CC BY
26
УДК 582.28.2
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ ПРОИЗВОДСТВА ВЕТЕРИНАРНОГО ПРЕПАРАТА ТРАМЕТИН, ПОЛУЧАЕМОГО НА ОСНОВЕ ГРИБА - КСИЛОТРОФА TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH.: FR.)PILAT.
В.А. Чхенкели, А.Е. Калинович, А.В. Анисимова, Е.Д. Романова, Е.А. Карпова
Иркутская государственная сельскохозяйственная академия,
664038, Иркутская обл., п. Молодёжный, тел. (3952)29-75-09, [email protected].
Разработана питательная среда для возбудителя Сибирской язвы Bacillus anthracis, для которой используются отходы производства препарата Траметин: биомасса гриба T. Pubescens. Исследованы физиолого-биохимические морфологические свойства некоторых видов рода Bacillus. Выращенные на предлагаемой питательной среде бактерии по своим свойствам не отличались от бактерий, выращенных на стандартных средах. Ил. 1. Табл. 1. Библиограф назв. 22.
Ключевые слова: питательная среда, гидролизат биомассы гриба, р. Bacillus
UTILIZATION OF WASTES OF VETERINARY PREPARATION OBTAINED BY CULTIVATION OF TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH.: FR.)PILAT
V.A. Chkhenkeli, A.E. Kalinovich, A.V. Anisimova, E.D. Romanova, E.A. Karpova
Irkutsk State Academy of Agriculture
Molodezhny Settl., Irkutsk, 664038 Russia, [email protected].
The nutrient solution for cultivation of bacillus anthrax agent is developed on the base of wastes of fungi Trametes pubescens production. Physiological and biochemical morphological properties of some sorts of Bacillus genus are studied. The proposed medium cultivated bacteria do not differ from standard medium cultivated bacteria.
1 figure. 1 table. 22 sources.
Keywords: nutrient solution, hydrolyzate of fungi biomass, р. Bacillus.
Изучение теоретических проблем, а именно физиологических и биохимических аспектов направленного синтеза БАВ, синтезируемых продуцентом Г pubescens штамм 0663, даёт возможность как теоретического, так и практического обоснования и разработки способов его культивирования, эффективных методов выделения и очистки вторичных метаболитов. Конечная же цель таких исследований заключается в получении новых лекарственных средств, технологических ингредиентов, стимуляторов роста сельскохозяйственных животных согласно разработанной принципиальной технологической схеме [20]. Актуальность использования побочных продуктов и отходов биотехнологических производств, вызванная обострением экологических проблем, не вызывает сегодня сомнения [10,19], в том числе и
для производства ветеринарного препарата тра-метин, который используется для профилактики и лечения массовых желудочно-кишечных болезней телят [20-22]. В соответствии с технологическим регламентом утилизация отходов производства препарата осуществляется по технологической схеме, представленной на рисунке. Таким образом биомасса гриба-продуцента перерабатывается на пищевую добавку для крупного рогатого скота.
С другой стороны, в связи с высокой себестоимостью питательных сред с использованием мяса, мясных и рыбных полуфабрикатов, сегодня существует острая необходимость поиска и апробации подходящего для этой цели стандартного и недорогого сырья. Производство полноценных питательных сред на основах, имеющих низкую себестоимость, является актуальным как для экс-
108
периментальной, так и практической микробиологии, особенно для решения производственных задач [1]. Требования к сырью, предназначенному для производства питательных основ, включают содержание необходимого полноценного белка, минимальное содержание жира, высокую биологическую ценность, хорошую растворимость, соответствие ГОСТам и другим нормативным документам [5], экономическую эффективность применения. В этом отношении биомасса бактерий, грибов отвечает всем требованиям.
Современные требования к качеству и стандартности питательных сред для культивирования возбудителей особо опасных инфекций (ООИ), в том числе и возбудителя сибирской язвы, с одновременным упрощением и удешевлением производства, определяют актуальность проводимых нами исследований.
Цель работы состояла в разработке питательной среды для культивирования возбудителя сибирской Bacillus anthracis на основе биомассы гриба - продуцента T. pubescens.
В работе при разработке новой питательной для культивирования возбудителя сибирской язвы и возбудителей других инфекционных болезней использовали биомассу гриба - продуцента T. pubescens штамм 0663. Препарат получают с использованием жидкофазного метода ферментации с последующей лиофилизацией [21].
Сегодня в качестве универсальной питательной среды, как для выделения возбудителя сибирской язвы, так и возбудителей других особо опасных инфекций (ООИ), используется МПА, источником азота в котором служат органические вещества мясной воды, продукты расщепления белков (пептоны), смесь полипептидов, аминокислот [14]. В англоязычных странах среда известна как Beef EXTRACT AGAR [15]. В то же время существуют различные композиции, включающие МПА в различных концентрациях, кровь, яичный желток, селективные факторы, глюкозу, реже -другие сахара, что позволяет применять МПА для культивирования различных микроорганизмов, плохо растущих или совсем не растущих на обычных средах. Многие универсальные питательные среды готовятся на основе ферментативных гид-ролизатов мяса [14]. Гидролизаты, полученные с помощью пепсина, относятся к пептонам. Так, хорошо известен пептон по Рамону, для приготовления которого используют вареное измельченное мясо (отход при производстве мясной воды) и свиные желудки. Панкреатические гидролизаты мяса по Хоттингеру встречаются также под названиями Панкреатический перевар мяса, Триптиче-ск ий перевар мяса, Триптон и используются для приготовления бульона и агара
ПО 9.1 Сепарация
отработанной
КЖ
УМО 9.2 Сушка осадка
УМО 9.3 Фасовка, упаковка, маркировка
Отход: биомасса гриба -продуцента с ТП 7.2
ПО 9 Переработка
Кх, Кт, биомассы гриба -
Кф продуцента
Пищевая добавка для КРС
Механические
неучтенные
потери
Отсепарирован-ная жидкая фаза на очистные
Кг х. мк. фх - соответственно технологический, химический, микробиологический и физико-химический контроль.
Рис. Технологическая схема утилизации отходов производства ветеринарного
препарата траметин
Таблица
Сравнительная характеристика физиолого - биохимических, морфологических и тинкториальных свойств некоторых видов рода Saccus
Лецитинаэа га га та -О н о га га га Гемолитическая активность
Культуры Морфология теток Условия роста t<"C mi n/m ах i— га -е- о О © та с та I— та S со =1 О 1= 1 ™ 5 га is Cl 1_ £ X X га га о е Форма спор
В. cereus 123 Гр*палочки 1.0-1.2/3 -5 мкм Аэроб 10/45 4- - - + -1- - + + Эллипсовидные
В. cereus 15 Гр* папочки 1.0 -1,2/3 -5 мкм Факультативный анаэроб 10/45 -Ь - - + - + Эллипсовидные
В. mycoides67 Гр+папочки 0.3-1 ,2/2 -4 мкм Факультативный анаэроб 10/42 - - - + - + + Эллипсовидные
В. mycoides 12 Гр+палочки 0,8-1 £12 -4 мкм Факультативный анаэроб 10/43 - - - + - Эллипсовидные
В. subtilis 1345 Гр* палочки 0.7 -0,3/2-3 мкм Аэроб 5/55 - - - + + + + + Эллипсовидные
В. subtilis 124 Гр+папочки 0.7 -0,8/2-3 мкм Аэроб 5/55 - - + -1- + +■ + Эллипсовидные
В. mesentericus NB Гр* папочки 0.5 -0.6 13 -10 мкм Аэроб 10/45 - - - + -+ + Эллипсовидные
В. mesentericus 139 Гр+палочки 0.5-0.6/3-10 мкм Аэроб 10/43 - - - + -1- + + + Эллипсовидные
В. megateriumBA Гр* папочки 1,2 -1.5/2 -5 мкм Аэроб 3/45 - - - + -+ + Эллипсовидные
В. megaterium 1277 Гр*палочки 1,2 -1.5/2 -5 мкм Аэроб 3/43 - - - + + + + + Эллипсовидные
В. anthracisTM -1& Гр* палочки 1.0-1,2/3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 4- - + + -
В. anthracis ТИ -45 Гр* папочки 1.0-1,2/3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 - 4- - - + + + -
В. anthracis ТИ -97 Гр* папочки 1.0-1,2/3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 + + + + -
•N §
КЗ
о
(О
Хоттингера. По. сравнению с МПБ, в который вводят обычно нестандартный компонент пептон, состав гидролизата мяса более постоянен, а по содержанию пептонов - более однороден. Ферментативный гидролизат мяса выпускают в сухом виде. Энзиматический перевар мяса (перевар Хоттингера) встречается в каталогах фирм под названием Myosate, Proteosopeptone и др., а панкреатический гидролизат, полученный из мышц сердца, под названием bio-Myotone и др. [15].
Кроме мяса и его производных в производстве питательных сред широко используется казеин и продукты его гидролиза (как ферментативного, так и кислотного), которые являются одним из полноценных видов сырья и содержат все основные аминокислоты и витамины, в том числе и те, которые отсутствуют в мясе и продуктах его переработки [2]. В качестве основ для приготовления-питательных сред используют и растительные виды сырья [11]. Так, для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а также некоторых грибов, в мировой практике широко используется триптиказо-соевый бульон. Кроме классического варианта триптиказо-соевого бульона существует множество его модификаций [18]. Для культивирования и хранения В. теда-}епит используется триптиказо-соевый бульон с неомицином. В клинической практике триптиказо-соевый бульон рекомендуется некоторыми авторами для выделения микроорганизмов из крови с добавлением антикоагулянта - натрия цитрата. Триптиказо-соевый агар, содержащий 2 вида пептона, обеспечивает рост широкого круга микроорганизмов-аэробов и анаэробов (последних в случае инкубации в анаэробных условиях). Эта среда может быть использована как основа для агара с кровью (с добавлением 7% стерильной крови) и «шоколадного» агара [15].
Наша работа направлена на получение питательной среды, не уступающей по своим ростовым свойствам аналогам и одновременно использующей в технологии приготовления побочный продукт (биомассу) производства препарата на основе гриба-ксилотрофа Т. риЬевсепв, что способствует решению проблемы утилизации отходов производства. Наиболее близким аналогом является среда для культивирования микроорганизмов, содержащая ферментативный гидролизат сои, автолизат пекарских дрожжей, натрия хлорид
и водопроводную воду [4]. Предлагаемый нами способ получения гидролизата биомассы включает следующие операции: биомассу гриба-продуцента с влажностью 70-90% (после центрифугирования) нагревают до 46-50 °C и в эту биомассу вносят протосубтилин Г10Х в количестве 0,2-0,5% к сухой биомассе.
Гидролиз проводится в течение 20-30 ч при постоянной температуре и перемешивании. Питательная среда содержит питательную основу, дрожжевой автолизат, натрий хлористый, воду, а в качестве питательной основы гидролизат биомассы гриба-продуцента, полученный путем её гидролиза описанным выше способом. Для оценки пригодности питательных сред проведено выращивание возбудителя сибирской язвы и сапрофитных микроорганизмов рода Bacillus на жидких и плотных питательных средах. Контрольными были стандартные среды производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Результаты по изучению морфологических, культуральных и физиолого-биохимических свойств представителей культур рода Bacillus представлены в таблице.
Питательные среды на основе гидролизата биомассы гриба-продуцента T. pubescens при выращивании на них микроорганизмов рода Bacillus по культуральным свойствам не уступают коммерческим аналогам, приготовленным на ферментативной основе говяжьего мяса (бульону Хоттинге-ра и агару Хоттингера), а также МПБ и МПА. При этом производить среды на гидролизатах биомассы гриба-продуцента в 3-5 раз выгоднее экономически. Показано преимущество ферментативных-гидролизатов биомассы гриба-продуцента по аминокислотному составу и ростовым свойствам для возбудителей сибирской язвы и других представителей рода Bacillus. На полученной основе можно готовить полноценную и доступную жидкую или плотную питательные среды для культивирования других возбудителей инфекционных болезней. В питательную основу можно добавлять при необходимости другие компоненты для расширения спектра культивируемых микроорганизмов в зависимости от их питательных потребностей. Проведенные исследования могут служить моделью при изучении использования других видов сырья для приготовления питательных сред.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Ахапкина И.Г., Блинкова Л.П. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов // Журн. микробиол. 2001. № 6. С. 99-104.
2. Пат. № 2027754 РФ Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина /О.А. Вашурин, Т.В. Якшина, С.П.Краснова, В.А. Самойленко, Н.Н. Сигаева, А.А. Рахимов, В.И. Артюхин ; опубл. 27.01.1995.
3. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстан-
ции лекарственного гриба кориола опушённого // Биотехнология. 2003. № 2. С. 45-53.
4. Дьяченко Ю.В., Левицкий А.П. Соевые бактериологические питательные среды и перспективы их использования в клинической бактериологии // Клин. лаб. диагностика. 2001. № 3. С.49-50.
5. Некоторые направления стандартизации питательных сред из казеина / В.Ф. Зайцев [и др.] // Сб. науч. тр., посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 2003. С. 143.
6. Пат. №2270856 РФ Питательная среда для глубинного культивирования чумного микроба вакцинного антибиотикорезистентного штамма ЕВ Р2 / А.В. Ежов, И.Н. Садовой, В.Ф. Зайцев, Д.А. Мохов, А.З. Хонин, В.В. Тетерин ; опубл. 27.02.2006.
7. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПб. : Наука, 1995. 600 с.
8. Калягина С.Ю. Создание питательной среды из отходов мясного сырья и оценка ее свойств // Журнал микробиол. 2008. № 3. С. 91-94.
9. Пат. № 2380409 РФ. Питательная среда для культивирования чумного микроба / Л.С. Катунина, Т.В. Таран, А.В. Таран, Г.К. Исмаилова, Н.В. Жаринова, И.В. Савельева, М.А. Ашихмина ; опубл. 27.01.2010.
10. Кобрин В. С., Кузубова Л.И. Опасные органические отходы (технология управления) : аналит. обзор // СО РАН, ГПНТБ, НИОХ (сер. Экология., вып. 35). Новосибирск, 1995. 122 с.
11. Курилова А.А. Разработка питательных сред на основе сырья растительного происхождения для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы: дис. ... канд. биол. наук / А.А. Курилова. Ставрополь, 2009. 149 с.
12. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя Сибирской язвы : метод. указ. 4.2.2413-08. М., 2008. 54 с.
13. Методы изучения свойств возбудителя сибирской язвы : учеб.-метод. пособие / Л.П. Маринин [и др.]. М. : Гигиена, 2009. 304 с.
14. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской микробиологии.-СПб. : НИЦФ, 2003. 148 с.
15. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб. : ЭЛБИ-СПб, 2008. 352 с.
16. Пат. № 2104300 РФ Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, В.В. Трифонова ; опубл. 10.02.1998.
17. Руководство по методам анализа качества и безопасности пищевых продуктов / под ред. И.М. Скури-хина, В.А. Тутельяна. М. : Брандес Медицина,1998. С. 342.
18. Пат. № 2245362 РФ Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба / Е.Б. Смирнова, О.Л. Старцева, С.Е. Смирнов, С.И. Го-ловнёва ; опубл. 27.01.2005.
19. Харабаджахян, Г.Д. Разработка и экспериментальное изучение дрожжевой питательной основы сред для диагностики особо опасных инфекций: автореф. дис... канд. мед. наук / Г.Д. Харабаджахян. Саратов, 1990. 23 с.
20. Чхенкели, В. А. Биологически активные вещества Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. и их использование : монография. Новосибирск : РАСХН. СО РАСХН. ИФ ИЭВСи ДВ, 2006. 287 с.
21. Пат. № 2429871 РФ Препарат для лечения желудочно-кишечных болезней телят и способ его применения / В.А.Чхенкели, Н.В.Белова, Н.А. Шкиль, Г.Д.Чхенкели. 2011. Бюл. № 27.
22. Чхенкели В.А., Тихонов В.Л., Шкиль Н.А. Получение и использование в ветеринарии препаратов на основе дереворазрушающих грибов из рода Trametes : метод. рекоменд. Иркутск : РАСХН. ГНУ СРО; ИФ ГНУ ИЭВСиДВ РСХА, 2009. 32 с.
Поступило в редакцию 16 октября 2012 г
