJMP 2Ш9; 2(1): B-13 .
5 . Sun J ., Chang E . B . Exploring gut microbes in human health and disease: Pushing the envelope . Genes & Diseases 2^14; 1(2): 132-9 .
B . Jernberg C ., Löfmark S ., Edlund C . et al . Long-term impacts of antibiotic exposure on the human intestinal microbiota . Microbiology 15B (Pt 11): 321B-23 .
7 . Sullivan A. , Edlund C ., Nord C . E . Effect of antimicrobial agents on the ecological balance of human microflora . Lancet Infect . Dis . 2Ш1; 1: Ю1-14 .
В . Malfertheiner P ., Megraud F ., O'Morain C . A. et al . Management of Helicobacter pylori infection-the Maastricht IV . Florence Consensus Report . Gut . 2^12; B1(5): B4B-B4 .
9 . Schulz C . , Koch N ., Schütte K . et al . H . pylori and its modulation of gastrointestinal microbiota . J . Dig . Dis . 2^15; 1B(3): Ю9-17 .
Ю . Bühling A. , Radun D ., Müller W .A. et al . Influence of antiHelicobacter triple-therapy with metronidazole, omeprazole and clarithromycin on intestinal microflora . Aliment . Pharmacol . Ther. 2Ш1; 15(9): 1445-52 .
II. Lou J . G ., Chen J . , Huang X . L . et al . Changes in the intestinal microflora of children with Helicobacter pylori infection and after Helicobacter pylori eradication therapy . Chin . Med . J . 2Ш7; 12Ш1Ш: 929-31
12 . Myllyluoma E ., Ahlroos T., Veijola L. et al . Effects of antiHelicobacter pylori treatment and probiotic supplementation on intestinal microbiota . Int . J . Antimicrob . Agents . 2Ш7; 29(1): BB-72 .
13 . Yang Y . J ., Sheu B . S . Probiotics-containing yogurts suppress Helicobacter pylori load and modify immune response and intestinal microbiota in the Helicobacter pylori-infected children Helicobacter 2012; 17(4): 297-304 .
14 . Adamsson I ., Nord C . E . , Lundquist P . et al . Comparative effects of omeprazole, amoxycillin plus metronidazole versus omeprazole, clarithromycin plus metronidazole on oral, gastric and intestinal microflora in Helicobacter pylori-infected patients J Antimicrob Chemother . 1999; 44(5): 629-40 .
15 . Tanaka J ., Fukuda Y ., Shintani S . et al . Influence of antimicrobial treatment for Helicobacter pylori infection on the intestinal microflora in Japanese macaques . J . Med . Microbiol . 2005; 54: 309-14.
16 Jakobsson H E , Jernberg C , Andersson A F et al Short-Term antibiotic treatment has differing long-term impacts on the human throat and gut microbiome . PLoS One 2010; 5(3): e9836 .
17 . Jernberg C . , Löfmark S ., Edlund C . et al . Long-term ecological impacts of antibiotic administration on the human intestinal microbiota ISME J . 2007; 1: 56-66;
18 . Zhang B . W ., Li M ., Ma L . C . et al . A widely applicable protocol for DNA isolation from fecal samples . Biochem . genetics 2006 . 44 (11-12): 494-503 .
19 . Mitra S ., Förster-Fromme К ., Damms-Machado A. et al . Analysis of the intestinal microbiota using SOLiD 16S rRNA gene sequencing and SOLiD shotgun sequencing . BMC genomics 2013; 14(Suppl 5): 16 .
20 . Human Microbiome Project Consortium . Structure, function and diversity of the healthy human microbiome . Nature 2012 . 486 (7402): 207-14 .
21. Langmead B ., Trapnell C . , Pop M . et al . Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome Genome Biol . 2009 . 10(3): R25 .
22 A language and environment for statistical computing R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria . URL http:// www . R-project . org/ .
23 Shannon C E A mathematical theory of communication ACM SIGMOBILE Mobile Computing and Communications Review 2001; 5(1): 3-55 .
Поступила: 29.10.2015
