CC BY
105
УДК 582.282.237 : 616.98 : 579.843.98
РАЗРАБОТКА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ
СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА БИОМАССЫ
ГРИБА - ПРОДУЦЕНТА TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH.:FR.)PILAT.
19 9 1 1
В.А. Чхенкели1'2, Е.А. Карпова2, Т.В. Глушенкова1, Т.И. Барыкина3
''Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, Россельхозакадемии, Иркутский филиал, 664005, Иркутск, Боткина, 4. 2Иркутская государственная сельскохозяйственная академия, 664038, Иркутская обл., п. Молодёжный [email protected]. 3Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория, 664005, Иркутск, Боткина, 4.
В работе впервые разработаны рецептура и методики приготовления микробиологических сред (жидких и плотных) для культивирования возбудителя сибирской язвы рода Bacillus, в качестве основ которых использованы ферментативные гидролизаты биомассы гриба - продуцента Trametes pu-bescens (Shumach.:Fr.) Pilat. Показано, что по культуральным свойствам разработанные питательные среды не уступают коммерческим аналогам. Показано, что использование биомассы продуцента будет также способствовать и решению экологической проблемы - утилизации отходов биотехнологического производства. Проведенные исследования могут служить моделью при изучении использования других видов сырья для разработки питательных сред, в том числе и для культивирования возбудителей особо опасных инфекций. Ил. 2. Табл. 6. Библиогр.28 назв.
Ключевые слова: питательные среды, возбудитель сибирской язвы, отходы, утилизация, фермен-толизат биомассы.
NUTRIENT SOLUTION ON THE BASE OF HYDROLYZATE OF BIOMASS OF PRODUCER FUNGI TRAMETES PUBESCENS (SHUMACH.:FR.)PILAT FOR CULTIVATION OF BACILLUS ANTHRACIX AGENT
V.A. Chkhenkeli1,2, E.A. Karpova2, T.V. Giushenkova1, T.I. Barykina3
Siberian and Far East Institute of Experimental Veterinary RAA, 4, Botkin St., Irkutsk, 664005 Russia. Irkutsk State Academy of Agriculture,
Molodezhny Settl., Irkutsk, 664038 Russia, [email protected]. 3Irkutsk Inter-regional Veterinary Laboratory, 4, Botkin St., Irkutsk, 664005 Russia.
In this work, the preparation techniques and formulation of microbiological medium (liquid and solid) for cultivation of bacillus anthrax agent of the Bacillus type were developed for the first time. The base for the microbiological medium was enzymatic hydrolyzates of producer fungi Trametes pubescens (Shumach.:Fr.)Pilat biomass. The work indicated that the developed nutrient solutions compare well with commercial analogs in terms of culture qualities. It was shown, that the use of producer biomass will also promote the solution of ecological problems, such as biotechnological production waste recycling. Research that was carried out can serve as a model during studies on utilization of other feedstock for development of nutrient solutions including the ones for cultivation of highly infectious disease agents. 2 figures. 6 tables. 28 sources.
Keywords: microbiological media, bacillus anthrax agent, wastes, enzymatic hydrolyzates of biomass.
ВВЕДЕНИЕ
Одним из основных микробиологических методов диагностики возбудителя сибирской язвы, как из патологического материала, так и продуктов питания, кормов, объектов окружающей среды (почвы, воды, воздуха, смывов) является посев материала для исследования культуральных и морфологических свойств возбудителя на универсальные питательные среды (мясо - пептонный
бульон (МПБ), мясо - пептонный агар (МПА), агар Хоттингера) [17,18]. Таким образом, питательные среды, использование которых предусматривает большинство методов идентификации сибиреязвенного микроба, являются основным инструментом для выделения чистой культуры возбудителя и первичного изучения ее свойств.
В связи с высокой себестоимостью питательных сред с использованием мяса, мясных и рыбных полуфабрикатов сегодня существует острая необходимость поиска и апробации подходящего для этой цели стандартного и недорогого сырья. Производство полноценных питательных сред на основах, имеющих низкую себестоимость, является актуальным как для экспериментальной, так и практической микробиологии, особенно для решения производственных задач [1].
Требования к сырью, предназначенному для производства питательных основ, включают содержание необходимого полноценного белка, минимальное содержание жира, высокую биологическую ценность, хорошую растворимость, соответствие ГОСТам и другим нормативным документам [8], экономическую эффективность применения. В этом отношении биомасса бактерий, грибов отвечает всем требованиям. С другой стороны, актуальность использования побочных продуктов и отходов биотехнологических производств, вызванная обострением экологических проблем, не вызывает сегодня сомнения [25]. На сегодняшний день особо острыми представляются и проблемы утилизации промышленных отходов, в том числе, и биотехнологических производств [3,10,16]. В связи с этим весьма актуальным является решение вопроса об использовании биомассы продуцента. В этом контексте могут быть рассмотрены схемы безотходного производства антимикробных препаратов и технологических ингредиентов, а также производства полисахаридов и иммуностимулирующих препаратов на их основе, стимуляторов роста животных.
Таким образом, современные требования к качеству и стандартности питательных сред для культивирования возбудителей особо опасных инфекций (ООИ), в том числе, и возбудителя сибирской язвы, с одновременным упрощением и удешевлением производства, определяют актуальность проводимых нами исследований. На наш взгляд, сегодня заслуживают внимания в качестве источника белка биомасса гриба - базидиомицета T. pubescens (Shumach.:Fr.) Pilat., получаемая в качестве отхода производства, при производстве полифункционального препарата антимикробного и иммуностимулирующего действия, который используется в качестве лечебно - профилактического средства при массовых желудочно - кишечных заболеваниях молодняка [26,27,28]. Цель работы состояла в разработке питательной среды для культивирования возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis на основе биомассы гриба - продуцента T. pubescens.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Исследования проводили в научно- исследовательской лаборатории «Индикация и диагностика инфекционных болезней», на кафедре микробиологии, патологической анатомии, ветеринарно-санитарной экспертизы, организации ветеринар-
ного дела ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» (ИрГСХА), в ФГБУ «Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория» (ИМВЛ).
Объектами исследования являлись питательные среды для культивирования бактерий рода Bacillus; клинические штаммы бактерий рода Bacillus, выделенные и идентифицированные в бактериологическом отделе ФГБУ ИМВЛ, музейные штаммы кафедры микробиологии, патологической анатомии, ветеринарно-санитарной экспертизы и организации ветеринарного дела ФГБОУ ВПО (зав. кафедрой, профессор, д-р биол. наук, член-корр. РАЕ В.А. Чхенкели), лаборатории биотехнологии и болезней молодняка Иркутского филиала Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока (ИФ ИЭВСиДВ) СРО Рос-сельхозакадемии (зав. лабораторией, д-р биол. наук, член-корр. РАЕ В.А. Чхенкели).
В работе при разработке новой питательной среды для культивирования возбудителя сибирской язвы и возбудителей других инфекционных болезней использовали биомассу гриба-продуцента T. pubescens штамм 0663, которая является отходом производства комплексного препарата Леван-2, разработанного в лаборатории биотехнологии и болезней молодняка ИФ ИЭВСиДВ. Препарат получают с использованием жидкофазного метода ферментации [28].
Биомассу продуцента отделяли от культу-ральной жидкости центрифугированием при 3000 об/мин в течение 20 мин.
Методы биохимических исследований биомассы продуцента подробно описаны В.А. Чхенке [26]. Аминокислотный состав определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-239 (Чехия). Точную навеску образца растирали в фарфоровой чашке с известным объёмом 6 н соляной кислоты. Полученный гомогенат количественно переносили в пробирку-ампулу, после чего ее запаивали, ставили в термостат при температуре 103-105 0С и гидролизовали в течение 24 ч, периодически встряхивая содержимое ампул. После окончания гидролиза ампулы охлаждали, вскрывали, и содержимое количественно переносили в фарфоровые чашки. Чашки с гидролизатом выпаривали досуха на водяной бане при температуре не более 50 0С в вытяжном шкафу. После выпаривания соляной кислоты в чашки добавляли немного дистиллированной воды и снова выпаривали досуха. Эту операцию повторяли 3-4 раза. После удаления соляной кислоты сухой остаток растворяли в 2 мл свежеприготовленного 0,2 М цитратного буфера (рН 2,2), количественно переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 15 мин при 9000 об/мин. Полученную надосадочную жидкость заливали в кюветы, которые помещали в анализатор. Количественный расчет аминокислот проводили по соотношению площади пиков аминокислот, содержа-
щихся в образце в сравнении со стандартным раствором аминокислот с учетом молекулярно веса (mol,%).
Содержание сырого протеина, жира, золы определяли по общепринятым методикам [11]: липиды - методом кислотного гидролиза, количественное содержание отдельных фракций - по М. Кейтсу [15]. Жирнокислотный состав липидов определяли методом ГЖХ [24], содержание фос-фолипидов - методом ТСХ, нуклеиновых кислот -по А.И. Ермакову с соавт. [11]. Определение содержания микроэлементов проводили атомно-абсорбционным [10,11,16] и полярографическим методами [4,8]) с использованием полярографа ПУ-2 и атомно-абсорбционного анализатора GBS-906 АА (Япония), содержание ртути определяли атомно-абсорбционным методом [8] на анализаторе ртути Юлия-2. Аминный азот в гидролизатах биомассы гриба-продуцента определяли по Кье-льдалю [5]. Экспериментальные данные обрабатывали статистически с использованием компьютерных программ Microsoft Office Excel 2003, «Sta-tistica 6.0».
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Сегодня в качестве универсальной питательной среды, как для выделения возбудителя сибирской язвы, так и возбудителей других особо опасных инфекций (ООИ), используется МПА, источником азота в котором служат органические вещества мясной воды, продукты расщепления белков (пептоны), смесь полипептидов, аминокислот. МПА известен более 80 лет и до сих пор остаётся базовой средой, используемой в клинической микробиологии в разных странах с целью посева, культивирования и последующей идентификации микроорганизмов при условии внесения различных добавок [20]. В англоязычных странах среда известна как Beef EXTRACT AGAR [21]. В то же время существуют различные композиции, включающие МПА в различных концентрациях: кровь, яичный желток, селективные факторы, глюкозу, реже - другие сахара, что позволяет применять МПА для культивирования различных микроорганизмов, плохо растущих или совсем не растущих на обычных средах. Основа этой среды, включающая мясную воду, пептон и хлорид натрия используется в качестве самостоятельной среды - МПБ, имеющего такое же широкое применение в микробиологии. В отечественной практике в качестве аналогов сред МПА и МПБ нашли применение сухие питательные среды: сухой питательный агар (СПА) и ГРМ-агар, получаемые с использованием гидролизата кильки (в случае СПА) или гидролизата рыбной муки (в случае ГРМ-агара). Вместе с тем, вся технология приготовления «классического» МПА основана на использовании мяса крупного рогатого скота, поэтому СПА и ГРМ-агар, строго говоря, не являются МПА в классическом понимании - это его более или менее удачные заменители. Однако, очевид-
но, что с экономической точки зрения питательные среды на основе ГРМ и гидролизата кильки имеют несомненное преимущество. Поэтому «мясной» и «рыбный» варианты МПА не противоречат, а дополняют друг друга. Многие универсальные питательные среды готовятся на основе фермента-т ивных гидролизатов мяса [13,20]. Гидролизаты, полученные с помощью пепсина, относятся к пептонам. Так, хорошо известен пептон по Рамону, для приготовления которого используют вареное измельченное мясо (отход при производстве мясной воды) и свиные желудки. Панкреатические гидролизаты мяса по Хоттингеру встречаются также под названиями «Панкреатический перевар мяса», «Триптический перевар мяса», «Триптон» и используются для приготовления бульона и агара Хоттингера. По сравнению с МПБ, в который вводят обычно нестандартный компонент пептон, состав гидролизата мяса более постоянен, а по содержанию пептонов - более однороден. Ферментативный гидролизат мяса выпускают в сухом виде. Энзиматический перевар мяса (перевар Хоттингера) встречается в каталогах фирм под названием Myosate, Proteosopeptone и др., а панкреатический гидролизат, полученный из мышц сердца, под названием bio-Myotone и др. [21].
Кроме мяса и его производных в производстве питательных сред широко используется казеин и продукты его гидролиза (как ферментативного, так и кислотного), которые являются одним из полноценных видов сырья и содержат все основные аминокислоты и витамины, в том числе и те, которые отсутствуют в мясе и продуктах его переработки. Так, из панкреатического гидролизата казеина готовят казеиновый бульон и агар с глюкозой. В качестве основ для приготовления питательных сред используют и растительные виды сырья [17]. Особенно широкое применение для приготовления питательных сред за рубежом получили среды, приготовленные на основе продуктов гидролиза сои, поскольку при гидролизе сои образуются аминокислоты, сходные по составу с аминокислотами животных белков.
Так, для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а также некоторых грибов, в мировой практике широко используется триптиказо-соевый бульон. Кроме классического варианта триптиказо-соевого бульона существует множество его модификаций. Например, триптиказо-соевый бульон с лошадиной сывороткой в количестве100 мл на 1 л. Для культивирования и хранения B. megaterium используется триптиказо-соевый бульон с неомици-ном. В клинической практике триптиказо-соевый бульон рекомендуется некоторыми авторами для выделения микроорганизмов из крови. В этом случае перед стерилизацией бульона в него добавляют антикоагулянт - натрия цитрат. Триптиказо-соевый агар, содержащий 2 вида пептона, обеспечивает рост широкого круга микроорганизмов-
аэробов и анаэробов (последних в случае инкубации в анаэробных условиях). Эта среда может быть использована как основа для агара с кровью (с добавлением 7% стерильной крови) и «шоколадного» агара [21]. Существует большое число вариантов этой среды с добавлением углеводов, крови, сыворотки, селективных веществ.
Наша работа была направлена на получение питательной среды, не уступающей по своим ростовым свойствам аналогам и одновременно использующей в технологии приготовления побочный продукт (биомассу) производства комплексного препарата на основе гриба-ксилотрофа T. pubescens, что способствует решению проблемы утилизации отходов производства.
Весь технологический процесс безотходного производства продуктов биотехнологии с использованием дереворазрушающего гриба T. Pu-bescens может быть представлен в виде обобщенной технологической схемы, которая представлена на рис. 1.
Химический состав мицелия T. pubescens, полученного при культивировании на оптимизированной глюкозо-пептонной среде представлен в табл. 1.
Таблица 1
Химический состав мицелия T. pubescens, полученного при культивировании на
Аминокислотный состав биомассы продуцента представлен в табл. 2.
Установлено, что при культивировании продуцента экономический коэффициент, рассчитанный по исходному сахару, составил 44,5%, содер-
жание протеина - 46,3% (табл. 1). Отношение суммы незаменимых аминокислот к сумме заменимых (Е/н) характеризует биологическую ценность белков и для биомассы T. pubescens составляет 0,66, что ниже этого показателя для казеина молока (0,75).
Для оценки белка важным показателем является его перевариваемость, которая зависит от соотношения легко - и трудногидролизуемых аминокислот, входящих в состав белков. Показателем высокой перевариваемости может служить отношение суммы аргинина и лизина к пролину.
Так, для белка риса этот показатель составляет 4, для соевой муки - 2,1, для зерновых культур - ниже 1.
Для белка исследуемого продуцента это соотношение составляет 1,67 и характеризует его как высокоперевариваемый. Биологическую ценность белков характеризует не только аминокислотный профиль, но и его фракционный состав. Установлено, что водосолерастворимые белки (альбумины и глобулины) преобладают в биомассе гриба и составляют 62, 0 и 5,53% соответственно.
Анализ липидной фракции продуцента показал, что она включает жирные кислоты, стерины, триглицериды, воска, фосфолипиды и углеводороды. Содержание жирных кислот составляет 52,45%, триглицеридов - 0,85% от фракции неполярных липидов. Фракция жирных кислот отличается высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот. (более 61%) - олеиновой и линоле-вой, эргостерина (табл. 3). Данные, полученные при исследовании жирнокислотного состава ли-пидной фракции, согласуются с данными, полученными при исследовании биомассы ксилотро-фов [3]. Физиологически активные фосфолипиды в основном содержат фосфатидилсерин (60,0%), а также фосфатидилэтаноламин (21,9%) и фосфа-тидилхолин (18,1%).
Таблица 2
Аминокислотный состав биомассы продуцента T. pubescens
Аминокислота Содержание, mol %
Незаменимые:
изолейцин 6,03
лейцин 8,79
лизин 3,88
метионин 1,62
тирозин 10,52
треонин 4,27
валин 4,70
фенилаланин -
Заменимые:
гистидин 32,05
аргинин 5,57
аспарагиновая кислота 3,78
серин 2,54
глютаминовая кислота 9,71
пролин -
глицин 3,43
аланин 3,11
глюкозо - пептонной среде
Компоненты Содержание
Выход биомассы, г/л а.с.б. 8,9
Экономический коэффициент, % 44,5
Протеин, % 46,3
Истинный белок, % 34,2
Жир, % 5,3
Зола, % 6,2
Подготовка питательной среды
Подготовка посевного материала +
Жидкофашая ферментация
Отделение биомассы от культу ральной жидкости (фильтрация. центрифугирование, сепарирование)
ильтрация Биомасс: 1а1нк
Высушивание в воздушном потоке при 30 - 150°С
Выделение
I экстракция органическими растворителями, водой, растворами кислот и щелочей)
Вакуумная сушка
Культуральная жидкость
Выделение I экстракция орг. растворителями)
Тритерпены
Антимикробные, противораковые препараты
Полисахариды -Стеролы
Тритерпены
> Лекарственные средства (имм>"н ос тимулир> тощие, антимикробные, противоопухолевые >
^Ымуностимулирующие. и противоопухолевые препараты
►Биологически активная су бстанция
Стерилизация * 1автоклавирование)
_Лиофилъная сушка
| Антимикробные
препараты
Пищевые добавки Технологические
ингредиенты
Стимуляторы роста животных
Рис. 1. Принципиальная схема производства продуктов биотехнологии на основе гриба Trametes pubescens (Shumach.:Fr.)Pilat. (по В.А. Чхенкели, 2006)
Одним из критериев оценки биологической ценности продуктов является содержание в них микроэлементов. Результаты представлены в табл. 4. Представленные данные свидетельствуют о том, что содержание токсичных элементов не превышает ПДК даже для пищевых продуктов-грибов, изолятов и концентратов белка. Было установлено сравнительно высокое содержание марганца (до 0,80 мг/кг), железа (до 9,96 мг/кг) и цинка (до 8,964 мг/кг), что характерно как для плодовых тел высших базидиальных грибов, произрастающих в естественных условиях, так и для культурального мицелия [26].
Таким образом, получаемая биомасса мицелия является питательной и безопасной.
Из литературы известны питательные среды для культивирования различных микроорганиз-
мов, в том числе и патогенных, приготовленные путем триптического гидролиза мяса по Хоттинге-ру, из панкреатического гидролизата казеина, соевых бобов и гороха, каспийской кильки, пекарских дрожжей [27].
Существует питательная среда для выращивания микроорганизмов, содержащая панкреатический гидролизат казеина, экстракт пекарских дрожжей, лактозу, соли марганца и магния, аскорбиновую кислоту [2]. Для глубинного культивирования вакцинного штамма чумного микроба применяется питательная среда на основе ферментативного гидролизата белков обезжиренного молока с содержанием аминного азота 120 мг% и концентрацией водородных ионов рН 6,8-7,2 [9,14]. В её состав входит питательная основа, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий
Таблица 3
Жирнокислотный состав липидной фракции, выделенной из биомассы ^ pubescens
Жирная кислота Содержание, % Жирная кислота Содержание, %
Насыщенные кислоты: Ненасыщенные кислоты:
Пальмитиновая (Сто) 3,9 Олеиновая (С18:1) 34,1
Стеариновая (Сто) 5,2 Пальмитоолеиновая (Ст1) 1,3
Всего насыщенных кислот 39,1 Линоленовая (Стз) 0,1
Линолевая (С18:2) 25,4
Всего ненасыщенных кислот 60,9
Содержание микроэлементов в культуральном мицелии T. pubescens
Таблица 4
Элемент
Содержание в культуральном мицелии, мг/кг
Элемент
Содержание в культуральном мицелии, мг/кг
Кадмий Свинец Цинк Медь Хром Марганец
1,281 н/о 8,964 1,035 0,030 0,80
Железо
Никель
Ртуть
Мышьяк
Йод
9,96 н/о н/о н/о 0,200
Примечание: н/о - не обнаружено.
фосфорнокислый двухзамещенный, магния сульфат, натрия хлорид. Разработана питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба следующего состава: панкреатический гидролизат соевых бобов, натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий сернокислый, дистиллированная вода [23].
В настоящее время в разработке полноценных питательных сред мясные основы в основном уступают место казеину, широкое распространение получили также гидролизаты рыбного сырья и дрожжей. Сырье для изготовления питательных компонентов должно быть доступным, стандартным и дешевым. Изыскиваются и новые способы гидролиза исходного сырья. Однако недостатком микробиологических сред, приготовленных на основе панкреатических гидролизатов, является возросшая стоимость поджелудочной железы, ее нестандартность, а также длительность (5 сут и более) процесса ферментативного гидролиза, что также увеличивает конечную стоимость среды. При этом использование сырья животного происхождения может привести к контаминации питательных сред биологическими агентами (мико-плазмами, прионами и др.).
Наиболее близким аналогом является среда для культивирования микроорганизмов, содержащая ферментативный гидролизат сои, автолизат пекарских дрожжей, натрий хлористый и водопроводную воду [7]. Известны способы получения белковых гидролизатов, основанные на ферментативном гидролизе белкового сырья протеолити-ческими препаратами, выделенными из некоторых бактерий или плесневых грибов. Известен способ получения гидролизата дрожжевой биомассы, который предусматривает гидролиз дрожжевой биомассы комплексным ферментным препаратом, полученным на основе штамма микромицета Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 или его культураль-ной жидкости при рН 4,5-6,0, с последующей пастеризацией при 80-90 °С в течение 15-20 мин и сушкой [22].
Проведенный поиск по патентам и научно-техническим источникам информации показал, что в настоящее время среди бактериальных ферментных препаратов отечественного и зарубежного производства наиболее часто используют препарат протосубтилин, обладающий протеолитиче-ской активностью. Так, наиболее близким являет-
ся способ получения белковых основ для приготовления бактериологических питательных сред [7]. Способ предлагает использование в качестве сырья соевого экстракта и проведение ферментативного гидролиза протосубтилином при 47-50 °С и рН 7,3 в течение 5-8 ч или проназой при 37 °С, рН 7,2 в течение 2 ч.
Предлагаемый нами способ получения гидро-лизата биомассы включает следующие операции: биомассу гриба-продуцента с влажностью 70-90% (после центрифугирования) нагревают до 46-50 °C и в эту биомассу вносят протосубтилин Г10Х в количестве 0,2-0,5% к сухой биомассе. Гидролиз проводится в течение 20-30 ч при постоянной температуре и перемешивании. Таким образом, питательная среда для культивирования микроорганизмов рода Bacillus и, в частности, возбудителя сибирской язвы - В. anthracis, содержит питательную основу, дрожжевой автолизат, натрий хлористый, воду, а в качестве питательной основы гидролизат биомассы гриба-продуцента, полученный путем ее гидролиза, описанным выше способом, при следующем соотношении компонентов, г/л:
- ферментативный гидролизат биомассы
- натрий хлористый
- дрожжевой автолизат
- водопроводная вода
- рН
300-330
30 50
до 1,0 7,2 + 0,2
Для приготовления плотной питательной среды дополнительно добавляется агар-агар в количестве 15-20 г/л.
Можно для приготовления питательной среды гидролизат биомассы гриба-продуцента, приготовленный в соответствии с нашим способом, разводить по расчету водопроводной водой до содержания аминного азота 100 ± 10 мг%, корректировать рН до требуемой величины, добавлять 0,3% натрия хлористого и воду до 1 л. Для приготовления плотной среды в нее необходимо добавлять 15-20 г/л агар-агара.
Среду следует разливать в пробирки или колбы и стерилизовать автоклавированием при 110 °С 30 мин.
В этом случае готовая среда содержит следующие компоненты, г/л:
- ферментолизат биомассы гриба-родуцента
- натрий хлористый
- водопроводная вода
- рН
*- содержание аминного азота 90 мг%.
350* 30
остальное 7,2 + 0,2
На полученной основе можно готовить полноценную и доступную жидкую или плотную питательную среду для культивирования других возбудителей инфекционных болезней. В питательную основу можно добавлять при необходимости другие компоненты для расширения спектра культивируемых микроорганизмов в зависимости от их питательных потребностей.
Для оценки пригодности предлагаемых питательных сред проведено выращивание возбудителя сибирской язвы и сапрофитных микроорганизмов рода
Bacillus на жидких и плотных питательных средах [18,19]. Характер роста различных видов рода Bacillus на питательной среде, приготовленной на основе гидролизата биомассы T. pubescens показан на рис. 2.
Контрольными были стандартные среды производства НИЦФ (г. СПб). Результаты по изучению морфологических, культуральных и физиоло-го-биохимических свойств представителей культур рода Bacillus представлены в табл. 5 и 6. Таким образом, показано, что разработанные нами пита-
тельные среды на основе гидролизата биомассы гриба-продуцента T. pubescens при выращивании на них микроорганизмов рода Bacillus по культу-ральным свойствам не уступают коммерческим аналогам, приготовленным на ферментативной основе говяжьего мяса (бульону Хоттингера и агару Хоттингера), а также МПБ и МПА.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе впервые разработаны рецептура и методики приготовления микробиологических сред (жидких и плотных) для культивирования возбудителя сибирской язвы, в качестве основы которых использованы ферментативные гидроли-заты биомассы гриба-продуцента T. pubescens.
Показано, что по культуральным свойствам разработанные питательные среды не уступают коммерческим аналогам, приготовленным на ферментативной основе говяжьего мяса (бульону Хоттингера и агару Хоттингера), а также МПБ и МПА. Показано преимущество ферментативных гидролизатов биомассы гриба-продуцента по ростовым свойствам для возбудителей сибирской язвы и других представителей рода Bacillus. На полученной основе можно готовить полноценную и доступную жидкую или плотную питательные среды для культивирования других возбудителей инфекционных болезней. В питательную основу можно добавлять при необходимости другие
г д e
Рис. 2. Характер роста различных видов рода Bacillus на питательной среде, приготовленной на основе гидролизата биомассы T. pubescens: a - B. cereus; б - B. subtilis; в - B. anthracis; г - B. mycoides; д - B. megaterium; e - B. mesentericus.
Таблица 5
Сравнительная характеристика физиолого - биохимических, морфологических и тинкториальных свойств некоторых видов рода Bacillus
3
"О
>
Ь
I
>
io Ol s о
X
Ol
m X I
о ь о
Культуры Размер клеток Условия роста t аС min/m ах Лецитинаэа Фосфат аза Каталаза Подвижность Гидролиз крахмала Маннит Глюкоза Гемолитическая активность Форма спор
S. cereus123 Гр+ палочки 1,0 -1,2/3 -5 мкм Аэроб 10/45 + - 4- 4- - 4- 4- Эллипсовидные
В. ce retís 15 Гр+ палочки 1,0 -1,213 -5 ним Факультативный анаэроб 10/45 + - 4- 4- - 4- 4- Эллипсовидные
S. mycoides67 Гр+ палочки 0.3 -1,212 -4 мкм Факультативный анаэроб 10/42 - - 4- 4- 4- 4- Эллипсовидные
B. mycoides 12 Гр+ палочки 0,3-1,2/2 -4 мкм Факультативный анаэроб 10/43 - - 4- Эллипсовидные
B. subtilis 1345 Гр+ палочки 0.7 -0.&/2-3 мкм Аэроб 5/55 - - 4- 4- ■ 4- 4- Эллипсовидные
B. subtilis 124 Гр+ палочки 0.7 -0.S/2 -3 мкм Аэроб 5/55 - - 4- 4- + 4- 4- Эллипсовидные
B. mesentericus NB Гр4" палочки 0.5 -0.6 /3 -10 мкм Аэроб 10/45 - - 4- 4- + 4- 4- Эллипсовидные
B. mesentericus 139 Гр* палочки 0.5-0.6/3-10 мкм Аэроб 10/43 - - 4- 4- + 4- 4- Эллипсовидные
B. megateriumBA Гр+ палочки 1.2 -1.5/2-5 мкм Аэроб 3/45 - - 4- 4- + 4- 4- Эллипсовидные
B. megaterium 1277 Гр+ палочки 1,2 -1,5/2-5 мкм Аэроб 3/43 - - 4- 4- 4- 4- 4- Эллипсовидные
S. anttiracisTH -18 Гр+ палочки 1.0 -1,2 /3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 - 4- - 4- 4- - Эллипсовидные
B. a/ittíiacís 7W -45 Гр+ палочки 1.0-1,2/3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 - 4- - 4- 4- 4- - Эллипсовидные
a anthracisTW -97 Гр+ палочки 1.0 -1,2 /3-10 мкм Факультативный анаэроб 12/45 - + + + + Эллипсовидные
§
DO гп
0
1
DO
s §
i I
So £
I
s tn X
0
1 §
1
l\J
о
-л
•N §
l\J
5
o>
Таблица 6
Культуральные свойства представителей рода Bacillus при выращивании на различных средах
Питательные среды
Культуры Бульон Хоттингера 100 мг % амин-ного азота, зарактер роста МПБ, характер роста Среда на основе гидролизата биомассы гриба-продуцента ^ pubescens 110 мг% аминного азота, колонии Агар Хоттин-гера100 мг % аминного азота, колонии МПА, колонии Агаризован-ная среда на основе гид-ролизата биомассы гриба-продуцента ^ pubescens 110 мг% аминного азота, колонии
1 2 3 4 5 6 7
B. cereus 123 Равномерное помутнение и хлопьевидный осадок Равномерное помутнение и хлопьевидный осадок Равномерное помутнение и хлопьевидный осадок Серовато-белые, плёнчатые, со слегка изрезанными краями Сероватые, плёнчатые,со слегка изрезанными краями Сероватые, плёнчатые, со слегка изрезанными краями
Нежная Нежная Нежная плен- Серовато-белые,со Сероватые, плёнчатые,со Сероватые, плёнчатые, со
B. cereus 15 пленка на пленка на ка на поверх- слегка изре- слегка изре- слегка изре-
поверхности поверхности ности занными краями занными краями занными краями
B. mycoides 67 Осадок на дне в виде комочка ваты Осадок на дне в виде комочка ваты Осадок на дне в виде комочка ваты Сочные, беловато -плёнчатые Сочные, беловато -плёнчатые Сочные, беловато -плёнчатые
B. mycoides Осадок на дне в виде Осадок на дне в виде Осадок на дне в виде комочка ваты Сочные, беловато -плёнчатые Сочные, беловато -плёнчатые Сочные, беловато -плёнчатые
12 комочка ваты комочка ваты
B. subtilis 1345 Плёнка на поверхности среды Плёнка на поверхности среды Плёнка на поверхности среды Сухие, морщинистые, с бахромчатыми краями Сухие, морщинистые, с бахромчатыми краями Сухие, морщинистые, с бахромчатыми краями
B. subtilis 124 Плёнка на поверхности среды Плёнка на поверхности среды Плёнка на поверхности среды Сухие, морщинистые, с волнистыми краями Сухие, морщинистые, с волнистыми краями Сухие, морщинистые, с волнистыми краями
B. mesenter-icus NB Сухая пленка на поверхности среды Сухая пленка на поверхности среды Сухая пленка на поверхно- Желтоватые, сухие, мор- Желтовато -бурые, сухие, Желтовато -бурые, сухие,
сти среды щинистые морщинистые морщинистые
B. mesenter-icus 139 Сухая пленка на поверхности среды Сухая пленка на поверхности среды Сухая пленка на поверхно- Желтоватые, сухие, мор- Желтовато -бурые, сухие, Желтовато -бурые, сухие,
сти среды щинистые морщинистые морщинистые
B. megaterium ВА Слабая муть Слабая муть Слабая муть Кожистые, складчатые Кожистые, складчатые Кожистые, складчатые
B. megaterium 1277 Слабая муть Слабая муть Слабая муть Кожистые, складчатые Кожистые, складчатые Кожистые, складчатые
B. anthracis ТИ-18 Рыхлый белый осадок Рыхлый белый осадок Рыхлый белый осадок Серовато-беловатые шероховатые с неровными краями Серовато-беловатые шероховатые с неровными краями Серовато -беловатые шероховатые с неровными краями
Матовые ше- Матовые ше- Матовые ше-
B. anthracis Нежные Нежные Нежные роховатые с роховатые с роховатые с
ТИ -45 хлопья хлопья хлопья неровными краями неровными краями неровными краями
Продолжение таблицы 6
1 2 3 4 5 6 7
B. anthracis ТИ -97 Рыхлый белый осадок Рыхлый белый осадок Рыхлый белый осадок Матовые шероховатые с неровными краями Матовые шероховатые с неровными краями Матовые шероховатые с неровными краями
компоненты для расширения спектра культивируемых микроорганизмов в зависимости от их питательных потребностей. Проведенные исследова-
ния могут служить моделью при изучении использования других видов сырья для приготовления питательных сред.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Ахапкина И.Г., Блинкова Л.П. Питательные среды как искусственная среда роста и развития микроорганизмов // Журн. микробиол. 2001. № 6. С. 99-104.
2. Пат. РФ № 2027754. Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина /О.А. Вашурин, Т.В. Якшина, С.П.Краснова, В.А. Самойленко, Н.Н. Сигаева, А.А. Рахимов, В.И. Артюхин; опубл. 27.01.1995.
3. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба кориола опушённого // Биотехнология. 2003. № 2. С. 45-53.
4. ГОСТ 26927-86, ГОСТ 26935-86. Сырье и продукты пищевые : методы определения токсичных элементов. М. : Изд-во стандартов, 1986. 86 с.
5. ГОСТ Р 50466-93. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье : методы определения содержания азота и сырого протеина. М. : Изд-во стандартов, 1993. 24 с.
6. Дорогова В.Б. Атомно-абсорбционный анализ микроэлементов в биосредах и метрологические основы контроля аналитических работ : учеб. пособие / В.Б. Дорогова [и др.]. Иркутск : Изд-во ГИУВа, 1999. 24 с.
7. Дьяченко Ю.В., Левицкий А.П. Соевые бактериологические питательные среды и перспективы их использования в клинической бактериологии // Клин. лаб. диагностика. 2001. № 3. С.49-50.
8. Некоторые направления стандартизации питательных сред из казеина / В.Ф. Зайцев [и др.] // Сб. науч. тр., посвящ. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 2003. С. 143.
9. Пат. РФ № 2270856. Питательная среда для глубинного культивирования чумного микроба вакцинного антибиотикорезистентного штамма ЕВ Р2 / А.В. Ежов, И.Н. Садовой, В.Ф. Зайцев, Д.А. Мохов, А.З. Хо-нин, В.В. Тетерин ; опубл. 27.02.2006.
10. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии. - СПб. : Наука, 1995. 600 с.
11. Методы биохимического исследования растений / А.И. Ермаков [и др.]. 3-е изд., перераб и доп. Л. : Агропромиздат. 1987. 430 с.
12. Ермаченко Л.А. Атомно-абсорбционный анализ в санитарно-гигиенических исследованиях : метод. пос. - М. : Чувашия, 1997. 207 с.
13. Калягина, С.Ю. Создание питательной среды из отходов мясного сырья и оценка ее свойств // Журнал микробиол. 2008. № 3. С. 91-94.
14. Катунина, Л.С. Питательная среда для культивирования чумного микроба / Л.С. Катунина, Т.В.Таран, А.В.Таран, Г.К. Исмаилова, Н.В. Жаринова, И.В. Савельева, М.А. Ашихмина // Патент РФ №2380409. Опубл. 27.01.2010.
15. Кейтс, М. Техника липидологии / М. Кейтс. -Пер. с англ. - М.: Мир, 1975. - С. 156 - 157.
16. Кобрин В. С., Л.И. Кузубова. Опасные органические отходы (технология управления): аналит. обзор / СО РАН, ГПНТБ, НИОХ. (Сер. Экология. вып. 35). Новосибирск, 1995. 122 с.
17. Курилова А.А. Разработка питательных сред на основе сырья растительного происхождения для культивирования возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы: дис. ... канд. биол. наук. Ставрополь, 2009. 149 с.
18. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя Сибирской язвы: метод. указ. 4.2.2413-08.-М., 2008. 54 с.
19. Методы изучения свойств возбудителя сибирской язвы: учеб.-метод. пособие/ Л.П. Маринин [и др.]. М. : ЗАО «Гигиена», 2009. 304 с.
20. Питательные среды для медицинской микробиологии / М.С.Поляк [и др.]. СПб. : НИЦФ,2003. 148 с.
21. Поляк М.С., В.И. Сухаревич, М.Э. Сухаревич. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб. : ЭЛБИ-СПб, 2008. 352 с.
22. Пат. РФ № 2104300. Способ получения белкового гидролизата дрожжевой биомассы / Л.В. Римарева, М.Б. Оверченко, В.В. Трифонова ; опубл. 10.02.1998.
23. Пат. № 2245362, Российской Федерации. Питательная среда для культивирования вакцинного штамма чумного микроба / Е.Б. Смирнова, О.Л. Старцева, С.Е. Смирнов, С.И. Головнёва ; опубл. 27.01.2005.
24. Содержание липидов и состав жирных кислот высшего съедобного гриба-вешенки обыкновенной Pleu-rotus ostreatus (Fr.) Kummer / Э.Ф. Соломко [и др.] // Прикл. биохим. и микробиол. 1984. Т. 20, вып. 2. С. 273279.
25. Харабаджахян Г.Д. Разработка и экспериментальное изучение дрожжевой питательной основы сред для диагностики особо опасных инфекций: автореф. дис... канд. мед. наук. Саратов, 1990. 23 с.
26. Чхенкели В. А. Биологически активные вещества Coriolus pubescens (Shum.:Fr.) Quel. и их использование : монография. - Новосибирск : РАСХН. СО РАСХН. ИФ ИЭВСи ДВ, 2006. 287 с.
27. Пат. №2429871, Россйская Федерация. Препарат для лечения желудочно-кишечных болезней телят и способ его применения / В.А.Чхенкели, Н.В.Белова, Н.А. Шкиль, Г.Д.Чхенкели. 2011. бюл. № 27.
28. Чхенкели В.А. Получение и использование в ветеринарии препаратов на основе дереворазрушаю-щих грибов из рода Trametes : метод. рекомендации / В.А.Чхенкели, В.Л.Тихонов, Н.А. Шкиль. Иркутск : РАСХН. ГНУ СРО; ИФ ГНУ ИЭВСиДВ РСХА, 2009. 32 с.
Поступило в редакцию 14 февраля 2012 г После переработки 3 декабря 2012 г
