CC BY
69
Е. В. Ворожцова, И. В. Духовлинов, Н. А. Климов, А. П. Козлов
УСИЛЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК, ЭКСПРЕССИРУЮЩЕЙ БЕЛОК GAG ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА,
ПРИ КО-ТРАНСФЕКЦИИ ПЛАЗМИДОЙ,
НЕСУЩЕЙ ГЕН ДЕФЕНСИНА-2в
Введение
В настоящее время эпидемия синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), заболевания, вызываемого вирусом иммунодефицита человека, выросла до масштаба пандемии. Задача создания профилактической вакцины против данного вируса до сих пор не решена.
Белок Gag вируса иммунодефицита человека синтезируется в виде белка-предшественника (р55), распадающегося при сборке вирусной частицы на ряд «зрелых» белков— р17, р24, р7/9, р6, р2, р1. В белках, кодируемых геном gag, содержатся участки с относительно консервативными последовательностями аминокислот, в которых также картировано большое число В- и Т-клеточных иммуногенных эпитопов, представляемых многими аллелями HLAI и HLAII человека и мыши [1—3]. Поэтому белок Gag рассматривается в качестве перспективного иммуногена для создания вакцины против ВИЧ.
ДНК-иммунизация заключается во введении в организм рекомбинантных плазмид-ных ДНК, обеспечивающих внутриклеточный синтез целевых белков-иммуногенов [4]. Синтез белков-иммуногенов при ДНК-иммунизации может продолжаться длительное время, до двух месяцев, индуцируя гуморальный и клеточный иммунный ответ. Однако для внедрения ДНК-иммунизации в практику здравоохранения необходимо повысить иммуногенность плазмидных ДНК, что должно привести как к снижению дозы ДНК, так и к уменьшению числа иммунизаций. Показано, что иммуногенность плазмидных ДНК можно повысить путем введения вместе с ДНК-иммуногеном хемакинов, усиливающих иммунный ответ [5-9]. К числу хемакинов, обладающих иммуномодулирующим действием, в частности, относится дефенсин-2в [5, 6, 8]. Представляется перспективным использовать в качестве иммуномодулятора для ДНК-вакцинации дефенсин-2в, например, путем введения в организм двух плазмидных ДНК, одна из которых экспрессирует целевой белок-иммуноген, а другая — дефенсин-2,3. В данной работе изучен иммунный ответ мышей на введение плазмиды, синтезирующей белок Gag ВИЧ-1 (рВМСgagA(Hum)), при совместном введении с плазмидой-помощницей, экспрессирующей дефенсин-2в (рВМСdef-2в).
Материалы и методы исследования
Плазмиды. Плазмида pBMC, созданная в Биомедицинском центре [10], содержит следующие регуляторные элементы: промотор предранних белков цитомегаловируса, сайт полиаденилирования и терминации транскрипции гормона роста быка и репликатор ColE1. На рис. 1 представлена последовательность нуклеотидов синтетическеого гена gagА(Hum).
© Е. В. Ворожцова, И. В. Духовлинов, Н. А. Климов, А. П. Козлов, 2010
СТСОДОЛТ000С0ССС0С0ССЛ0С0Т0СТ0Л0С00С00СЛЛ0СТ00ЛС0С 50 СТ000Л0ЛЛ0ЛТСС0ССТ0С0СССС00С00СЛЛ0ЛЛ0ЛЛ0ТЛСС0СЛТСЛ 100 Л0СЛССТ00Т0Т000ССЛ0СС0С0Л0СТ00Л0С0СТТС0СССТ0ЛЛСССС 150 Л0ССТ0СТ00Л0ЛССЛ0С0Л000СТ0ССЛ0СЛ0ЛТССТ00Л0СЛ0СТ0СЛ 200 0СССЛСССТ0ЛЛ0ЛСС00СЛ0С0Л00Л00Т0ЛЛ0Л0ССТ0ТЛСЛЛСЛСС0 250 Т00ССЛСССТ0ТЛСТ0С0Т0СЛССЛ0С0СЛТС0Л0ЛТСЛЛ00ЛСЛССЛЛ0 300 0Л00ССТТ00ЛСЛЛ0ЛТС0Л00Л0ЛТССЛ0ЛЛС0Л0ЛЛСЛЛ0СЛ0ЛЛ0ЛС 350 ССЛ0СЛ00ССЛСС00СЛСС00СЛ0СЛ0СЛ0СЛЛ00ТСЛ0ТСЛ0ЛЛСТЛСС 400 ССЛТС0Т0СЛ0ЛЛС0СССЛ000ССЛ0ЛТ0ЛСССЛССЛ0ТССЛТ0Л0СССС 450 С0СЛСССТ0ЛЛС0ССТ000Т0ЛЛ00Т0ЛТС0Л00Л0ЛЛ00ССТТСЛ0ССС 500 С0Л00Т0ЛТССССЛТ0ТТСЛ0С0ССТТ0Л0С0Л000С0ССЛССССССЛ00 550 ЛСЛ0СЛЛСЛТ0ЛТ0СТ0ЛЛСЛТС0Т000С00ССЛССЛ00СС0ССЛТ0СЛ0 600 ЛТ0ТТ0ЛЛ00ЛСЛССЛТСЛЛС0Л00Л00СС0СС0Л0Т000ЛСС0ССТ0СЛ 650 СССС0СССЛ00СС00ССССТТССССССС00ССЛ0ЛТ0С0С0Л0СССС0С0 700 0СЛ0Т0ЛСЛТС0СС00СЛССЛССЛ0ТЛСССТ0СЛ00Л0СЛ0ЛТС00СТ00 750 ЛТ0ЛССЛ0СЛЛСССССССЛТСССС0Т000С0ЛСЛТСТЛСЛЛ0С0СТ00ЛТ 800 СЛТССТ000ССТ0ЛЛСЛЛ0ЛТС0Т0С0СЛТ0ТЛСЛ0СССС0Т0Л0СЛТСС 850 Т00ЛСЛТСС0ССЛ000ССССЛЛ00Л0СССТТСС0С0ЛСТЛС0Т00ЛСС0С 900 ТТСТТСЛЛ0ЛСССТ0С0С0СС0Л0СЛ00ССЛСССЛ00Л00Т0ЛЛ0ЛЛСТ0 950 0ЛТ0ЛСС0Л0ЛСССТ0СТ00ТССЛ0ЛЛС0СС0ЛСССС0ЛСТ0СЛЛ00ССЛ 1000
ТССТ0С0С0СССТ000СССС00С0ССЛСССТ00Л00Л0ЛТ0ЛТ0ЛСС0СС 1050 Т0ССЛ000С0Т000С00СССС00ССЛСЛЛ00ССС0С0Т0ТТ00СС0Л00С 1100 СЛТ 0Л0Т СЛ00Т0СЛ0ЛЛС0 ССЛЛСЛТ СЛТ 0ЛТ0СЛ0ЛЛ0Л0Т ЛЛСТТСС 1150
0С00ССССЛЛ0С0СЛТСЛЛ0Т0СТТСЛЛСТ0С00СЛЛ00Л000ССЛССТ0 1200 0ССС0СЛЛСТ0СС0С0СССССС0СЛЛ0ЛЛ000СТ0СТ00ЛЛ0Т0С00СЛЛ 1250 00Л000ССЛССЛ0ЛТ0ЛЛ0ЛЛСТ0СЛСС0Л0С0ССЛ00ССЛЛСТТССТ00 1300 0СС0СЛТСТ00СССТССЛ0СЛЛ000СС0СССС00СЛЛСТТСССССЛ0Л0С 1350 С0СССС0Л0СССЛ0С0СССССССС0СС0Л00ЛСТТС00СС0С00С0Л00Л 1400 0ЛТСЛСССССССССТ0ЛЛ0СЛ00Л0СЛ0ЛЛ00ЛСС0С0Л0СЛ0СЛССССС 1450 ССЛ0СЛТСТСССТ0ЛЛ0Л0ССТ0ТТС00СЛЛС0ЛССССТТ0Л0ССЛ0ТЛЛ 1500 оддттс 1506
Рис. 1. Последовательность нуклеотидов синтетическеого гена дадА(Нит)
Добавленные сайты для рестрицирующих эндонуклеаз ЕооЯ! (GAATTC) и ХЬо! (СТССЛО) выделены жирным шрифтом
Синтез гуманизированного гена белка Gag. Ген, кодирующий белок Gag вируса иммунодефицита человека 1-го типа субтипа А (ВИЧ-1(А)), был получен методом химического синтеза по последовательности, приведенной на рис. 1.
Выделение и стимуляция перитонеальных макрофагов мыши. Перитонеальные макрофаги мышей были получены путем промывания брюшной полости животных 0,34 М стерильным раствором сахарозы (по 4 мл на мышь). Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержавшей 10% эмбриональной сыворотки теленка, и инкубировали при 37°С и 5% СО2 в течение суток. Кроме того, клетки стимулировали добавлением липополисахарида из Esaherichia coli (LPS) до конечной концентрации 10 нг/мл с последующей инкубацией при 37°С и 5% СО2 в течение суток.
Получение РНК и кДНК. Выделение РНК из стимулированных макрофагов осуществляли, используя набор TRI Reagent (Sigma, USA), по методике изготовителя. Синтез кДНК проводили с помощью набора Revert Aid® First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas).
Получение кДНК дефенсина-2р. Амплификацию кДНК дефенсина-2,3 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл буфера: 10 мМ Трис-HCl рН 8,3, 1,25 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 200 мкМ каждого из дНТФ, 20 пМ каждого из праймеров, 200 нг ДНК и 1 ед. полимеразы Pfu (Fermentas, Литва). Использовали праймеры: def-For 5/-TTTCTCGAGTTCGCAACAGGGGTTCTTC-3/ и def-Rev 5/-ACCATGGAATTCGACCACTGCCACACC-3/. В последовательности праймеров были введены сайты для рестрицирующих эндонуклеаз EcoRI (GAATTC) и XhoI (CTCGAG), по которым затем осуществляли клонирование в экспрессионный вектор pBMC. Отсутствие мутаций и правильность сборки проверяли секвенированием по Сэн-геру.
Бактериальные штаммы. Для проведения генно-инженерных работ использовали клетки E. coli DH10B/R (Gibko BRL, США) с генотипом F-mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) ^>80dlacZAM 15 AlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 A(ara,leu)769 galU galKA-rpsL nupG.
Эукариотические клеточные линии. Изучение экспрессии белков проводили в клетках эпителия почки эмбриона человека 293Т.
Иммуноблоттинг. После электрофореза белков в ПААГ [12] перенос проводили по методу Вестерн-блота [13]. Для обнаружения рекомбинантного белка дефенсин-2ß-FLAG блоты инкубировали с антисывороткой к пептиду FLAG (Sigma, США), для обнаружения белка Gag инкубацию проводили сывороткой ВИЧ-инфицированного пациента, разведенной в 200 раз. Для обнаружения рекомбинантного белка, содержащего петид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (FLAG), использовали антитела производства фирмы «Сигма». В качестве вторых антител использовали белок А, ко-ньюгированный с пероксидазой хрена ^ибЭнзим, Россия). После промывки блота в ФСБ-твин с 0,1%-ным обезжиренным молоком, его помещали в раствор субстрата (3,3/-диаминобензидин, 0,06% Н2О2) на 5 мин. Реакцию останавливали, промывая блот водой. Проявленный блот высушивали и сканировали.
Трансформация клеток. Клетки линии 293Т и клетки E. œli трансформировали с помощью методов, описанных в руководстве из работы [13].
Иммунизация лабораторных животных. Самок мышей линии BALB/c 912-недельного возраста иммунизировали введением в четырехглавую мышцу бедра 100 мкг плазмидной ДНК рВМСgagA в 100 мкл физиологического раствора. Для иммунизации двумя плазмидными ДНК использовали 100 мкг рВМСgagA и 100 мкг рВМCdef-2ß в общем объеме 100 мкл. Раствор двух плазмидных ДНК вводили в одном шприце. Повторную иммунизацию проводили на 4-й неделе. Титр антител анализировали на 2-й и 6-й неделях. В опыте по обнаружению белка р24 в сыворотке крови
иммунизированных мышей плазмидные ДНК вводились трехкратно — на 1, 4 и 8-й неделях.
Иммуноферментный анализ. Использовали диагностический набор «ВектоВИЧ-1 антиген р24» (Вектор-Бест, Россия), предназначенный для определения концентрации белка р24 (одного из конечных продуктов созревания белка р55 Gag) в сыворотке крови человека. Калибровочную кривую строили по стандартам р24, имеющимся в наборе, концентрацию белка р55 рассчитывали, исходя из соотношения молекулярных весов белков р55 и р24, равного 2,29:1.
Статистический анализ результатов иммунизаций. При измерении титра антител и концентраций белка оценивали стандартное отклонение по выборке. Расчет величины стандартного отклонения осуществляли по формуле
s _ /£(*, - х)2
n — 1
где n — объем выборки, X — среднее арифметическое число [14].
Результаты исследования и их обсуждение
Молекулярный дизайн синтетического гена gagA(Hum) и получение экс-прессионной плазмиды pBMCgagA(Hum). Дизайн синтетического гена, кодирующего белок Gag ВИЧ-1 субтипа А, произвели, применяя кодоны с максимально высоким содержанием G и C, используемых в интенсивно экспрессируемых генах человека и млекопитающих, поскольку применение кодонов в природных генах ВИЧ-1 не является оптимальным для достижения высокого уровня синтеза белков [15]. Последовательность синтетического гена gag(A)Hum, основанная на последовательности аминокислот, полученной в результате секвенирования геномов вирусов, циркулирующих в России и странах Ближнего зарубежья [16], представлена на рис. 1. По сравнению с природным геном, в гене gagА(Hum) были произведены замены 329 А и Т на G и C с получением синонимических G,C-богатых кодонов. Ген gagА(Hum) был по сайтам рестрикции XhoI и EcoRI вставлен в плазмиду рВМС с получением экспрессионной плазмиды рВМС-gagA(Hum) (рис. 2).
Клонирование кДНК дефенсина-2в мыши. Для получения кДНК де-фенсина-2в выделили РНК из стимулированных перитонеальных макрофагов мыши, на которой была поставлена реакция обратной транскрипции. Далее на матрице полученной кДНК амплифицировали последовательность дефенсина-2,3. Секвенирование показало, что полученная последовательность кДНК идентична последовательности дефенсина-2в мыши, имеющейся в базе данных GanBank (рис.3). Далее кДНК де-фенсина-2в была клонирована по сайтам рестрикции XhoI и EcoRI в вектор рВМС (см. рис. 2). Для детекции синтеза дефенсина-2в с помощью иммуноблота был синтезирован искусственный ген, кодирующий рекомбинантный белок дефенсин-2/3-FLAG. FLAG представляет собой иммуногенный пептид Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, с которым связываются специфические моноклональные антитела [11]. Для создания такого гена в праймер def-Rev была введена последовательность из 24 нуклеотидов, кодирующая FLAG. Амплифицированную с использованием данного удлиненного праймера последовательность клонировали по сайтам EcoRI и XhoI в вектор рВМС.
Обнаружение рекомбинантных белков Gag и дефенсина-2в в лизатах клеток 293, трансформированных плазмидными ДНК pBMCgagA(Hum) и pBMCdef-2ft. При электрофорезе белков лизатов клеток 293Т, трансформированных
Рис. 2. Карта плазмиды pBMCdef-2,3-FLAG (А) и карта плазмиды pBMCgagA(Hum) (Б )
Ampr — ген устойчивости к ампициллину; prCMV— промотор предранних белков цитомегалоивируса; BGHpA — сайт полиаденили-рования и терминации транскрипции; ori— репликатор; BbvII, EcoRI,
XhoI — сайты узнавания рестриктаз; GagA(Hum) — последовательность гена gagA(Hum); Def-2,0 — последовательность, кодирующая дефенсин-2в мыши; FLAG — последовательность, кодирующая пептид FLAG
CTCGAGATGA GGACTCTCTG CTCTCTGCTG CTGATCTGCT GCCTGCTGTT 50 CTCCTACACC ACCCCCGCCG TGGGCAGCTT AAAGAGCATT GGCTACGAGG 100 CCGAGCTGGA CCACTGCCAC ACCAACGGCG GCTACTGCGT GAGGGCCATT 150 TGCCCCCCCT CCGCCAGGCG CCCCGGCAGC TGCTTCCCAG AGAAGAACCC 200 CTGTTGCAAG TACATGAAAT GAGAATTC 222
Рис. 3. Последовательность нуклеотидов кДНК дефенси-на-2в
Добавленные сайты для рестрицирующих эндонуклеаз EcoRI (GAATTC) и XhoI (CTCGAG) выделены жирным шрифтом
плазмидной ДНК pBMCgagA(Hum), обнаружена белковая фракция с молекулярным весом 55 кДа, связывающаяся в иммуноблоте с сывороткой крови ВИЧ-инфицированного пациента и отсутствующая в лизатах клеток, трансформированных плазмидной ДНК рВМС, что указывает на синтез в трансформированных pBMCgagA(Hum), клетках белка Gag р55 (рис. 4). В лизатах клеток 293Т, трансформированных плазмидной ДНК pBMCdef-2e, обнаружена белковая фракция с молекулярным весом 4,6 кДа, связывающаяся с антителами к пептиду FLAG (рис. 5), что указывает на синтез рекомбинантного белка дефенсин-2/3-FLAG. Для дальнейших экспериментов участок, кодирующий пептид FLAG, был удален путем амплификации кДНК дефенсина-2в с праймерами def-For и def-Rev и нового клонирования полученного продукта в вектор рВМС.
Обнаружение рекомбинантного белка Gag в сыворотках крови мышей после внутримышечного введения плазмидной ДНК рВМСgagA(Hum). Концентрация белка Gag в сыворотках крови мышей, трехкратно иммунизированных плазмидой pBMCgagA(Hum), определялась путем измерения концентрации антигена р24 с помощью иммуноферментного анализа (таблица). Максимальная концентрация антигена р24 в сыворотках крови мышей наступала на 9-й неделе и оказалась равной 4 пг р24/мл, что в перерасчете на белок р55 составило 9,16 пг/мл.
Рис. 4. Экспрессия слитого белка дефенсин-2,3-FLAG в трансформированных клетках 293Т:
1 — белковый маркер (Sigma, США); 2 — лизат клеток, трансформированных плазмидой pBMC; 3 — лизат клеток, трансформированных плазмидой pBMCdef-FLAG
Рис. 5. Экспрессия белка Gag в трансформированных клетках 293Т:
1 — клетки, трансформированные плазмидой pBMCgag(Hum) разведение 1:25;
2 — клетки, трансформированные плазмидой pBMCgag(Hum) разведение 1:5; 3 —
клетки, трансформированные плазмидой pBMCgag(Hum) разведение 1:1; 4 — белковый маркер (Sigma)
Накопление экстраклеточного белка р55 Gag в сыворотках крови мышей BALB/c
Концентрация белка Gag в сыворотках крови иммунизированных мышей
Срок после первого введения плазмидной ДНК, дни Число введений плазмидной ДНК до забора крови Концентрация антигена р24 в сыворотке крови, пг/мл Концентрация белка Gag в сыворотке крови в пересчете на белок р55, пг/мл
42 2 2 ±0,5 4,58 ± 1,45
63 3 4 ±1,2 9,16 ±2,75
70 3 2 ±0,6 4,58 ± 1,37
Примечание. Плазмидную ДНК рВМСgagA(Hum) в дозе 100 мкг/мышь вводили внутримышечно в 1, 28 и 56-й дни.
Уровень гуморального иммунного ответа, возникающий у мышей после иммунизации плазмидой pBMCgagA или после совместной иммунизации плазмидами pBMCgagА и pBMCdef-2в^ У животных, иммунизированных плазмидой pBMCgagA, на 6-й неделе титр антител к р24 составил всего 1:10 (рис. 6). Однако совместная иммунизация двумя плазмидными ДНК, pBMCgagA и pBMCdef-2в вызывает формирование более сильного гуморального иммунного ответа, чем иммунизация только плазмидой pBMCgagA. Так, после двукратной иммунизации двумя плазмида-
0
1 I-
о
2-я нед. 6-я нед. 2-я нед. 6-я нед. 2-я нед. 6-я нед. дадА дадА+с!еГ контроль
Рис. 6. Уровень гуморального иммунного ответа у мышей после иммунизации плазмидой pBMCGagA и совместной иммунизации плазмидами pBMCGagА и pBMCdef ДНК-иммунизацию производили в 1-ю и 4-ю недели
ми на 6-й неделе титр антител к белку р24 превысил 1:1000 (см. рис. 6). Таким образом, совместная иммунизация двумя экспрессионными плазмидными ДНК способствует увеличению титра антител к белку р24 в сыворотке крови лабораторных животных в 100 раз.
Заключение
Внутримышечное введение мышам плазмиды, экспрессирующей белок Gag, приводит к появлению данного белка в сыворотке крови. Белок Gag не имеет сигнального пептида, вследствие чего он неспособен к секреции из эукариотических клеток [17]. Однако известно, что Gag участвует во взаимодействии незрелой вирусной частицы с клеточной мембраной и направляет выход вирусных частиц в экстраклеточное пространство с помощью процесса, называемого «выпочковыванием» (budding) [17-19]. Возможно, что белок Gag, синтезируемый трансформированными клетками, также может самостоятельно выходить из них с помощью подобного неканонического процесса. В таком случае большая часть белка Gag будет находиться в экстраклеточном пространстве и в крови, индуцируя В-клеточный (гуморальный) иммунный ответ против данного вирусного белка.
Значительное увеличение титров антител к белку Gag при совместном внутримышечном введении двух плазмидных ДНК, экспрессирующих Gag и дефенсин-2в, может быть объяснено следующим образом.
Известно, что в-дефенсины являются хемоаттрактантами для клеток, экспрессирующих рецептор CCR6, включая незрелые дендритные клетки и CD8+ Т-лимфоциты [5, 8]. Незрелые дендритные клетки способны эффективно захватывать антиген, после
чего в них начинается активное образование комплексов пептид-MHCII, которые образуются в значительном количестве благодаря наличию большего числа МНС11-богатых компартментов (MIICs). При последующем созревании дендритных клеток MIICs превращаются в нелизосомальные везикулы, в которых и происходит транспортировка комплексов MHCII-пептид к поверхности клетки. В результате значительно повышается эффективность презентации иммуногенных эпитопов чужеродных белков [5]. При совместной иммунизации двумя плазмидными ДНК, возможно, дефенсин-2в вызывает аттрактацию иммунокомпетентных клеток, главным образом незрелых дендритных клеток, к месту инъекции, в котором происходит также синтез белка Gag. В результате эффективная презентация иммуногенных эпитопов белка Gag дендритными клетками вызывает усиление продукции антител к данному белку.
Подобный эффект усиления действия ДНК-иммуногена можно использовать для усиления эффективности ДНК-вакцин, обеспечивающих защиту человека и животных от многих патогенов. По-видимому, иммунизацию животного плазмидной ДНК, экспрессирующей целевой белок, совместно с плазмидой, экспрессирующей дефенсин-2в, можно использовать для получения иммунной сыворотки и поликлональных антител к любому экстраклеточному белку без его предварительной очистки, если выделена и помещена в экспрессионную плазмиду кДНК данного белка. Такой способ может быть полезен, например, для получения антител к белкам, содержащимся в природных источниках в очень небольших концентрациях, в том числе для получения антител к гипотетическим белкам, экспрессию которых при различных патологических состояниях можно предположить на основании транскриптомного анализа.
Литература
1. Betts M. R., Yusim K., Koup R. A. Optimal antigens for HIV vaccines based on CD8+T-res-ponse, protein length, and sequence variability // DNA and Cell Biology. 2002. Vol. 21, N 9. P. 665670.
2. Appay V., Papagno L., Spino CA. et al. Dynamics of T-cell responces in HIV infection // Journal of Immunology. 2002. Vol. 168, N 7. P. 3660-3666.
3. Kaul R., Rowland-Jones S.L., Kimani J. et al. New insights into HIV-1 specific cytotoxic T-lymphocyte responses in exposed, persistently seronegative Kenyan sex workers // Immunology Letters. 2001. Vol. 79, N1-2. P. 3-13.
4. Curunathan S., Chang-Yu Wu, Freilag B. L. et al. DNA vaccines: a key for inducing longterm cellular immunity // Current opinion in immunology. 2000. Vol. 12. P. 442-447.
5. Sozzani S., Allavena P., Vecchi A. et al. Chemokines and dendritic cell traffic // Journal of Clinical Immunology. 2000. Vol. 20, N 3. P. 151-160
6. De Smet K., Contreras R. Human antimicrobial peptides: defensins, cathelicidins and histatins // Biotechnology Letters. 2005. Vol. 27, N18. P. 1337-1347.
7. Chang S. Y., Lee K. C., Ko S. Y. et al. Enhanced efficacy of DNA vaccination against Her-2/neu tumor antigen by genetic adjuvants // International Journal of Cancer. 2004. Vol. 111, N 1. P. 86-95.
8. Biragyn A., Surenhu M., Yang D. et al. Mediators of innate immunity that target immature, but not mature, dendritic cells induce antitumor immunity when genetically fused with nonim-munogenic tumor antigens. // Journal of Immunology. 2001. Vol. 167, N 11. P. 6644-6653.
9. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity // Nature Reviews of Immunology. 2003. N 9. P. 710-720.
10. Мурашев Б. В., Мурашева И. В., Романович А. Э. и др. Создание и изучение иммунологических свойств ДНК-вакцины на основе гена env ВИЧ-1 // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы 2000. Т. 4, №2. С. 29-36.
11. Chubet R. G., Brizzard B. L. Vectors for expression and secretion of FLAG epitope-tagged
proteins in mammalian cells // Biotachniques. 1996. Vol. 20, N1. P. 136-141.
12. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-
phage T4 // Nature. 1970. Vol. 227, N5259. P. 680-685.
13. Sambrook J., Russell D. W. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbour Laboratoty Press, 2001.
14. Лакин Г. Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1990. 352 с.
15. Haas J., Park E., Seed B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope
glycoprotein // Curr. Biol. 1996. 6. P. 315-324.
16. Машарский А. М., Еремин В. Ф., Климов Н. А., Козлов А. П. Клонирование и анализ полноразмерного генома вариантов ВИЧ-1, доминирующих среди иньекционных наркоманов стран бывшего СССР // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы. 2002. Т. 6, №1. С. 12-20.
17. Kuiken C., Foley B., Freed E. et al. HIV sequence compendium. 2002. (URL: http:// hiv-veb.lanl.gov).
18. Ono A., Orenstein J. M., Freed E. O. Role of the Gag matrix domain in targeting human immunodeficiency virus type 1 assembly // Journal of Virology. 2000. Vol. 74, N6. P. 2855-2866.
19. Bukrinskaya A. G. HIV-1 assembly and maturation // Archiv of Virology. 2004. Vol. 149, N6. Р. 1067-1082.
Статья поступила в редакцию 28 июня 2010 г.
