CC BY
236
УДК: 698:616-084
Дубинська Г. М., Прийменко Н. О., ¡зюмська О.М., Руденко С.С., Артемьева О.В. ВИЗНАЧЕННЯ 1МУНОЛОГ1ЧНО1 ЕФЕКТИВНОСТ1 СПЕЦИФ1ЧНО1 ПРОФ1ЛАКТИКИ ГРИПУ В ОС1Б 13 ПОЛ1МОРФ1ЗМОМ ГЕН1В TLR-2, TLR-3, TLR-4
ВДНЗУ «Укра1нська медична стоматолопчна академiя», м. Полтава Полтавський базовий медичний коледж
Метою досл'дження було вивчення ефективностi вакцинаци проти грипу в осб iз пол1'морф1'змом Arg753Gln гену TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4. Провакциновано 66 оаб i3 мутантними генотипами та нормальним розподлом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4, вком в'д 18 до 63 рок'т. Встановлено зростання в'дсотку осб i3 протективним титром до всх штам'т грипу як серед вакцинованих i3 мутантними генотипами, так i з нормальним розподлом алелей tLr-2, TLR-3, TLR-4 незалежно в'д початкового р'тня протигрипозних антитл. Рiвень сероконверси в оаб iз пол1'морфнозм1'неними генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 в'дпов'дав показникам вакцинованих iз нормальним розподтом алелей TLR, а до штаму A/H1N1 був вiрогiдно вищим. Проведений аналiз антитлоутворення показав, що особи з мутантними генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 мають вакцинальну вдповдь на р'тш обстежених iз нормальним розподлом алелей TLR, що дозволяе розглядати вакцинацю проти грипу як ефективний метод профлактики ГРВ1 у носив мутацй в генах досл'джуваних TLR. Ключов1 слова: вакцинац1я, грип, пол1морф1зм, генотип, титр, антитша.
В останн роки багато уваги придтяеться спец^чнш профшактиц грипу, особливо в групах ризику, схильних до тяжкого переб^у захворювання. 1нтенсивнють та характер iмунноT вщпов^д при вакцинаци залежить вщ функцюнального стану iмунноT системи [1]. Вщомо, що генетична варiабельнiсть TLR може в^гравати важливу роль в розтзнаванш патоген-асоцшованих молекулярних структур i змшювати iмунну вщповщь як на шфекцшы агенти, так i вакцинацш [2, 3]. На сьогодн встановлено, що в розтзнаванш структурних бтш вiрусу грипу залучен TLR-2 i TLR-4,
вiрусноT РНК - TLR-3 [4, 5, 6, 7], а також виявлено асо^ацш полiморфiзмiв Arg753Gln гену TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4 iз розвитком грипу та грип-асоцшованот пневмони [8]. Тому вивчення iмунноT вщпов^д на вакцинацiю проти грипу в оаб iз генетичним полiморфiзмом Arg753Gln гену TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4 е актуальним завданням.
Мета дослщження
Вивчити ефективнiсть вакцинаци проти грипу в оаб iз полiморфiзмом Arg753Gln гену TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4.
Мaтерiaли та методи
Для досягнення поставлено!' мети було провакциновано 66 оаб вком вщ 18 до 63 рош (середнш - 31,2±1,48), жшок - 48 (72,7%), чоловiкiв - 18 (27,3%). За генотипом вакцинован були розподтеы наступним чином: iз Leu/Phe TLR-3 - 23, Phe/Phe TLR-3, Asp/Gly TLR-4 та комбша^ею
мутантних генотипiв дослiджуваних TLR - по 6, Arg/Gln TLR-2 - 5 оаб. Отриман результати порiвнювали з даними 20 здорових iз нормальним розподтом алелей гешв TLR-2, TLR-3, TLR-4 рiвноцiнними за статтю i вiком. Всi обстеженi вакцинувалися проти грипу вперше.
Вакцинацiю проводили за стандартною методикою вакциною 1нфлювак (Solvay Pharmaceuticals, Нiдерланди) пiсля пщписання iнформованоT згоди та огляду лкаря.
1мунну вiдповiдь на вакцинацiю оцшювали в реакцiT гальмування гемаглютинацiT (РГГА) на основi дослiдження парних сироваток кров^ зiбраних до iмунiзацiT та через 28 дшв пiсля введення вакцини. Постановку РГГА проводили за стандартною методикою з використанням дiагностикумiв «Диагностикумы гриппозные для реакции торможения гемагглютинации сухие» ООО «Предприятие по производству диагностических препаратов» (Россия).
1мунолопчну ефективнють вакцинаци оцшювали по сероконверси (число прироспв специфiчних титрiв антитт в 4 рази i бтьше), серопротекцiT (вiдсоток осiб iз титрами 1:40 i вище пiсля вакцинаци) та динамiцi рiвня середнiх геометричних титрiв антитiл. При аналiзi враховували початковий рiвень протигрипозних антитiл.
Полiморфну дiлянку Arg753Gln гену TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4 генотипували методом полiмеразноT ланцюгово1 реакцiT з використанням ол^онуклеотидних праймерiв. Амплiфiкацiя проведена на амплiфiкаторi «Терцик» («дНк-Технологiя», Росiя).
Математичну обробку отриманих даних проводили з використанням програми «STATISTICA for Windows7.0» (StatSoft Inc, США) та електронних таблиць MS Excel. Вiрогiднiсть вщмшностей результат дослiджень для груп обстежених визначали за допомогою t-критерш Стьюдента. При порiвняннi частот бiнарних ознак в двох пов'язаних групах використовували критерш Мак-Немара,
в шших випадках - точний критерш Фшера. Для Bcix видiв аналiзу статистично значимими вважали вiдмiнностi при р<0,05.
Результати дослiджень та 1х обговорення
Проведенi дослiдження показали, що стан iмунiтету до вакцинацп в ycix групах обстежених характеризувався високим рiвнем серопротекцй з найвищим показником захищеност в осiб i3 мутантним гомозиготним генотипом Phe/Phe TLR-3, гетерозиготним Asp/Gly TLR-4 та комбiнацieю
мутацш в генах TLR-2, TLR-3, TLR-4 - 83,3%-100,0% до всiх вакцинних штамiв. До вакцинацй' серонегативними виявилися особи з нормальним розподтом алелей дослщжуваних TLR (A/H1N1 та A/H3N2 - по 10,0%, В - 5,0%) та гетерозиготним генотипом Leu/Phe TLR-3 (A/H1N1 - 17,4%, В -4,3%).
При дослщженн iмунологiчно''' ефективност вакцинацй встановлено, що через 28 дшв пiсля iмунiзацп в^^чалося наростання вiдсотка осiб iз захисним титром антитт в усiх групах вакцинованих, незалежно вщ початкового рiвня протигрипозних антитiл. Так пiсля вакцинацй' вщсоток осiб iз захисними титрами антитт серед тих, що мали довакцинальний рiвень < 1:20 склав:
iз нормальним розподiлом алелей TLR до серотипу A/H1N1 - 80,0%, A/H3N2 - 50,0%, iз генотипом
Leu/Phe TLR-3 до A/H1N1 - 100,0%, A/H3N2 - 75,0%, В - 33,3%. Слщ вщм^ити, що серед обстежених iз мутантними генотипами Phe/Phe TLR-3, Asp/Gly TLR-4, Arg/Gln TLR-2 та комбша^ями мутацш в генах TLR-2, TLR-3, TLR-4 особи iз початковим титром < 1:20 визначалися лише до окремих штамiв вiрусу грипу, при цьому вони стовщсотково мали протективний рiвень специфiчних антитiл пiсля вакцинацп. За рiвнем серопротекцй особи iз мутантними генотипами та нормальним розподтом алелей TLR-2, tLr-3, TLR-4 з низьким початковим титром антитт (< 1:20) достовiрно не рiзнилися.
При дослiдженнi рiвня серопротекцй в групах обстежених загалом (незалежно вщ початкового рiвня протигрипозних антитт) до та через 28 дшв шсля вакцинацп встановлено зростання вщсотку осiб iз протективним титром до вах штамiв грипу як серед вакцинованих iз мутантними генотипами, так i з нормальним розподтом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4. При цьому достовiрно вищим рiвень серопротекцй виявився до серотипу A/H1N1 в оаб iз нормальним розподiлом алелей TLR
(95,0±4,9, до вакцинацп - 75,0±9,7, р<0,05) та генотипом Leu/Phe TLR-3 (100,0±2,1, до вакцинацй' -69,6±9,6, р<0,005), з тенденцieю до вiрогiдностi до серотипу A/H3N2 в оаб з Leu/Phe TLR-3 (95,6±4,3, до вакцинацп - 82,6±7,9, р<0,1) i A/H1N1 - з генотипом Arg/Gln TLR-2 (100,0±4,5, до
вакцинацп - 60,0±21,9, р<0,1).
Аналiз рiвня сероконверсп показав, що вакцинальна вщповщь в осiб iз полiморфнозмiненими генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 не залежала вщ початкового рiвня специфiчних антитт та визначалася на рiвнi вакцинованих iз нормальним розподiлом алелей TLR, а до штаму A/H1N1 виявилася нав^ь вiрогiдно вищою. Так за рiвнем сероконверсп вакцинованi iз мутантними генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 та нормальним розподтом алелей TLR iз початковим титром специфiчних антитiл < 1:20 мiж собою достовiрно не рiзнилися. Виключення склали особи iз генотипом Leu/Phe TLR-3, в яких показник 4-х кратного приросту антитт до серотипу A/H1N1 склав 100,0% проти 40,0% (р=0,04) у вакцинованих iз нормальним розподтом алелей TLR. Встановлено вщсутнють iмунноl вiдповiдi до штаму грипу В в оаб iз генотипом Leu/Phe TLR-3, проте аналопчний результат отриманий i в обстежених iз нормальним розподiлом алелей TLR. У вакцинованих iз мутантними генотипами Phe/Phe TLR-3, Asp/Gly TLR-4, Arg/Gln TLR-2 та '''хньою комбша^ею, як мали початковий титр < 1:20 до окремих штамiв грипу стовщсотково отримана сероконверая (табл.1.).
Таблиця 1.
Ревень сероконверсп в oci6 iз мутантними генотипами та нормальним розподлом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4 з титром
антитл до вакцинацп < 1:20 та > 1:40, абс. число (%)
Генотипи TLR Серотипи вiрусу грипу Юльюсть осiб ia титром < 1:20 до вакцинацй' Юльюсть оЫб iз серокон верЫею Юльюсть оЫб iз титром > 1:40 до вакцинацй' Юльюсть оЫб iз серокон верЫею
абс. % абс. % абс. % абс. %
Нормальний розподт алелей TLR (n=20) A/H1N1 5 25,0 2 40,0 15 75,0 3 20,0
A/H3N2 4 20,0 2 50,0 16 80,0 3 18,7
В 2 10,0 0 0,0 18 90,0 7 38,9
Leu/Phe TLR-3 (n=23) A/H1N1 7 30,4 7 100,0* 16 69,6 8 50,0
A/H3N2 4 17,4 1 25,0 19 82,6 7 36,8
В 6 26,1 0 0,0 17 73,9 3 17,6
Phe/Phe TLR-3 (n=6) A/H1N1 0 0,0 0 0,0 6 100,0 4 66,7
A/H3N2 0 0,0 0 0,0 6 100,0 2 33,3
В 1 16,7 1 100,0 5 83,3 0 0,0
Asp/Gly TLR-4 (n=6) A/H1N1 1 16,7 1 100,0 5 83,3 1 20,0
A/H3N2 1 16,7 1 100,0 5 83,3 1 20,0
В 1 16,7 1 100,0 5 83,3 0 0,0
Arg/Gln A/H1N1 2 40,0 2 100,0 3 60,0 2 66,7
TLR-2 A/H3N2 0 0,0 0 0,0 5 100,0 2 40,0
(n=5) В 1 20,0 1 100,0 4 80,0 2 50,0
Комбшацп мутантних генотишв TLR A/H1N1 1 16,7 1 100,0 5 83,3 2 40,0
A/H3N2 0 0,0 0 0,0 6 100,0 0 0,0
(n=6) В 0 0,0 0 0,0 6 100,0 1 16,7
Прим1тка: * - р<0,05, у пор1внянн1 з показниками oci6 ¡з нормальним розподтом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4
Дослщженням piBHiB сероконверси в oci6 i3 початковим тиром протигрипозних антитт >1:40 достовipноТ piзницi у вакцинальнш вiдповiдi мiж обстеженими i3 мутантними генотипами дослщжуваних TLR та нормальним розподтом алелей не виявлено (табл.1.). Слщ вiдмiтити вiдсутнiсть 4-х кратного зростання титpiв специфiчних антитiл до серотипу В в оаб i3 генотипами Phe/Phe TLR-3, Asp/Gly TLR-4 та до A/H3N2 у вакцинованих i3 комбша^ями мутантних генотипiв TLR-2, TLR-3, TLR-4, при цьому ва вони мали висок початковi титри протигрипозних антитт.
Медiана титpiв специфiчних антитiл до вакцинацп склала в оаб i3 генотипом Phe/Phe TLR-3 - 240
[80; 320], Asp/Gly TLR-4 - 80 [40; 160] та комбша^ями мутантних генотишв TLR-2, TLR-3, TLR-4 -160 [80; 160], а зростання piвня специфiчних антитт в^^чалося в 2 рази, поpiвняно з початковим.
Аналiз piвня сероконверси в загальнiй гpупi вакцинованих виявив вщмшносп у вакцинальнiй вщпов^ф до серотипу A/H1 N1 в оаб iз полiмоpфнозмiненими генотипами TLR-2 та tLr-3, поpiвняно з вакцинованими iз нормальним pозподiлом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4. Так число 4-х кратних сероконверсш було достовipно вищим в оаб iз генотипом Leu/Phe TLR-3 (65,2%±9,7, р<0,05), Arg/Gln TLR-2 (80,0%±17,9, р<0,05) та з тенден^ею до вipогiдностi з Phe/Phe TLR-3 (66,7%±19,2, р<0,1) поpiвняно з вакцинованими iз нормальним pозподiлом алелей TLR (25,0%±9,7). Рiвень сероконверси до серотишв A/H3N2 та В в оаб iз полiмоpфнозмiненими генотипами та нормальним розподтом алелей TLR-2, TLR-3, TLR-4 достовipно не piзнився.
Дослiдження динамки середньогеометричних т^в антитiл показало, що на 28 день вакцинального процесу вщбулося зростання титpiв в уах групах вакцинованих. При поpiвняльному аналiзi середньогеометричних титpiв пiсля вакцинацп в оаб iз мутантними генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 та нормальним розподтом алелей TLR встановлено, що вакцинован iз полiмоpфнозмiненими генотипами TLR мали досл^рно вищi показники до окремих вакцинних штамiв. Так середньогеометричн титри до штаму A/H1N1 виявилися вищими в оаб iз генотипом
Leu/Phe TLR-3 в 2,4 (126,9, р<0,005), Phe/Phe TLR-3 - в 4,2 (226,3, р<0,001), Arg/Gln TLR-2 - в 3
(160,0, р<0,02), комбiнaцiями мутацiй в генах TLR-2, TLR-3, TLR-4 - в 3,3 рази (179,6, р<0,01), поpiвняно з вакцинованими iз нормальним pозподiлом алелей TLR (54,0). До штаму A/H3N2 вщповщний показник був достовipно вищим у вакцинованих iз генотипом Arg/Gln TLR-2 (320,0 при
нормальному розпод^ алелей TLR - 100,8, р<0,0005).
Таким чином, проведений aнaлiз антиттоутворення показав, що особи з мутантними генотипами TLR-2, tLr-3, TLR-4 мають вакцинальну вiдповiдь на введення протигрипозноТ вакцини на piвнi обстежених iз нормальним pозподiлом алелей TLR, про що свщчить досягнутий piвень серопротекцп, сеpоконвеpсiТ та динaмiкa середньогеометричних титpiв aнтитiл на 28 день iмунiзaцiТ.
Пpоведенi дослiдження дозволяють розглядати вакцинацш проти грипу як ефективний метод профтактики ГРВ1 в осiб iз полiмоpфнозмiненими генотипами TLR-2, tLr-3, TLR-4 та рекомендувати його застосування в широкш ктычнш пpaктицi.
Лiтература
1. Лютов Н.Г. Оценка эффективности вакцинации против гриппа / Н.Г. Лютов // Русский медицинский журнал. - 2000. - Т. 8, № 13-14. -С. 557-558.
2. Симбирцев А.С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А.С. Симбирцев, А.Ю. Громова // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 3-10.
3. Netea, M.G. Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility / M.G. Netea, C. Wijmenga, L.A.J. O'Neill // Nature immunology.
- 2012. - Vol. 13, № 6. - Р. 535-542.
4. . Друцкая М.С. Врожденное распознавание вирусов / М.С. Друцкая, П.В. Белоусов, С.А. Недоспасов // Молекулярная биология. - 2011.
- Т. 45, № 1. - С. 7-19.
5. Barton G.M. Viral recognition by Toll-like receptors / G.M. Barton // Semin Immunol. - 2007. - Vol. 19 (1). - P. 33-40.
6. Xagorari A. Toll-Like Receptors and Viruses: Induction of Innate Antiviral Immune Responses / A. Xagorari, K. Chlichlia // Microbiol J. - 2008. Vol. 2. - P. 49-59.
7. Kawai T. Innate immune recognition of viral infection / T. Kawai, S. Akira // Nat. Immunol. - 2009. - Vol. 7. - P. 131-137.
8. Дубинская Г.М. Роль полиморфизма генов TLR-2, TLR-3, TLR-4 при гриппе / Г.М. Дубинская, Н.О. Прийменко, И.П. Кайдашев [и др.] // Georgian Medical News. - 2014. - № 7-8 (232-233). - С. 51-55.
Реферат
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ГРИППА У ЛИЦ С ПОЛИМОРФИЗМОМ ГЕНОВ TLR-2, TLR-3, TLR-4
Дубинская Г. М., Прийменко Н. О., Изюмская Е.М., Руденко С.С., Артемьева Е. В. Ключевые слова: вакцинация, грипп, полиморфизм, генотип, титр, антитела.
Целью исследования было изучение эффективности вакцинации против гриппа у лиц с полиморфизмом Arg753Gln гена TLR-2, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4. Провакцинировано 66
человек с мутантными генотипами и нормальным распределением аллелей TLR-2, TLR-3, TLR-4, в возрасте от 18 до 63 лет. Установлен рост процента лиц с протективным титром ко всем штаммам гриппа как среди вакцинированных с мутантными генотипами, так и с нормальным распределением аллелей TLR-2, TLR-3, TLR-4 независимо от начального уровня противогриппозных антител. Уровень сероконверсии у лиц с полиморфноизмененными генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 соответствовал показателям вакцинированных с нормальным распределением аллелей TLR, а к штамму A/H1N1 был достоверно выше. Проведенный анализ антителообразования показал, что лица с мутантными генотипами TLR-2, TLR-3, TLR-4 имеют вакцинальный ответ на уровне обследованных с нормальным распределением аллелей TLR, что позволяет рассматривать вакцинацию против гриппа как эффективный метод профилактики ОРВИ у носителей мутаций в генах исследуемых TLR.
Summary
ASSESSMENT OF IMMUNOLOGICAL EFFICACY OF SPECIFIC PREVENTION INFLUENZA IN PERSONS WITH POLYMORPHISM OF TLR-2, TLR-3, TLR-4 GENES
Dubinskaya G. M., Priymenko N. O., Izyumskaya Ye. M., Rudenko S.S., Artemyeva Ye.V. Keywords: vaccination, influenza, polymorphism, genotype, titer antibodies.
The aim of this study was to examine the effectiveness of influenza vaccination in individuals with polymorphisms Arg753Gln TLR-2 gene, Leu412Phe TLR-3, Asp299Gly TLR-4. 66 persons were vaccinated with mutant genotypes and normal distribution of alleles TLR-2, TLR-3, TLR-4, aged 18 to 63 years. A percentage growth of persons with protective titers to all influenza strains was registered among vaccinated persons with mutant genotypes as well as in the individuals with normal distribution of alleles TLR-2, TLR-3, TLR-4, regardless of the initial level of anti-influenza antibodies. The level of seroconversion in the patients with polimorphically altered genotypes of TLR-2, TLR-3, TLR-4 correspond to the indices in the vaccinated persons with normal distribution of alleles TLR, while to a strain of / A H1N1 was significantly higher. The analysis of antibody has shown that individuals with mutant genotypes of TLR-2, TLR-3, TLR-4 have the vaccination response in individuals with normal distribution of alleles TLR, that suggests to consider influenza vaccination as an effective method of SARS prevention in carriers of mutations in the genes studied TLR.
