CC BY
46
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© Царева, О.А., Рахманкина М.А., 2016 УДК 611.444-о18.1:616.441-008.64
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИРОЦИТОВ И С-КЛЕТОК ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ГИПОФУНКЦИИ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ВВЕДЕНИЕМ АКТИНОМИЦИНА D
О.А. Царева, М.А. Рахманкина
Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, ул. Высоковольтная, 9, 390026, г. Рязань, Российская Федерация
В экспериментах на лабораторных животных с помощью радиоиммунологического и электронномикроскопического методов исследования изучены тиреоидный статус и ультраструктура тироцитов и С-клеток щитовидной железы при гипофункции индуцированной введением актиномицина D. На тканевом уровне получено подтверждение гипофункции щитовидной железы. Проведены морфометрические исследования ядерного аппарата и органелл цитоплазмы тироцитов и С-клеток. Доля инертного гетерохроматина в ядре снижается, ядрышки уменьшаются в размере и утрачивают ячеистую структуру. Отмечаются изменения со стороны вакуолярно-лизосомальной системы. Установлено наличие синергизма в действии актиномици-на D и трийодтиронина на тироциты. Выявлены ультраструктурные изменения, которые нарушают биосинтез и транспорт йодтиронинов в тироцитах и биосинтез кальцитонина и соматостатина в С-клетках.
Ключевые слова: тироциты, С-клетки, крысы, гипофункция, актиномицин D, трийодтиронин.
MORPHOFUNCTIONAL CHANGES OF THYROID GLAND THYROCYTES AND C-CELLS IN HYPOTHYROIDISM INDUCED BY ACTINOMYCIN D ADMINISTRATION
O.A. Tsareva, V.A. Rakhmankina
Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov, Vysocovoltnaya str., 9, 390026, Ryazan, Russian Federation
Thyroidin status and thyrocyte ultrastructure of thyroid gland in case of hypofunc-tion induced by introduction of aktinomicin D were studied in the corse of experiments on laboratory animals using radioimmunologic and electronomicroscopic techniques. Confirmation of hypothyroidism was obtained at the tissue level. Morphometric studies of the nuclear apparatus and organelles of thyrocytes and C-cells cytoplasm were held. The proportion of inert heterochromatin in the nucleus is reduced, and the nucleoli decrease in size and lose their cellular structure. Changes occur in vacuolar-lysosomal system. The presence of synergism in the action of actinomycin D and triiodothyronine on thyrocytes. The
ultrastructural changes violating biosynthesis and triiodothyronine transportation in thy-rocytes and biosynthesis of somatostatin and calcitonin in C-cells were discovered.
Keywords: thyrocytes, C-cells, rats, hypothyroidism, actinomycin D, triiodothyronine.
В последние десятилетия интерес к изучению структурных и функциональных особенностей желез внутренней секреции неизменно растет, не только в связи с выявлением новых механизмов влияния эндокринной системы на жизненно важные процессы живых организмов, но и из-за ухудшения экологической ситуации в мире, приводящей к тому, что изменяется роль гормонов и гормоноподобных веществ в регуляции метаболических процессов. Известно, что нарушение процессов гормональной регуляции приводит к серьезным последствиям с развитием тяжелых эндокринных заболеваний [1, 2, 3, 4]. Многообразие и сложность эндокринной регуляции и вариабельность патологии делают актуальными исследования в данной области.
Материалы и методы
Работа выполнена на 20 половозрелых белых нелинейных крысах самцах массой 210-230 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Первой группе животных вводили актиномицин D (АмD) (Renal) четырехкратно в/брюшинно в разовой дозе 0,2 мг/кг с интервалом в 12 часов. Контролем служили крысы, которым вводили в те же сроки растворитель 5% этанол. Второй группе животных на фоне инъекций экзогенного трийодтиронина (Т3) (Sigma) в разовой дозе 100 мкг в течение 7 суток на 6, 7 сутки от начала эксперимента осуществляли введение той же дозы АмD. Контролем служили крысы, которым вводили в те же сроки растворитель 0,025 М NaOH и растворитель 5% этанол. Эвтаназию крыс осуществляли углекислым газом в течение 15-20 мин через 24 часа от последней инъекции [5].
Уровень гормонов исследовался в ЦНИЛ РязГМУ в день забоя. Кровь отбиралась из брюшной аорты и отстаивалась до получения сыворотки. Уровень Т3, Т4, ТТГ измеряли радиоиммунным методом.
Для исследования на тканевом уровне изготавливали гистологические препараты, которые окрашивали гематоксилин-эозином.
Исследования на клеточном уровне проводили под электронным микроскопом ЭМ-125К. Кусочки щитовидной железы размером 1х1 мм фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида при 4°С 4 часа. Материал обрабатывали по стандартной методике, изготавливали ультратонкие срезы и изучали при увеличении 6000, 10000, 15000.
Обработку информации для ультраструктурной морфометрии проводили на компьютере с помощью автоматизированной системы для измерения колориметрических, денситометрических и мор-фометрических параметров медико-биологических объектов [6, 2, 7]. По каждой серии опытов обрабатывали по 10 электронограмм. Определяли среднюю относительную площадь ядра, ядрышка, эухроматина и гетерохроматина. Вычисляли ядрышко-ядерное соотношение и соотношение эухроматина и гетерохромати-на в ядре. Ультраструктурную морфомет-рию электронно-плотных гранул проводили на электроннограммах при увеличении 10000. По каждой серии опытов обрабатывали по 10 электронограмм.
Результаты исследований обработаны методом вариационной статистики. Вычисления проводились на компьютере с использованием прикладных программ «Statistic», «SigmaPlot». Анализировали характер распределения данных. Применялась параметрическая описательная статистика, рассчитывались: среднее (М) и среднеквад-ратическая ошибка (m). Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюден-та. Вероятность р<0,05 считали достаточной для вывода о достоверности различий между вариационными рядами.
Результаты и их обсуждение
Радиоиммунологическое исследование уровня тиреоидных гормонов и ти-реотропина в сыворотке крови животных первой и второй группы указывает на то, что введение АмD по описанной схеме вызывает гипофункцию щитовидной железы. Для первой группы наиболее выраженное изменение претерпевает концентрация ТТГ, при этом обнаруживается достоверное понижение уровня гормона
на 57,9% по сравнению с контролем. Уровень Т4 снижается на 38,85%, уровень Т3 снижается менее выражено - на 4,54%. Для второй группы уровень ТТГ снижается в 17 раз, уровень Т4 снижается на 49%, уровень Т3 снижается менее выражено -на 52%. Полученные данные свидетельствуют о значительном понижении секреции ТТГ и одновременном выраженном торможении образовании Т3 и Т4 (табл. 1).
Таблица1
Изменение тиреоидного статуса крыс при введении актиномицина Б и актиномицина Б на фоне курсового введения трийодтиронина
Масса тела, г М±т Масса железы, г М±т Концентрация гормонов в сыворотке крови
Серия Т3, нмоль/л М±т Т4, нмоль/л М±т ТТГМЕД/л М±т
Контроль(п=10) 207±3,28 30,4±0,92 1,977±0,044 28,86±1,253 1,524±0,015
АмБ (п=10) 191,8±2,44 28±1,23 1,098±0,07 17,66±2,049 0,14±0,03
р<0,01 р<0,001 р<0,05 р<0,001
АмБ+ Т3 181,5±5,07 25,8±1,65 0,958±0,09 14,68±1,09 0,09±0,01
(п=10) р<0,01 р<0,001 р<0,01 р<0,001
Гипофункциональное состояние щитовидной железы подтверждается при гистологическом исследовании. На препаратах щитовидной железы животных первой и второй группы отмечается преобладание мелких фолликулов, с выраженной резорбцией коллоида. Сеть капилляров в рыхлой волокнистой соединительной ткани, окружающей фолликулы, хорошо развита. С-клетки локализованы в центральных участках железы, в прослойках соединительной ткани между фолликулами, или в стенке фолликулов и имеют типичную полигональную или вытянутую форму. Средняя площадь С-клеток достоверно не изменяется.
При морфометрическом исследовании щитовидной железы животных первой группы отмечается достоверное уменьшение высоты тиреоидного эпителия приблизительно на 25%. Показатель функциональной активности щитовидной железы - индекс накопления достоверно увеличивается на 36%. Наиболее существенные изменения, свидетельствующие о гипофункции щитовидной железы, отмечаются при проведении соответствующих исследований для животных второй группы. Отмечается достоверное уменьшение высоты тиреоидного эпителия приблизительно на 32%, индекс накопления достоверно увеличивается на 68% (табл. 2).
Таблица 2
Морфометрическая характеристика функциональной активности фолликула щитовидной железы при экспериментальной гипофункции
Серия Средняя площадь фолликула, мкм2 М±т Высота эпителия фолликула, мкм М±т Индекс накопления М±т
Контроль(п=10) 1701,2±15,498 1,3±2,058 1,76±0,068
АмБ (п=10) 1556,1±10,651 0,95±1,581 р<0,05 2,40±0,272 р<0,01
АмБ+ Т3 (п=10) 1510,3±12,851 0,89±1,595 р<0,05 2,96±0,083 р<0,01
При электронно-микроскопическом исследовании в тироцитах и С-клетках у животных на фоне введения АмD ядра приобретают извилистые, неровные контуры. Отмечается расширение перинуклеарного пространства. Возрастает количество ком-пактизированного хроматина, который в виде глыбок располагается под кариолем-мой. По данным морфометрии величина соотношения площадей эухроматина и ге-терохроматина в тироцитах и С-клетках статистически достоверно уменьшается почти в два раза (табл. 3). Наружная мембрана кариолеммы практически лишена рибосом. Ядрышки уменьшены в размерах, утрачивают ячеистую структуру, приобре-
Сходные ультраструктурные изменения обнаружены при изучении ультраструктуры гепатоцитов крыс и клеток гипо-кампа при введении данного препарата [4, 8]. По-видимому, причиной прекращения синтеза РНК, а в следствие этого и биосинтеза белка в клетке с одной стороны может служить отделение хроматина от ядрышка. С другой - способность АмD образовывать комплексы с гуанин содержащими участками ДНК клеток, что подавляет матричную активность последней. Подавляющее действие на РНК обусловлено ингибирова-нием РНК-полимеразы посредствам связывания поверхностей матрицы.
На ультраструктурном уровне в цитоплазме тироцитов первой группы жи-
тают вид гомогенных телец овальной или округлой формы. При этом статистически достоверно на 30% уменьшается ядерно-ядрышковое соотношение. Полученные результаты указывают на то, что точкой приложения токсического эффекта АмD является ядерный аппарат тироцитов и С-клеток. Эти ультраструктурные изменения в ядерном аппарате тироцитов влияют на вакуолярно-лизосомальную систему, нарушают биосинтез и транспорт йодтиронинов, в С-клетках нарушается синтез олигопеп-тидных гормонов [8]. Однако, сочетанное ведение Т3, по-видимому, не оказывает дополнительного действия на ядерный аппарат как тироцитов, так и С-клеток.
вотных определяется уменьшение гранулярной эндоплазматической сети с уменьшением плотности расположения рибосом на ее мембранах. В ряде тироци-тов обнаруживаются митохондрии с частично редуцированными кристами. Комплекс Гольджи представлен отдельными диктиасомами и единичными микропузырьками, расположенными в цитоплазме в виде мелких групп и окруженными свободными рибосомами. Уменьшается количество и величина микроворсинок на апикальной поверхности. Коллоидные капли немногочисленны. Обнаруживается уменьшение количества первичных лизо-сом с преимущественной их локализацией в среднем отделе цитоплазмы (в контроле
Таблица 3
Ультроструктурная морфометрия ядерного аппарата клеток щитовидной желеы при введении актиномицина Б и актиномицина Б на фоне курсового введения трийодтиронина
Тироциты С-клетки
Серия Ядрышко-ядерное соотношение, М±т Соотношение площадей эу- и гете-рохроматина, М±т Ядрышко -ядерное соотношение, М±т Соотношение площадей эу- и гетеро-хроматина, М±т
Контроль 0,048±0,05 1,697±0,155 0,038±0,002 1,712±0,05
(п=10)
АмБ 0,033±0,004 0,88±0,05 0,028±0,05 0,81±0,05
(п=10) р<0,05 р<0,001 р<0,05 р<0,001
АмБ+ Т3 0,027±0,002 0,806±0,062 0,029±0,01 0,809±0,01
(п=10) р<0,01 р<0,01 р<0,01 р<0,01
в апикальном отделе). Увеличивается количество вторичных лизосом с гомо- и гетерогенным содержимым. Данные изменения в вакуолярно-лизосомальной системе свидетельствуют о нарушении процессов гормонального синтеза. Ба-зальная мембрана содержит незначительное число инвагинаций. Цитоплазма эндо-телиальных клеток сосудов микроцирку-ляторного русла практически лишена пи-ноцитозных пузырьков, что свидетельствует о низкой пиноцитозной активности. При исследовании кальцитониноцитов первой группы животных отмечается частичная редукция гранулярной эндоплаз-матической сети, Комплекс Гольджи частично редуцирован. Число митохондрий в клетке практически не изменяется. Отмечается уменьшение числа электронно-плотных гранул в цитоплазме на - 17,8%, но их содержимое остается мелкозернистым и гомогенным как в норме.
В тироцитах второй группы животных наблюдаются более выраженные ги-пофункциональные изменения. Отмечается практическое отсутствие гранулярной эн-доплазматической сети, а агранулярная эндоплазматическая сеть вакуолизирована. Свободные рибосомы в цитоплазме тиро-цитов немногочисленны. Комплекс Гольджи практически редуцирован. Между ва-куолизированными канальцами эндоплаз-матической сети обнаруживаются очаговые скопления мелких митохондрий с неплотно упакованными кристами. Степень активности трансцеллюлярного обмена вешеств между фолликулами щитовидной железы и компонентами микроциркуля-торного русла находится на весьма низком уровне, о чем свидетельствует гладкий рельеф базальной мембраны большинства фолликулов и незначительное число пино-цитозных пузырьков в цитоплазме эндоте-лиальных клеток. Полученные результаты указывают на наличие синергизма в действии АмБ и Т3, что весьма вероятно, если принимать во внимание способность дан-
ного гормона ингибировать синтез ТТГ на уровне транскрипции. В С-клетках второй группы животных гипофункциональные изменения не усиливаются по сравнению с первой группой. На фоне частичной редукции гранулярной эндоплазматической сети уменьшается число и плотность распределения рибосом на ее мембранах по сравнению с контролем. В околоядерной зоне отмечаются хорошо выраженные канальцы гладкой эндоплазматической сети. Комплекс Гольджи частично редуцирован. Число митохондрий в клетке практически не изменяется, распределение их в цитоплазме равномерно. Отмечается уменьшение числа секреторных гранул, аргофилия и метахро-матизация цитоплазмы снижается.
Выводы
Введение актиномицина D вызывает в ядрах клеток щитовидной железы увеличение доли инертного гетерохроматина и сегрегацию ядрышек. Эти ультраструктурные изменения в ядерном аппарате тироцитов влияют на вакуолярно-лизосома-льную систему, нарушают биосинтез и транспорт йодтиронинов и, в конечном итоге, ведут к гипофункции щитовидной железы, характеризующейся понижением гормонального уровня в крови экспериментальных животных. При сочетанном введении актиноми-цина D и трийодтиронина отмечается тенденция к усилению гипофункциональных изменений, что может свидетельствовать о наличии синергизма в действии этих веществ на тироциты.
Введение актиномицина D вызывает сходные изменения в ядерном аппарате С-клеток. Происходит ингибирование биосинтеза белка на уровне транскрипции, которое нарушает биосинтез кальцитонина и сомато-статина, нарушается синтез, накопление и декарбоксилирование различных биогенных аминов, которые способны к местной регуляции кальцитонина. При сочетанном введении актиномицина D и трийодтиронина в С-клетках не отмечается тенденция к усилению гипофункциональных изменений.
Конфликт интересов отсутствует.
Литература
1. Андреева И.В., Виноградов А.А. Пер- 1 спективы использования современных методов визуализации в морфологических и экспериментальных исследованиях // Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2015. №4. С. 17-26.
2. Андроник В.И., Мельник Б.Е. Качественно-количественная характеристика структуры тиреоцитов (при экспериментальной гипер- и гипофункции). 2 Кишинев: Штиинца, 1986. 136 с.
3. Аристархов В.Г., Данилов Н.В. Отдаленные результаты оперативного лечения доброкачественных образований щитовидной железы у пожилых пациентов // Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2014. №1. С. 103-106. 3
4. Beekman R.E., van Hardeveld C., Simonides W.S. On the mechanism of the reduction by thyroid hormone of beta-adrenic relaxation rate stimulation in the rat herart // Biochem J. 1989. Vol. 259, №l. P. 229-236.
5. Полоз А.И., Финогенов А.Ю. Методические указания по гуманной эвтаназии животных. Минск: РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. 4 С.Н. Вышелесского», 2008. 45 c.
6. Автандилов Г.Г. Медицинская мор-фометрия: руководство. Москва: Медицина, 1990. 84 с.
7. Титова М.А. Морфофункциональная 5 характеристика С-клеток щитовидной железы в онтогенезе и эксперименте: автореф. дис. ... канд. биол. наук. Саранск, 2003. 17 с.
8. Агладзе А.Г., Челидзе П.В. Ультраструктура ядрышка и ядрышкообра- 6 зующих районов при действии ингибиторов синтеза РНК (актиномицин D
и амфотерицин). В кн.: Реактивность 7 клеточных органелл: материалы симпозиума (Тбилиси 19-21 апр.). Тбилиси, 1984. С. 17-22.
References
Andreeva IV, Vinogradov AA. Perspek-tivy ispol'zovanija sovremennyh meto-dov vizualizacii v morfologicheskih i jeksperimental'nyh issledovanijah [Perspective of use of modern imaging techniques in morphologic and experimental studies]. Nauka molodyh (Eruditio Juve-nium) [Science of young (Eruditio Juve-nium)]. 2015; 4: 17-26. Andronik VI, Mel'nikB E. Kachestven-no-kolichestvennaja harakteristika struk-tury tireocitov (pri jeksperimental'noj giper- i gipofunkcii) [Qualitative and quantitative characterization of the structure of thyrocytes (in experimental Hyper- and hypofunction)]. Kishinev: Shtiintsa; 1986. 136 p. Aristarhov VG, Danilov NV. Otdalennye rezul'taty operativnogo lechenija dobro-kachestvennyh obrazovanij shhitovidnoj zhelezy u pozhilyh pacientov [Long-term results of surgical treatment of benign lesions of the thyroid gland in elderly patients]. Rossiyskij mediko-biolo-gicheskij vestnik imeni akademika I.P. Pavlova [I.P. Pavlov Russian Medical Biological Herald]. 2014; 1: 103-106. Beekman RE, van Hardeveld C, Simonides WS. On the mechanism of the reduction by thyroid hormone of beta-adrenic relaxation rate stimulation in the rat herart. Biochem J. 1989; 259 (l): 229-236. Poloz AI, Finogenov AJu. Metodicheskie ukazanija po gumannoj jevtanazii zhi-votnyh [Guidelines for humane euthanasia of animals]. Minsk: RUE «Institute of experimental veterinary medicine named. S.N. Wirelessrage»; 2008. 45 p. Avtandilov GG. Medicinskaja morfometri-ja: rukovodstvo [Medical morphometry: guide]. Moscow: Medicine; 1990. 84 p. Titova MA. Morfofunkcional'naja ha-rakteristika S-kletok shhitovidnoj zhe-lezy v ontogeneze i jeksperimente: avto-ref. dis. ... kand. biol. nauk [Morpho-
functional characteristic of thyroid C-cell ontogenesis and experiment: abstract. dis. ... cand. biol. sciences]. Saransk; 2003. 17 p.
8. Agladze AG, Chelidze PV. Ul'trastruktu-ra jadryshka i jadryshkoobrazujushhih rajonov pri dejstvii ingibitorov sinteza RNK (aktinomicin D i amfotericin). V
kn.: Reaktivnost' kletochnyh organell: materialy simpoziuma. In: Ultrastructure of the nucleolus and NORS regions in dataii inhibitors of RNA synthesis (actinomycin D and amphotericin)] [Reactivity œll organelles: proceedings of the: symposium] (Tbilisi, 19-21 apr.). Tbilisi; 1984. p. 17-22.
Царева О. А. - к.б.н., доцент кафедры гистологии и биологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
Е-mail: tsareva. oksana1966@yandex. ru
Рахманкина М.А. - ассистент кафедры гистологии и биологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.
