CC BY
93
М. И. Леонтьева (м.н.с)1, А. В. Барков (к.вт.н., с.н.с.)2, А. В. Автономова (к.б.н., с.н.с.)1, Л. М. Краснопольская (д.б.н., зав.лаб.) 12, А. А. Новиков (асп., м.н.с.)2
Условия аэрации как фактор регуляции биосинтеза эндополисахаридов и образования пеллет в погруженной культуре Ganoderma lucidum
1 Научно-исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, лаборатория биологически активных соединений 119021, г. Москва, ул. Б. Пироговская, д. 11; тел. (499) 2552391, e-mail: [email protected] 2Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119331, г. Москва, Ленинский пр, 65; тел. (499) 2339589, e-mail: [email protected]
M. I. Leonteva1, A. V. Barkov 2, A. V. Avtonomova1, L. M. Krasnopolskaya1,2, A. A. Novikov2
The aeration conditions as regulating factor of endopolysaccharide biosynthesis and pellets formation in submerged culture of Ganoderma lucidum
1 Gauze Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences II, Bol'shaya Pirogovskaya Str, 119992 Moscow, Russia, ph. (499) 2552391, e-mail: [email protected]
2Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii pr, 119331, Moscow, Russia; ph. (499) 2339589, e-mail: [email protected]
Изучено влияние условий аэрации на выход биомассы Оапойетша 1ис1йиш, содержание в ней эндополисахаридов, на форму, размер и количество пеллет гриба в погруженной культуре. Показано, что более высокий уровень аэрации (1.5/1 объем/объем в мин) способствует большему выходу биомассы и образованию большего количества пеллет. Однако большее процентное содержание полисахаридов в мицелии было отмечено при самом низком уровне аэрации (0.5/1 объем/объем в мин). В погруженных условиях культура О. 1ис1йиш образует два типа пеллет: сферические, с диаметром до 4—7 мм, и веретенообразные, размер которых был от 0.5х3.0 до 1.0х5.0 мм.
Ключевые слова: аэрация; Оапойетша 1ис1йиш\ пеллеты; погруженное культивирование; полисахариды.
The effect of aeration on biomass yield, endopolysaccharide production and shape and quantity of pellets in the submerged culture of Ganoderma lucidum was studied. The results showed that higher level of aeration (1.5/1 V/V per min) promoted higher biomass yield and biggest quantity of pellets. However, highest percentage of endopolysaccharides was observed at the lowest aeration level (0.5/1 V/V per min). The submerged culture of G.lucidum produced two types of pellets: spherical pellets with diameter under 4—7 mm and spindle-shaped with size from 0.5X3.0 mm to 1.0X5.0 mm.
Key words: aeration; Ganoderma lucidum; pellets; submerged culture; polysaccharide.
В числе важных факторов, определяющих эффективность биотехнологических процессов, основанных на погруженном культивировании продуцентов, следует выделить такой параметр культивирования, как условия аэрации, складывающиеся из интенсивности пере-
Дата поступления 20.05.10
мешивания и подачи воздуха. Сложность создания оптимальных условий обеспечения кислородом мицелиальных грибов, в том числе базидиальных, состоит в том, что, во-первых, интенсивная работа мешалки может привести к нежелательному механическому поврежде-
нию гиф гриба и, во-вторых, рост погруженной культуры в виде пеллет, свойственный многим мицелиальным организмам, создает неравные условия массобмена.
Базидиальные грибы обладают рядом уникальных свойств, которые могут быть использованы человеком. Наиболее перспективно использование их биологически активных метаболитов для создания лекарственных средств и биологически активных добавок к пище. В качестве основы биотехнологий получения таких субстанций целесообразно использовать погруженное культивирование продуцентов. В отличие от твердофазного культивирования, погруженное позволяет в кратчайшие сроки и с наименьшими затратами накапливать целевой продукт, соблюдая условия культивирования, обеспечивающие стабильность химического состава получаемого материала. Ранее нами были выявлены способные к активному росту в погруженной культуре штаммы трутовика лакированного Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P. Karst., полисахариды которых проявляют противоопухолевые свойства. Из мицелия одного из штаммов выделен новый полисахарид — биологически активный ксиломаннан 1.
В работе 2 было описано развитие пеллет в погруженной культуре G.lucidum. При исследовании посевного материала было показано, что на 7 сутки культивирования первичные пеллеты имели сферическую форму с некоторым количеством выдающихся с поверхности длинных гиф. К 9 суткам выступающие гифы, продолжая расти, превращались в выступы, которые увеличивались в длину и толщину. На 13 сутки культивирования выступы начинали отделяться от первичной пеллеты, и к 17 суткам первичные пеллеты полностью разрушались. Вторичные пеллеты были похожи по форме на перо, но не плоские. На 20 сутки роста вторичные пеллеты увеличивались в размере и становились яйцеобразными. В этой работе пеллеты были поделены на фракции с помощью сита: фракция L — пеллеты, не проходящие сито с ячейками 2 мм, M — от 0.8 до 2 мм, S — пеллеты, прошедшие через сито с ячейками 0.8 мм. Биомасса фракции L увеличивалась до 13 суток (максимум 3.2 г/л), затем начинала снижаться практически до 0. Биомасса фракций M и S была низкой до 13 суток культивирования, затем начинала возрастать, составив на 19 сутки 6.5 и 1.8 г/л, соответственно. В отсутствие глюкозы пеллеты формировались медленно из-за медленного роста культу-
ры. Формирование пеллет в ферментационной культуре было в целом сходно с результатами в посевной культуре, однако, имелись некоторые различия. Так как засев происходил посевной культурой, то в ферментационную среду попадали яйцевидные пеллеты, которые тоже образовывали выступы, отделяющиеся к 7 суткам культивирования. Пеллеты третьей генерации становились округлыми еще на стадии возникновения в качестве выступов на материнских пеллетах. В процессе роста пеллеты увеличивались в размере, поэтому даже после разрушения материнских пеллет наблюдалось увеличение биомассы фракции Ь. Максимальное количество биомассы было зафиксировано на 10 сутки и составило 10.3 г/л.
Очевидно, что морфология пеллет может быть разнообразной и зависеть от ряда факторов. Так, в работе 3 изучали развитие пеллет G.lucidum в зависимости от состава среды. Было показано, что на среде с глюкозой, пептоном и дрожжевым экстрактом первичные пеллеты G.lucidum были свободными с длинными и тонкими гифами, располагающимися вокруг поверхности пеллеты. При добавлении в среду кукурузного масла пеллеты из сферических становились овальными, более темными внутри. На поверхности пеллеты абсорбировались маленькие капельки масла. К 7 суткам культивирования на среде без масла пел-леты начинали разрушаться. Начало разрушения пеллет совпадало по времени с началом снижения содержания биомассы. В то же время, на среде с маслом процесс лизиса пеллет начинался только на 11 сутки.
Целью настоящей работы было изучение влияния условий аэрации на выход биомассы G.lucidum, содержание в ней эндополисахаридов, на форму, размер и количество пеллет гриба в погруженной культуре.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служил ранее отобранный штамм G.lucidum 4 из коллекции лаборатории биосинтеза биологически активных соединений НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.
С целью поддержания культуру выращивали на картофельно-глюкозном агаре (КГА) при 25 оС в течение 7 сут. Культуру хранили на КГА при 2 оС, пересевая на свежеприготовленную среду один раз в год.
Погруженное культивирование осуществляли в биореакторе «Арріікоп biotecnology»
с рабочим объемом 5 л на средах, содержащих в качестве источников питания глюкозу, кукурузный экстракт, дигидрофосфат калия, нитрат натрия, сульфат магния. Биореактор с питательной средой стерилизовали при 1.2 атм. в течение 90 мин. Ферментации проводили последовательно в трех вариантах, представленных в табл. № 1.
Со 2 суток культивирования отслеживали накопление воздушно-сухой биомассы (весовым методом), значения рН культурального фильтрата (на ионометре ЭВ-74), и определяли количество пеллет в 1 мл культуральной жидкости методом прямого подсчета, визуально оценивая их размер с помощью миллиметровой бумаги, подложенной под чашку Петри. После завершения процесса культивирования мицелий отделяли от культуральной жидкости фильтрованием, промывали дистиллированной водой и сушили до постоянного веса, при 45 оС. Остаточная влажность воздушно-сухого мицелия не превышала 5%. Длительность процесса культивирования не превышала 4 сут.
Содержание полисахаридов в мицелии определяли фенол-сернокислотным методом 5.
Обсуждение
Культивирование проводили в биореакторе. Было показано, что более высокие показатели аэрации благоприятно сказываются на росте и развитии погруженной культуры ОЛиййиш (табл. 1). В качестве критерия роста и развития ОЛиййиш был использован выход воздушно-сухой биомассы. Количество воздушно-сухой биомассы зависело прямо пропорционально от режима аэрации в биореакторе. Наибольшее количество биомассы было получено при аэрации 1.5/1 объема, наименьшее — при 0.5/1 объема. Количество воздушно-сухой биомассы при исследованных ус-
ловиях аэрации увеличивалось за каждые сутки процесса культивирования примерно в два раза, за исключением изменения содержания биомассы на 4 сутки погруженного культивирования при наименьшей интенсивности подачи воздуха (табл. 2, 3). При режиме аэрации 0.5/1 объема удельная скорость роста была ниже, чем при других режимах.
Различные режимы аэрации влияли на содержание полисахаридов в мицелии ОЛиййиш. Было показано, что при более низком уровне аэрации содержание полисахаридов в процентном отношении было более высоким. Тем не менее, с учетом выхода воздушносухой биомассы, выход эндополисахаридов в пересчете на литр погруженной культуры был более высоким при наиболее интенсивной аэрации (табл.4).
Изучение образования пеллет в процессе погруженного культивирования в зависимости от условий аэрации показало следующие результаты. При всех исследованных режимах аэрации в погруженной культуре ОЛиййиш образовывались пеллеты двух морфологических типов: сферические, диаметр которых мог достигать 4—7 мм, и веретенообразные, размер которых варьировал в диапазоне от 0.5х3.0 до 1.0х5.0 мм. Кроме того, в культуральной среде присутствовали отдельные микроскопические фрагменты мицелия. Мелкие сферические пел-леты были однородны по своему объему. Крупные сферические пеллеты имели сложное строение и состояли из субъединиц, заканчивающихся длинными периферическими отростками. В отдельных случаях наблюдали мелкие пеллеты, сцепленные между собой по 2—4 шт. В количественном отношении в течение всего процесса погруженного культивирования при исследованных режимах аэрации преобладали пеллеты первого типа. Подсчет количества образовавшихся пеллет показал увеличение ко-
Таблица 1
Варианты параметров погруженного культивирования
Вариант Параметры погруженного культивирования
Температура; °С Перемешивание; об./мин Подача воздуха; объем/объем в мин
1 26 50 1.5/1
2 26 50 1/1
3 26 50 0.5/1
Накопление биомассы G.lucidum в процессе культивирования в зависимости от условий аэрации
Вариант культивирования Длительность погруженного культивирования Э.Ш^ит
2 сут; г/л 3 сут; г/л 4 сут; г/л
1 1.86 3.15 7.20
2 1.04 2.40 4.10
3 0.67 1.29 1.70
Таблица 3
Удельная скорость роста G.lucidum при разных режимах аэрации
Вариант культивирования Удельная скорость роста 0.1ио'Шит
со 2 на 3 сутки с 3 на 4 сутки
1 0.8 1.3
2 1.3 0.7
3 0.9 0.3
Таблица 4
Содержание полисахаридов в погруженном мицелии G.lucidum при разных режимах аэрации
Вариант культиви- рования Режим аэрации Содержание п/с в мицелии, % Выход п/с; г/л КЖ
1 1.5/1 11.9 0.86
2 1/1 12.9 0.53
3 0.5/1 18.1 0.31
Таблица 5
Количество пеллет G.lucidum в 1 мл культуральной среды при разных режимах аэрации
Вариант культиви- рования Количество пеллет, шт/мл
Крупные пеллеты Мелкие пеллеты
2 сут 3 сут 4 сут 2 сут 3 сут 4 сут
1 3 - - 45 482 957
2 1 1 1 35 232 195
3 1 1 2 13 39 47
личества мелких пеллет со 2-х по 4-е сутки процесса культивирования при всех исследованных режимах аэрации (табл. 5). При наибольшей интенсивности аэрации количество пеллет за двое суток увеличилось в 21.3 раза, при наименьшей интенсивности аэрации только в 3.6 раза. Изменение количества крупных пеллет в процессе погруженного культивирования зависело от режима подачи воздуха. Увеличению их числа способствовало снижение интенсивности аэрации. Количество крупных пеллет не менялось в процессе культивирования при подаче воздуха 1/1 объема, снижалось при наиболее интенсивном режиме аэрации и увеличивалось при наименее интенсивном режиме аэрации.
Анализ результатов накопления погруженной биомассы О. 1ис1йит, изменения количества пеллет, их морфологии и данных литературы позволяет предположить, что по мере роста мелких сферических пеллет происходит не только увеличение их размера, но и усложняется структура. Финальной стадией морфогенеза сферических пеллет является их дефрагментация и образование мелких веретенообразных пеллет. Однако, по всей вероятности, существует альтернативный путь формирования веретенообразных пеллет из микроскопических фрагментов мицелия, присутствующих в культуральной среде.
Таким образом, для успешного культивирования G.lucidum в погруженных условиях необходим высокий уровень аэрации. Результаты работы показали, что наибольшее количество воздушно-сухой биомассы образуется при подаче 1.5 объема воздуха на 1 объем среды. При этом режиме аэрации образуются большое количество мелких пеллет. Снижение уровня аэрации приводит к укрупнению образующихся пеллет и уменьшению выхода биомассы культуры G.lucidum.
Литература
1. Евсенко М. С., Шашков А. С., Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Усов А. И. Ganoderma lucidum (Curt.: Fr.) P.Karst.// Биохимия, 2009.- Т. 74.- № 5.- С. 657.
2. Wagner R., Mitchell D. A. Sassaki G. L., M. A. Lopes de Almeida Amazonas. // Journal of Biotechnology.- 2004.- V. 114.- P.153.
3. Huang H. C., Chtn C. I., Hung C. N., Liu Y. C. // Bioprocess Biosyst Eng.- 2009.- Vol. 32.-P.217.
4. Автономова А. В., Краснопольская Л. М., Максимов В. Н. // Микробиология.- 2006.- Т.75, №2.- С. 186.
5. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K., Rebers P. A. and Smith F. // Analytical Chemistry.-1956.- V. 28, № 3.- P. 350.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.
