CC BY
9НОВЫЕ МЕТОДЫ В ЦИТОЛОГИИ
ВИЗУАЛИЗАЦИЯ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ С КЛЕТКАМИ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ПОМОЩЬЮ ОКРАШИВАНИЯ ВИТАЛЬНЫМ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ КРАСИТЕЛЕМ — ДСМ
О.В. ТАРНОПОЛЬСКАЯ, Е.М. НЕПОМНЯЩАЯ, В.А. СЕРГАНЬ
Патологоанатомическое отделение Ростовского научно-исследовательского онкологического иснститута (РНИОИ) Минздрава РФ, г. Ростов-на-Дону
Наблюдение за клетками аденокарциномы предстательной железы в физрастворе, которые были окрашены витальным флуоресцентным красителем [4-^-диметилами-ностирил) -1 метилпиридинием] (ДСМ), позволило обнаружить в клеточной взвеси антибиотик цефалоспорин в виде черных капель размерами, близкими к размеру ядер. Визуализирован процесс проникновения этих капель в цитоплазму и ядро. Черные капли цефалоспорина внутри клеток разбиваются на мелкие вакуоли и постепенно растворяются в цитоплазме, или проникают в ядро, делая его темным. Флуоресценция ДСМ в клетке полихроматична: цитоплазма зеленая, ядро оранжевое, ядрышки желтые или светло-оранжевые, митохондрии — желтые. Традиционная окраска по Паппенгейму цитологического препарата, полученного из аспирационного пунктата предстательной железы, не показывает наличия цефалоспоринов внутри и вокруг клеток.
Ключевые слова: аденокарцинома предстательной железы, цефалоспорины, флуоресцентный краситель ДСМ.
Флуоресцентный краситель [4-(п-диметиламинос-тирил) — 1 метилпиридиний], или сокращенно ДСМ, в физрастворе является катионом, который легко проникает в живые клетки, их органеллы, и окрашивает их. Краситель известен с 1981г., когда были подробно изучены его флуоресцентные свойства на примерах различных живых объектов — одноклеточных, эмбрионе морского ежа, лимфоцитов и других клеток в культуре [1,3]. Там же было показано, что этот флуо-рохром является потенциалозависимым, т.е. чем ярче светит клетка, тем больший мембранный потенциал она имеет. Считаем, что этот витальный краситель ДСМ незаслуженно забыт, и в работе [2] выявили, что он может успешно отражать тонкие мембранные процессы в живой клеточной культуре.
Изучали флуоресцентные свойства живых клеток опухоли предстательной железы. Клетки прижизненно окрашивали различными витальными флуоресцентными красителями, в т. ч. и ДСМ. При исследовании под микроскопом «Axio Imager.M2» (Zeiss) взаимодействия антибиотика медоцефа и цефтри-аксона-Д (цефалоспорины 3-го поколения) с флуоресцирующими клетками опухоли предстательной железы (умеренно-дифференцированная аденокар-
цинома) авторы наблюдали черные капли размерами от 2 до10 мкм на фоне «ярких» клеток аденокар-циномы.
Материалы и методы исследования
Исследование проводили с помощью потенциало-зависимого флуоресцентного зонда катиона ДСМ (п-толуолсульфонат 4-(п-диметиламиностирил) -1 ме-тилпиридиний) (синтезирован НИИФОХ при ЮФУ). Флуоресценцию ДСМ возбуждали светом длиной волны 450 nm, а длина волны эмиссии ДСМ была 520 nm. Конечная концентрация ДСМ в препарате клеточной суспензии была 20 мкм. Препараты для мик-роскопирования готовили на предметных стеклах в капле объемом 100 мкл раствора Хенкса, осторожно выдавливая микрошпателем клетки из аспира-ционного пунктата опухоли. Аспирационный пунк-тат опухоли весом от 0.5 до 2 г сначала инкубировали в физиологическом растворе с цефалоспоринами в концентрации 1 мг/мл в течение 10—20 мин. Затем «ниточку» пунктата извлекали из физраствора с антибиотиком пинцетом и помещали в каплю объемом 100 мкл раствора Хенкса для получения клеток выдавливанием. Клеточную взвесь отбирали пипеткой и помещали на предметные стекла в каплю разведенного на физиологическом растворе красителя ДСМ, накрывали покровным стеклом, инкубировали каждый препарат с зондом ДСМ до микроскопирования 10 минут. Микросъемку производили на максимально возможном увеличении (х1000) цветной цифровой камерой AxioCam HRc, а измерения проводили на люминесцентном микроскопе «Axio Imager. M2» (Zeiss) с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8.
Результаты исследований и их обсуждение
Флуоресценция ДСМ в клетке полихроматична: цитоплазма зеленая, ядро оранжевое, ядрышки желтые или светло-оранжевые, митохондрии — желтые. Клетки аденокарциномы предстательной железы в этой витальной окраске можно легко морфологически идентифицировать, они имели различный характер распределения митохондрий в цитоплазме.
О.В. Тарнопольская и соавт. Визуализация взаимодействия цефалоспоринов с клетками аденокарциномы.
В некоторых клетках (примерно, третья часть) митохондрии были хаотично распределены по клетке, желтые зерна митохондрий выделялись на фоне зеленой цитоплазмы. Другая часть клеток имела четкие области скоплений митохондрий и некоторые отдельные зернышки в цитоплазме. Проникая в клетку, молекулы флуоресцентного зонда-катиона ДСМ связываются с отрицательно заряженными мембранами внутриклеточных органелл — ядром, митохондриями, и т.д. Чем выше отрицательный заряд области связывания, тем ярче эта область флуоресцирует. Клеточная мембрана и ядерная мембрана с внутренней стороны заряжена отрицательно. Катион ДСМ связывается с мембранами самой клетки, ядра, клеточных органелл, и после связывания в ответ на падающий от ртутной лампы свет возбуждения испускает отраженный свет, который регистрируется цифровой камерой микроскопа. Полученное изображение подается на монитор компьютера. На рис. 1 (все рис. см. вклейку 3) показаны живые клетки аденокарциномы предстательной железы, экспрес-сирующие ДСМ. На этом снимке нет цефалоспори-нов, пунктат не инкубировали с антибиотиками. На рис. 2—6 показаны эти же клетки с черными каплями цефалорспорина. Пунктат, из которого получены эти клетки, инкубировали с медоцефом или цефт-риаксоном D. Капли имеют размер от 2 до 10 мкм и, по-видимому, состоят из липидной оболочки, гидро-фобны, остаются в виде капель, имеют черный цвет (активно поглощают свет длиной волны 450 нм). Наблюдение за каплями показало, что эти капли достаточно быстро (от 1 до 5 минут) проникают в клетку, затем в ядро, ядро при этом уменьшает яркость свечения, становясь бурым. В других случаях эти черные капли в цитоплазме не доходят до ядра, вакуолизи-руются, темные вакуоли располагаются вокруг ядра (рис. 5, 6). При рутинной цитологической окраске по
Паппенгейму цефалоспорины не визуализируются. На рис. 7 показана структурная формула флуоресцентного зонда ДСМ.
Такие же черные капли цефалоспоринов наблюдали в клеточной взвеси поджелудочной железы и в клетках эпителия слизистой оболочки полости рта, которые окрашивали ДСМ после предварительной 10-минутной инкубации с цефалоспориновым антибиотиком.
Выводы:
Прижизненное окрашивание клеток флуоресцентным красителем ДСМ помимо хорошего выявления морфологии всей клетки и ее органелл (митохондрий), ядер позволяет визуализировать наличие в клеточной взвеси цефалоспоринов в виде черных капель.
Литература
1. Добрецов Г.Е., КосниковВ.В., Морозова Г.А., Лихачева Л.М., Айдыралиев Р.К., Владимиров Ю.А.
Измерение градиента концентрации флуоресцентного зонда-катиона ДСМ [4-(п-диметиламиности-рил) -1 метилпиридиния] на плазматической и мито-хондриальной мембранах лимфоцита. Биологические мембраны, 1986;3(3):266-74.
2. Златник Е.Ю., Тарнопольская О.В., Передрее-
ва Л.В. Влияние наночастиц цинка и железа на мембранный потенциал лимфоцитов in vitro. Матер. IV Международной научной конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 22.09.2011г., Ростов-на-Дону.
3. Морозова Г.А., Добрецов Г.Е., Дубур Г.Я., Дубу-ре Р.Р., Голицын В.М., Баренбойм Г.М., Владимиров Ю.А. Флуоресценция [4-(п-диметиламиности-рил) -1 метилпиридиния] в живой клетке. Цитология, 1981,23(8):916-23.
VISUALISATION OF INTERACTION CEPHALOSPORINES WITH CELLS OF PROSTATE ADENOCARCINOMA IN PUNCTATE BY FLYORESCENCE DYE - DSM
Tarnopolskaya O.V., Nepomnyashaya E.M., Sergan V.A.
Observation of cells of prostatic adenocarcinoma punctate that were vitally stained by fluorescent dye DSM [4-(n-dimeth-ylaminostiryl-1-methylpyridinium)] has been allowed to see cephalosporin antibiotic. The third generation of cephalosporin antibiotic had the appearance of black drops. The size of these drops was approximately equal to size of cell nucleus. The whole- cell fluorescence of DSM is the polychromatic: cytoplas-
ma is green, cell nuclei are orange, nucleoli — yellow, mitochondria — yellow. The process of penetration of the cephalosporin black drops inside of epithelial cells of prostatic adenocarcinoma has been observed. The cephalosporin black drops inside of cells divided into small vacuoles, then dissolve in the cytoplasm. Also, the cephalosporin black drops inside of cells can penetrate in nucleus that makes it dark.
АВТОРЫ:
Тарнопольская О.В. — ведущий научн. сотр., канд. физико-математических наук; Непомнящая Е. М. — научн. рук. ПАО, доктор мед. наук, проф.; Сергань В.А. — аспирант института.
